星蔞承氣湯對急性腦缺血模型大鼠行為學(xué)及CREB-BDNF通路的影響

劉 悅，于 博，許 潔，佟 陽

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院腦病科，遼寧 沈陽 110034)

腦血管疾病發(fā)病率近年來有逐年上升的趨勢，其中約有75%的腦血管事件屬于缺血性腦卒中，大多數(shù)患者遺留明顯肢體、語言以及認(rèn)知方面的障礙，嚴(yán)重影響患者重返社會[1-3]。雖然現(xiàn)代康復(fù)訓(xùn)練可在一定程度上改善患者的功能障礙，但效果仍差強(qiáng)人意。中醫(yī)在腦血管疾病中的作用有目共睹，缺血性腦卒中屬于中醫(yī)“中風(fēng)”“偏枯”等范疇，毒邪是風(fēng)、火、痰、瘀各種因素量變到質(zhì)變的結(jié)果，隨著研究深入“毒損腦絡(luò)”病機(jī)理論被逐漸認(rèn)可，大承氣湯是《傷寒論》中化痰通腑的經(jīng)典方，該方被大量用于治療缺血性腦卒中[4]，但其作用機(jī)制目前尚無統(tǒng)一定論，本團(tuán)隊利用中腦動脈栓塞(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型大鼠模擬人體急性腦卒中病理，探討星蔞承氣湯的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：本研究選用上海斯萊克實驗動物公司的實驗動物為SPF級健康成年體重為200～250 g的SPF雌性大鼠45只，喂養(yǎng)于實驗動物中心SPF級動物房。動物房處于恒溫恒濕環(huán)境，恒定溫度為22 ℃，濕度為50%，光照黑暗各12 h交替，動物的處置符合實驗動物倫理學(xué)原則。

1.1.2 儀器及試劑：PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀DNA測序列分析儀、BIO RAD凝膠成像儀、韓式穴位神經(jīng)刺激儀、RM2235切片機(jī)、VE-180垂直電泳槽、PMSF、電泳膠配液、BCA蛋白定量試劑盒、超敏ECL化學(xué)發(fā)光液，β-actin、環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(Camp-response element binding protein，CREB)抗體、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)抗體。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型的建立：模型組及中藥組大鼠參照改良的Longa等[5]線栓法進(jìn)行MCAO模型的制備，具體過程如下：先將大鼠進(jìn)行稱重，根據(jù)每只大鼠的不同體重注射一定比例(0.3 ml/kg)10%的水合氯醛，待大鼠充分麻醉后將大鼠固定于手術(shù)臺面上，充分清理大鼠頸部皮膚后做一豎型切口，隨后用完鉗緩慢剝離出左側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈及頸外動脈，用尼龍繩于頸總動脈、頸外動脈近心端結(jié)扎，并用動物血管夾夾閉頸內(nèi)動脈，隨后于頸總動脈處做一切口，將線栓緩慢插入切口并推送至頸內(nèi)動脈，直至出現(xiàn)抵觸感后停止推送。將線栓固定于頸總動脈后縫合傷口，常規(guī)消毒?？瞻捉M大鼠僅接受麻醉、剝離血管后縫合皮膚及常規(guī)消毒。

1.2.2 分組與給藥：45只SPF大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組及中藥組，每組各15只?？瞻捉M及模型組大鼠不進(jìn)行任何干預(yù)手段，中藥組大鼠在造模第2天開始接受星蔞承氣湯灌胃治療。方劑：全瓜蔞、膽南星各12 g，生大黃9 g，芒硝6 g，水煎，劑量按照按人/鼠公斤體重的等效劑量計算，1次/d，連續(xù)干預(yù)7 d。模型組及空白組予等體積生理鹽水灌胃。

1.2.3 行為學(xué)變化：采用改良神經(jīng)功能缺損程度評分(Modified Neurological Severity Scores,mNSS)對各組大鼠的神經(jīng)行為學(xué)進(jìn)行評估，該量表主要從運動、感覺、反射、平衡4個環(huán)節(jié)進(jìn)行測評；總分18分，分?jǐn)?shù)越高提示神經(jīng)功能缺失越嚴(yán)重。

1.2.4 腦梗死體積：每組隨機(jī)抓取3只大鼠，麻醉后脫頸處死，快速取腦后將腦組織置于-80 °C冰箱冰凍20 min，隨后取出腦組織冠狀面平均切成5等份，采用2,3,5-氯化三苯四唑液體對腦組織進(jìn)行均勻染色，腦梗死體積區(qū)域顯示蒼白色，未梗死區(qū)域顯示紅色。隨后將染色后的腦組織取出后排列于器皿內(nèi)，用高清數(shù)碼相機(jī)拍攝后輸入計算機(jī)，采用相關(guān)圖像處理系統(tǒng)計算腦梗死體積。

