香萱益神方對血管性癡呆模型大鼠神經(jīng)元凋亡機(jī)制研究

李 歐，張 潔，徐 建

(1.上海市中醫(yī)醫(yī)院神志病科，上海 200071；2.上海市中醫(yī)醫(yī)院中醫(yī)睡眠疾病研究所，上海 200071 )

血管性癡呆(Vascular dementia,VD)是指由一系列的腦血管病因素(主要為高血壓病、高血脂癥、糖尿病等)、顯性因素(腦梗死、腦出血等)或非顯性腦血管病(腦白質(zhì)疏松、慢性腦缺血等)引起的臨床表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙的癡呆綜合征[1]。據(jù)報道，截止2015年全球每3 s就發(fā)現(xiàn)1例新的阿爾茲海默病(Alzheimer dementia，AD)患者，目前全球阿爾茲海默病患者約4600萬人，預(yù)計2050年，全球患病人數(shù)將達(dá)到1.51億[2]。有調(diào)查顯示，VD患者至少占AD病例總數(shù)的10%～20%[3]。流行病學(xué)顯示，我國VD患病率高達(dá)1.1%～3.0%，VD已經(jīng)成為僅次于AD 的第二大老年性癡呆疾病，嚴(yán)重威脅著老年人的身心健康[4]。VD不僅在認(rèn)知功能上出現(xiàn)明顯障礙，并且對患者的日常生活質(zhì)量、社會價值、個人自理能力均有較大程度的影響。目前雖然VD的病因及發(fā)病機(jī)制尚無統(tǒng)一定論，但VD在有效手段干預(yù)后，疾病的發(fā)生發(fā)展有一定的可逆性，因此VD的預(yù)防及治療工作具有十分重要的意義[5]。中醫(yī)藥對于延緩VD的發(fā)生發(fā)展具有一定優(yōu)勢，本課題組在前期臨床研究中發(fā)現(xiàn)中藥經(jīng)驗方香萱益神方可以有效改善VD患者的認(rèn)知功能，本次實(shí)驗研究則著重探討該方對VD大鼠神經(jīng)元凋亡的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料

1.1.1 實(shí)驗動物：Wistar大鼠健康雄性45只，動物質(zhì)量合格證(2015000541616)；許可證號[SCXK(滬)2012-0002]；平均體重(200±15)g，均由上海市斯萊克實(shí)驗動物責(zé)任有限公司提供，上海市中醫(yī)醫(yī)院實(shí)驗中心動物房SPF級飼養(yǎng)。適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后進(jìn)行實(shí)驗。實(shí)驗期間保證實(shí)驗動物自由進(jìn)食喂養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境安靜，保證飼養(yǎng)溫度控制在(24±2)℃、濕度40%～50%，光照節(jié)律12L/12D 、光照時間6:00～18:00。

1.1.2 主要試劑：注射用生理鹽水購自廣東大冢制藥有限公司，水合氯醛購自上海國藥試劑集團(tuán)，香萱益神方的中藥草藥由上海市中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供。大鼠血清及海馬組織腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)采用酶聯(lián)免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測定，試劑盒(批號 EK0308)、TTC染色試劑盒均由武漢博士德生物有限公司提供。DAB顯色液(批號PW017，武漢博士德生物有限公司)；試劑Trizol(批號15596-016，Invitrogen公司)；試劑Tween-20(批號1247-CAS，Sigma生物技術(shù)有限公司)。

1.1.3 主要儀器：手術(shù)器械(上海圓創(chuàng)生物有限公司)、1號手術(shù)縫線(美國強(qiáng)生醫(yī)療器材有限公司)、醫(yī)用電子天平(凱豐生物有限公司)、電泳儀(型號DYCZ-24DN)、脫色搖床(型號SLK-OR3000)、Real-time檢測儀、干式恒溫器(型號JXH-200)、旋渦振蕩器(型號Vortex XW-80A)、生物組織包埋機(jī)(型號KD-BM)、電熱恒溫室水槽(型號SSW-420-2S)、 Morris 水迷宮視頻分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司，型號MT-200)。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 香萱益神方：香附、石菖蒲、焦山梔、遠(yuǎn)志各9 g，萱草花20 g，肉桂、砂仁各3 g。