1.2.5 CREB-BDNF通路標(biāo)志性蛋白水平的測定：采用免疫組化法對BDNF的蛋白表達(dá)進(jìn)行測定，每組隨機(jī)抓取3只大鼠，用事先配制好的多聚甲醛從大鼠的心耳處進(jìn)行灌流，隨后取出腦梗死組織，進(jìn)行組織修剪切塊，隨后將修切的腦組織進(jìn)行梯度脫水，將充分脫水的腦組織浸蠟包埋，隨后進(jìn)行切片、撈片、烘片，將組織薄片置于防脫載玻片上，進(jìn)行抗原修復(fù)、染色，將按一定比例稀釋后的一滴滴加到切片上隨后用PBS溶液漂洗，再加入羊抗鼠/兔IgG聚合物試劑，孵育10 min后再次用PBS溶液漂洗，將DAB顯色液滴入，并在顯微鏡下觀察顯色，再用中性樹膠進(jìn)行封片處理，隨后光鏡下進(jìn)行讀片，對陽性目標(biāo)光密度進(jìn)行測量。

1.2.6 CREB-BDNF mRNA水平的測定：在腦組織樣品加入Buffer TBP(與腦組織按照1∶2比例加入)后混勻后靜置1 min，將樣本充分離心后摒棄上清液，再次加入等量Buffer TBP后置于4 ℃，2000 r/min下離心10 min取白色沉淀物。將事先混合好的Buffer digestion與Proteinase 濃液再次加入至檢測樣本內(nèi)，充分震蕩后進(jìn)行水浴(56 ℃恒溫)5 min，加入Buffer PR后混勻，-20 ℃下靜置15 min后室溫、3000 r/min條件下離心10 min，吸取上清液，將異丙醇濃液加入上清液內(nèi)充分混勻，室溫下靜置5 min，室溫、3000 r/min條件下離心10 min，摒棄上清液后加入75%乙醇，充分混勻，室溫下靜置5 min，室溫、3000 r/min條件下離心10 min，再次摒棄上清液。室溫下待乙醇充分揮發(fā)后加入TE Buffer提取DNA。嚴(yán)格按照聚合酶鏈反應(yīng)條件，即變性溫度、變性時間、退火溫度、退火時間、延伸溫度、延伸時間、循環(huán)次數(shù)、循環(huán)時間進(jìn)行實驗操作。GAPDH引物上游序列5’-CAACGGGAAAC-CCATCACCA-3’;下游序列5’-ACGCCAGTAGACTC-CACGACAT-3’。CREB引物上游序列5’-CAACCGGCAC-CCATCGAAC-3’;下游序列5’-ACGCCATCGAGCACTC-CACATCCT-3’。BDNF引物上游序列5’-CAACCCGAAAC-CCATCAGAA-3’;下游序列5’-ACGCCAGTCAGCACTC-CACGAGCT-3’。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 20.0進(jìn)行研究數(shù)據(jù)的分析。所得計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來描述，組間比較采用兩樣本t檢驗或兩樣本秩和檢驗；組內(nèi)比較采用配對t檢驗或配對秩和檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計意義。

2 結(jié) 果

2.1 三組大鼠行為能力評分比較 造模后，模型組及中藥組大鼠活動能力明顯減弱；中藥組在治療后mNSS評分降低，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 三組大鼠mNSS評分比較(分)

2.2 三組大鼠腦梗死體積比較 造模后模型組及中藥組大鼠出現(xiàn)明顯腦梗死區(qū)域，中藥組在治療后腦梗死區(qū)域縮小，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1、2。

圖1 三組大鼠腦片TTC染色結(jié)果

圖2 兩組大鼠腦梗死體積比較

2.3 三組大鼠腦組織CREB、BDNF蛋白相對表達(dá)比較 模型組及中藥組大鼠腦組織CREB、BDNF蛋白相對表達(dá)水平明顯下調(diào)。中藥組在治療后CREB、BDNF蛋白相對表達(dá)有所提升，明顯高于模型組，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表2(圖3)。

表2 三組大鼠腦組織CREB、BDNF/內(nèi)參IOD比較

圖3 三組大鼠腦組織CREB、BDNF蛋白表達(dá)

2.4 三組大鼠腦組織CREB、BDNF mRNA表達(dá)比較 造模后模型組及中藥組大鼠腦組織CREB、BDNF mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)。中藥組在治療后CREB、BDNF mRNA有所提升，且高于模型組(P<0.05)，見表3(圖4)。

表3 三組大鼠治療后CREB、BDNF mRNA/內(nèi)參比較

圖4 三組大鼠腦組織CREB、BDNF mRNA表達(dá)