1.2.2 建模、分組及給藥：適應(yīng)性喂養(yǎng)2周，Morris水迷宮排除特異性大鼠后，運(yùn)用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為三組：假手術(shù)組、模型組、中藥組。模型組、中藥組采用改良-兩血管結(jié)扎法建立VD大鼠模型。大鼠術(shù)前12 h禁食，不禁水，以10%水合氯醛腹腔麻醉后，取大鼠仰臥位，將其固定于鼠板上；剃毛器于頸部范圍剃毛備皮、常規(guī)75%酒精消毒，頸部正中剪刀切出1 cm切口，鈍性分離皮下組織，于氣管旁找到左側(cè)頸總動脈，玻璃分針小心分離迷走神經(jīng)，使用4號手術(shù)線于頸動脈上下分別結(jié)扎，術(shù)中動作輕柔、盡量避免牽拉神經(jīng)、避免金屬器械損傷神經(jīng)，結(jié)扎后縫合。術(shù)后傷口處噴撒少量青霉素注射液，防止感染，電熱毯保持體溫。直至大鼠蘇醒，將其移動至鼠籠。1周后行右側(cè)頸動脈結(jié)扎，手術(shù)方法同前。假手術(shù)組：大鼠同上步驟進(jìn)行固定、麻醉、取頸部正中部位切口，僅分離雙側(cè)頸總動脈，不進(jìn)行結(jié)扎術(shù)。中藥組給予香萱益神方，中藥液按照16 g/kg劑量灌胃。其余兩組予等劑量的純凈水灌胃。三組均連續(xù)灌胃6周。

1.2.3 行為學(xué)檢測:造模結(jié)束1周后采用 Morris 水迷宮學(xué)習(xí)記憶行為測試[6]評估大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。Morris水迷宮實(shí)驗分為兩部分:①定位航行試驗：先將大鼠放入水池中(不放平臺)自由游泳，讓其熟悉Morris 水迷宮環(huán)境。訓(xùn)練開始時，將平臺置于NW象限，將受試大鼠頭朝池壁按順時針方向依次由第一象限、第二象限、第三象限、第四象限入水點(diǎn)，放入水中。如果大鼠在2 min內(nèi)找到平臺(逃避潛伏期)，記錄2 min內(nèi)實(shí)際逃避潛伏期時間;如果在2 min內(nèi)未找到平臺，將其引上平臺并停留10 s，逃避潛伏期時間記錄為2 min。每天于固定時間段訓(xùn)練，4 次/ d，120 s/次，持續(xù) 4 d。每天取4次逃避潛伏期時間的平均值作為當(dāng)日成績。②空間探索試驗：Morris水迷宮實(shí)驗的第5天撤除原平臺，同時將所有大鼠于原本平臺所在象限的對側(cè)象限入水點(diǎn)，放入水中，觀察并記錄大鼠2 min內(nèi)穿越原平臺區(qū)域的次數(shù)、在目標(biāo)象限停留時間。每次實(shí)驗結(jié)束后，毛巾擦干及吹干大鼠后放入籠內(nèi)。

1.2.4 TTC染色檢測梗死面積：大鼠取腦后，全腦置于-20 ℃冰箱中速凍20 min后，切片。第一刀于腦前極與視交叉連線中點(diǎn)處，第二刀于視交叉部位，第三刀于漏斗柄部位，第四刀于漏斗柄與后葉尾極之間[7]。將切片置于2%濃度TTC染液中。錫箔紙蓋住容器后，室溫平衡15～30 min，取出切片拍照。

1.2.5 BDNF檢測：大鼠水迷宮最后1天檢測后，麻醉處死，腹腔主動脈取血后、于碎冰上及時分離出Wistar大鼠腦組織，分離海馬部分后迅速置于液氮中冷卻后研磨制備勻漿。海馬組織磁力懸浮器充分研磨后，3000 r/min、離心5 min后取懸浮物。全血3000 r/min、離心10 min后分離血清，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作，Elisa法檢測大鼠海馬及外周血血清BDNF含量，Western blot法檢測BDNF蛋白水平。

1.2.6 大鼠海馬組織形態(tài)及神經(jīng)元凋亡率：HE觀察大鼠海馬組織形態(tài)，Tunel染色法觀察大鼠神經(jīng)元凋亡率。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠術(shù)后1周Morris水迷宮實(shí)驗結(jié)果 各組大鼠定位航行實(shí)驗結(jié)果見表1。假手術(shù)組大鼠隨著實(shí)驗天數(shù)的增加，8～11 d尋找到平臺的時間不斷縮短，組內(nèi)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，說明大鼠的空間學(xué)習(xí)能力不斷提高。模型組大鼠隨著實(shí)驗天數(shù)的增加，尋找到平臺的時間并無改善，組內(nèi)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。術(shù)后9 d、術(shù)后10 d、術(shù)后11 d，模型組與假手術(shù)組大鼠找到平臺的時間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；假手術(shù)組、中藥組各時間點(diǎn)找到平臺的時間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

表1 各組大鼠術(shù)后1周定位航行實(shí)驗結(jié)果(s)

各組大鼠空間搜索實(shí)驗結(jié)果見表2。Morris水迷宮術(shù)后11 d結(jié)果顯示，模型組大鼠與假手術(shù)組相比，在目的象限滯留時間、運(yùn)動距離、進(jìn)入目的象限次數(shù)與總象限的百分比均高于模型組(P<0.05)。中藥組與模型組大鼠相比，各指標(biāo)結(jié)果差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組大鼠術(shù)后1周空間搜索實(shí)驗結(jié)果

2.2 各組大鼠治療6周Morris水迷宮實(shí)驗結(jié)果 定位航行實(shí)驗結(jié)果見表3。假手術(shù)組大鼠隨著實(shí)驗天數(shù)的推移，找到平臺時間不斷縮短。模型組大鼠找到平臺時間雖有縮短，但各時間點(diǎn)的觀察時間仍長于假手術(shù)組，組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。中藥組與模型組比較，各時間點(diǎn)時間明顯縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

表3 各組大鼠治療6周定位航行實(shí)驗結(jié)果(s)

空間搜索實(shí)驗結(jié)果見表4。模型組大鼠逃逸平臺進(jìn)入次數(shù)、第3象限滯留時間、第3象限運(yùn)動距離、第3象限進(jìn)入次數(shù)均低于假手術(shù)組，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。與模型組比較，中藥組大鼠逃逸平臺進(jìn)入次數(shù)、第3象限滯留時間、第3象限運(yùn)動距離、第3象限進(jìn)入次數(shù)均高，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

表4 各組大鼠治療6周后Morries水迷宮空間搜索實(shí)驗結(jié)果

2.3 各組大鼠腦梗死面積比較 大鼠腦組織 TTC 染色后的梗死灶會呈蒼白色，而未梗死組織可被染成玫瑰紅色，白色與紅色之間界限清晰。假手術(shù)組無明顯腦梗死組織；模型組腦內(nèi)多為白色組織，可見少量玫瑰紅色組織，說明模型組大鼠腦內(nèi)出現(xiàn)腦梗死；中藥組與模型組比較，腦內(nèi)白色面積明顯減少，說明VD模型大鼠腦內(nèi)梗死面積較正常大鼠增多，而在香萱益神方治療后大鼠腦組織得到改善，見圖1。

圖1 各組大鼠TTC染色結(jié)果

2.4 各組大鼠外周血清、海馬組織BDNF含量比較 模型組與假手術(shù)組比較，外周血血清、海馬組織中BDNF含量均不同程度下降，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=4.726，P<0.05)。中藥組與模型組比較，中藥組血清中BDNF含量較高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。中藥組海馬組織中BDNF含量較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=17.466，P<0.05)。說明香萱益神方可以提高VD大鼠海馬組織中BDNF濃度。見表5。

表5 各組大鼠血清、海馬組織BDNF水平比較(pg/ml)

2.5 各組大鼠BDNF蛋白水平表達(dá)比較 BDNF蛋白灰度值的計算以 GAPDH 為內(nèi)參。模型組與假手術(shù)組比較，BDNF蛋白水平較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。治療后中藥組BDNF蛋白表達(dá)水平與模型組比較，BDNF蛋白表達(dá)水平較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表6(圖2)。