3 討 論

缺血性腦卒中是臨床腦血管疾病的主要發(fā)病類型，其中大腦中動脈的梗死最為多見。由于大鼠的腦血管解剖結(jié)構(gòu)及生理病理機(jī)制與人類極為相近，且對手術(shù)的耐受較為理想，故本研究選用SD大鼠制備大腦中動脈缺血動物模型以模擬人類缺血性腦卒中。缺血性腦卒中屬于中醫(yī)“中風(fēng)”“偏枯”等范疇，是由多種因素共同作用的復(fù)雜病理過程，其中風(fēng)、火、痰、瘀是主要因素，毒邪是風(fēng)、火、痰、瘀各種因素量變到質(zhì)變的結(jié)果，故現(xiàn)代醫(yī)家[6-10]提出了“毒損腦絡(luò)”的病機(jī)理論。認(rèn)為急性中風(fēng)患者體內(nèi)存在諸多內(nèi)毒，包括熱毒、瘀毒、戾毒，諸多內(nèi)毒相互作用破壞腦絡(luò)，損害腦髓，導(dǎo)致腦組織氣血滲、透灌流異常，神機(jī)失用，經(jīng)絡(luò)不養(yǎng)，故導(dǎo)致半身偏枯失用。臨床長期研究發(fā)現(xiàn)，痰熱腑實證是中風(fēng)初始階段的重要證型，多數(shù)患者存在大便秘結(jié)、舌苔黃膩、脈弦滑等征象，此類征象不但是熱證、痰證、腑實證的共同臨床表現(xiàn)，亦是中風(fēng)疾病在此階段的核心病機(jī)，風(fēng)痰瘀火之毒遏制脈絡(luò)，氣機(jī)升降失司，腑氣不通，神明受擾，形體敗壞。因此化痰通腑，祛邪解毒是缺血性腦卒中急性期的治療關(guān)鍵點[11-12]。

大承氣湯是《傷寒論》中化痰通腑的經(jīng)典方，星蔞承氣湯是由大承氣湯化裁而來，由王永炎教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗總結(jié)而來。本方由全瓜蔞、膽南星、生大黃、芒硝組合而成，方中瓜蔞性寒味苦，有清熱化痰、寬胸散結(jié)之功效，同時伴有潤燥滑腸的作用；膽南星性涼味苦，是清熱化痰，熄風(fēng)止痙之良品；大黃苦寒，有瀉熱毒，破積滯，行瘀血的功效。芒硝咸、苦，寒，有瀉熱通便，潤燥軟堅，清火消腫的作用。諸藥合用，降胃氣，以恢復(fù)其主降的功能；清化熱痰濁毒，防止痰熱化風(fēng)，風(fēng)痰上擾，竅閉神昏諸證。其瀉下作用雖然猛烈，但由于方證相應(yīng)，善其應(yīng)用，標(biāo)本相得，邪氣乃伏[13-15]。本研究發(fā)現(xiàn)加用星蔞承氣湯后大鼠的mNSS評分明顯下降，說明星蔞承氣湯可明顯改善急性腦卒中大鼠的神經(jīng)缺損癥狀，此外我們利用TTC染色證實模型組大鼠腦組織出現(xiàn)明顯梗死灶，提示此研究造模成功，并發(fā)現(xiàn)星蔞承氣湯可明顯縮小大鼠的腦梗死體積，說明該方有明顯的腦保護(hù)效應(yīng)。

在探討星蔞承氣湯作用機(jī)制時我們對各組大鼠腦組織的CREB-BDNF信號通路標(biāo)志性蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測對比。CREB-BDNF信號通路是維持中樞神經(jīng)正常生理活動重要的途徑，與神經(jīng)的再生、分化、存活等過程關(guān)系密切。有研究顯示急性腦缺血再灌注損傷模型大鼠的CREB表達(dá)受抑制，CREB在神經(jīng)元缺血缺氧后的神經(jīng)再生作用毋庸置疑，BDNF是CREB下游的關(guān)鍵因子，于80年代初由德國神經(jīng)生物學(xué)家Brade首次發(fā)現(xiàn)并報道，研究人員證實BDNF屬于與神經(jīng)生長、增殖、凋亡密切相關(guān)的、廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種蛋白質(zhì)，是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族重要成員之一[16-17]，被認(rèn)為是治療不同神經(jīng)性疾病的潛在藥物。在神經(jīng)生長、成熟階段，BDNF充分參與調(diào)節(jié)合成代謝、增加神經(jīng)元胞體大小、促進(jìn)受損神經(jīng)元修復(fù)并促進(jìn)其再生。此外，BDNF濃度上調(diào)還可刺激成熟神經(jīng)元軸突、樹突的萌芽，并增強(qiáng)放大突觸間的信號傳遞，增強(qiáng)突出前后長時程，介導(dǎo)神經(jīng)元的可塑性[18]。BDNF廣泛分布于大腦皮層、海馬、丘腦、小腦等，其中皮層及海馬的含量最為豐富。本研究中我們利用Western blot法及PCR法發(fā)現(xiàn)急性腦卒中大鼠腦組織BDNF蛋白及mRNA的水平明顯下降，經(jīng)過星蔞承氣湯干預(yù)后大鼠腦組織BDNF蛋白及mRNA的水平均明顯上調(diào)，說明星蔞承氣湯通過上調(diào)BDNF的表達(dá)水平實現(xiàn)腦保護(hù)效應(yīng)。