圖2 Western blot檢測各組大鼠海馬組織BDNF蛋白表達(dá)水平

表6 Western blot檢測大鼠海馬BDNF蛋白表達(dá)水平

2.6 各組大鼠海馬組織HE染色結(jié)果 利用HE染色技術(shù)，進(jìn)行各組大鼠腦內(nèi)海馬組織形態(tài)觀察(圖3)。假手術(shù)組海馬神經(jīng)元在視野中可見細(xì)胞排列比較整齊，結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)較為完整，胞漿豐富。模型組海馬組織細(xì)胞排列散亂，胞體散在呈現(xiàn)固縮狀態(tài)，細(xì)胞核色深染，胞間隙增大，有空泡變性現(xiàn)象。中藥組海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)有所恢復(fù)，排列較為整齊，偶見少量空泡變性。

圖3 各組大鼠海馬組織形態(tài)圖(HE染色，×400)

2.7 各組大鼠海馬神經(jīng)元TUNEL染色結(jié)果 經(jīng)TUNEL染色后，凋亡的海馬神經(jīng)元染色鏡下可看到深棕色顆粒，根據(jù)公式計算大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率。假手術(shù)組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞深棕色染色面積較少。模型組與假手術(shù)組比較，深棕色染色細(xì)胞面積肉眼下可見增多，海馬神經(jīng)元凋亡率高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。中藥組與模型組比較，深棕色染色細(xì)胞數(shù)目減少，海馬神經(jīng)元凋亡率低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表7(圖4)。

表7 TUNEL法檢測海馬神經(jīng)元凋亡率(%)

圖4 各組大鼠海馬神經(jīng)元調(diào)亡情況(TUNEL染色，×400)

3 討 論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為肝屬木，藏血，主氣機(jī)升降，調(diào)暢情志，喜條達(dá)而惡抑郁。肝通過協(xié)調(diào)氣的升降出入平衡，保證氣血正常運(yùn)行和精神情志活動[7]。一旦氣機(jī)紊亂，肝氣郁結(jié)，氣血運(yùn)行失常，無法協(xié)助脾胃后天之本化生水谷精微則易引起情志活動異常而出現(xiàn)認(rèn)知功能受損。此外，腎精的生長有賴于肝血的滋養(yǎng)，若肝氣不暢，氣虛則血虛，腎精不足而腦髓失養(yǎng)，亦會出現(xiàn)認(rèn)知功能的失常。因此通過疏肝法治療VD，氣行則血行，瘀滯自化，認(rèn)知功能得到提高，臨床可取得較好的治療療效，同時疏肝益智也為VD中醫(yī)治療打開了新的思路。導(dǎo)師徐建教授在這一理論指導(dǎo)下創(chuàng)立經(jīng)驗方香萱益神方治療VD，方中香附理氣疏肝解郁、萱草花疏肝安神醒腦，二者共為君藥發(fā)揮醒神、理氣之功；石菖蒲辛溫芳香，既能醒神，又可寧神益志；遠(yuǎn)志，味辛苦，性溫，擅安神益智，二藥相濟(jì)，使氣自順而壅自開，共奏開竅明神之功；佐以肉桂芳香辛散，溫通經(jīng)脈，引火歸元，助理氣開郁，同時又可以寒熱相濟(jì)，陰陽平衡；砂仁辛散溫通，氣味芳香，可化濕濁[8]；焦山梔清熱除煩，清泄中焦內(nèi)熱[9]，配合理氣藥，可疏肝泄熱；全方陰陽調(diào)和，共達(dá)疏肝調(diào)氣，益志開竅之效，有效改善患者認(rèn)知功能。

海馬神經(jīng)元主要參與人體大腦內(nèi)的學(xué)習(xí)、記憶。當(dāng)大腦長期處于慢性缺血、低灌注時，大腦內(nèi)海馬體最先受損，隨之海馬出現(xiàn)乙酰膽堿水平降低、突觸可塑性改變、細(xì)胞Ca2+超載、興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)異常增加、炎癥反應(yīng)、氧自由基過氧化應(yīng)激、tau蛋白過度磷酸化等應(yīng)激表現(xiàn)，以上應(yīng)激反應(yīng)通過某種信號通路作用損害海馬神經(jīng)元功能，繼而導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的出現(xiàn)[10]。目前較明確的是海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致機(jī)體認(rèn)知功能障礙的主要病理原因之一。死亡受體通路、線粒體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用是公認(rèn)的、較經(jīng)典的三條細(xì)胞凋亡機(jī)制通路。當(dāng)海馬神經(jīng)元出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)時，上述三條經(jīng)典凋亡通路被激活，進(jìn)一步誘導(dǎo)凋亡基因Bcl-2、Caspase基因家族、Ice基因家族等，最終導(dǎo)致海馬神經(jīng)元細(xì)胞程序性死亡，海馬體參與的記憶與空間定位功能受損，機(jī)體表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙的癡呆[11-12]。近年來，對BDNF-PI3k/TrkB/AKT信號通路的研究越來越熱門。已知的PI3K/AKT通路具有保護(hù)細(xì)胞、調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、改善學(xué)習(xí)記憶能力的作用，該通路在腦內(nèi)神經(jīng)病變?nèi)缒X梗死、帕金森病、AD、神經(jīng)元病變、多發(fā)性硬化癥的發(fā)病中起著重要作用[13-15]。PI3k是同時具有蛋白激酶活性、酯類激酶活性的磷脂激酶家族中的重要成員之一；PI3k有多種同工酶，這些同工酶均可使磷脂酰肌醇PI的D3羥基磷酸化，促進(jìn)生成 D3-磷酸化磷酸肌醇 PIP2(PI-3,4-P2,3,4-二磷酸磷脂酰肌醇)和PIP3(PI-3,4,5-P3,3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇)[16-18]。二者可以共同激活下游一系列蛋白信號通路，其中PI3-K-AKT/PKB信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)對細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)作用起著關(guān)鍵作用，包括其對凋亡基因Bcl-2、Capsase家族基因的調(diào)節(jié)作用。當(dāng)BDNF與TrkB結(jié)合后，TrkB的二聚體化進(jìn)一步被誘導(dǎo)，激活其受體酪氨酸激酶區(qū)域的酪氨酸(Y)自動磷酸化，經(jīng)典的PI3K/AKT通路能夠被激活，發(fā)揮抗凋亡作用，從而抑制了VD的發(fā)生發(fā)展[19-20]。因此如何通過有效干預(yù)措施減緩海馬神經(jīng)元凋亡，改善機(jī)體認(rèn)知功能，近年來已成為熱點(diǎn)問題。本課題實(shí)驗證實(shí)，經(jīng)香萱益神方治療6周后的VD大鼠認(rèn)知能力有了明顯的改善。同時，香萱益神方還具有抑制海馬神經(jīng)元凋亡的作用。從TTC染色結(jié)果可見，VD大鼠腦內(nèi)出現(xiàn)大面積腦梗死，經(jīng)香萱益神方治療后中藥組腦梗死面積明顯少于VD組。HE染色結(jié)果示，中藥組大鼠與VD大鼠相比，海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)相對完整，細(xì)胞排列也較整齊，空泡數(shù)量明顯減少。TUNEL染色結(jié)果示，中藥組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞棕褐色深染面積凋亡率明顯少于VD組大鼠，經(jīng)過神經(jīng)元凋亡率計算，中藥組海馬神經(jīng)元凋亡率低于VD組。通過對BDNF蛋白定量及定性檢測發(fā)現(xiàn)，中藥香萱益神方可以改善模型組大鼠BNDF水平?？傊爿嬉嫔穹侥芨纳芕D模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，可能與該方抑制凋亡基因的過表達(dá)、保護(hù)海馬神經(jīng)元細(xì)胞、延緩海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡有關(guān)。

綜上所述，在疏肝益志理論指導(dǎo)下運(yùn)用香萱益神方治療VD大鼠，可改善VD大鼠認(rèn)知行為、抑制海馬神經(jīng)元凋亡，為臨床治療提供新思路與方法。