用于智能手機(jī)的無(wú)源POCT尿酸檢測(cè)系統(tǒng)設(shè)計(jì)?

王文廉牛博懷王 玉

(1.中北大學(xué)儀器科學(xué)與動(dòng)態(tài)測(cè)試教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西 太原030051；2.中北大學(xué)電子測(cè)試技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西 太原030051)

尿酸(UA)是人體嘌呤核苷酸分解代謝過(guò)程中的最終產(chǎn)物,可作為高尿酸血癥、痛風(fēng)、腎綜合征等疾病和Lesch-Nyhan綜合征的生物標(biāo)志物,此外,較高的UA水平意味著未來(lái)患得2型糖尿病及其并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)更高[1]。因此,分析生物體液中的UA可以獲得豐富的個(gè)人健康生理信息,在臨床醫(yī)學(xué)上具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。一些醫(yī)療點(diǎn)設(shè)備允許在家里進(jìn)行醫(yī)療自檢,但不能完全覆蓋不斷增長(zhǎng)的電子健康系統(tǒng)的診斷需求,現(xiàn)在仍需要大量的遠(yuǎn)程醫(yī)療設(shè)備以方便患者進(jìn)行自我監(jiān)測(cè)[2]。即時(shí)檢測(cè)(POCT)的發(fā)展使臨床診斷變得更節(jié)約成本、快速而易于使用,這一平臺(tái)的意義在于它有可能使患者更頻繁地在方便的情況下監(jiān)測(cè)自己的健康狀況,以便盡早診斷疾病[3]。醫(yī)療自檢生物傳感器中,電化學(xué)是一種常見(jiàn)的具有高穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性的傳感技術(shù),已廣泛應(yīng)用于重要生物標(biāo)志物的定量檢測(cè),如葡萄糖[4]、蛋白質(zhì)[5]、電解質(zhì)[6]、細(xì)菌[7]等。但這些檢測(cè)手段需要熟練的人員或昂貴的設(shè)備來(lái)提供準(zhǔn)確的結(jié)果,現(xiàn)在更多的電化學(xué)生物傳感器越來(lái)越偏向于更便攜靈活的檢測(cè)設(shè)備[8－10]。

截止2019年11月全球手機(jī)用戶達(dá)80億[11],智能手機(jī)由于其無(wú)處不在的分布、國(guó)際連接和強(qiáng)大的構(gòu)造,在便攜式生物醫(yī)學(xué)傳感系統(tǒng)中扮演著越來(lái)越重要的角色,正改變著移動(dòng)醫(yī)療和現(xiàn)場(chǎng)醫(yī)療檢測(cè)的概念,加速了健康產(chǎn)業(yè)的發(fā)展?；谥悄苁謾C(jī)的UA電化學(xué)檢測(cè)已經(jīng)被描述,2018年Daizong Ji[12]等人設(shè)計(jì)了基于智能手機(jī)的集成伏安法系統(tǒng),但通過(guò)OTG(On-The-Go技術(shù))與手機(jī)有線連接的方式極大地限制了傳感系統(tǒng)的靈活性和集成性,這對(duì)于連續(xù)實(shí)時(shí)讀出是不方便的。近場(chǎng)通信(NFC)是一種射頻識(shí)別(RFID)技術(shù),它實(shí)現(xiàn)了設(shè)備之間的短距離無(wú)線通信[2]。NFC傳感器為便攜式、實(shí)時(shí)監(jiān)控和定量檢測(cè)生物標(biāo)志物提供了新技術(shù)。NFC功能已被嘗試在尿酸測(cè)量中,2015年P(guān)etar Kassal[13]等人利用了NFC短距離無(wú)線通信的優(yōu)點(diǎn)設(shè)計(jì)了用于測(cè)量傷口尿酸含量的智能繃帶,但沒(méi)有擺脫使用電源模塊的限制。這里設(shè)計(jì)了便攜式尿酸檢測(cè)傳感器,利用具有NFC功能的智能手機(jī)可以無(wú)需物理連接地為電路供電并接收數(shù)據(jù),可依附于手機(jī)配件用于POCT在多種場(chǎng)合進(jìn)行尿酸自測(cè)。

POCT檢測(cè)平臺(tái)由傳感器、檢測(cè)電路和智能手機(jī)組成?；谌嵝訮ET(聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯)襯底的絲網(wǎng)印刷電極(SPE)通過(guò)交聯(lián)尿酸酶對(duì)金工作電極進(jìn)行了化學(xué)改性,并用作傳感器。當(dāng)智能手機(jī)靠近NFC天線時(shí),NFC芯片獲得從射頻場(chǎng)接收的多余能量,驅(qū)動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)的其他各個(gè)組件開(kāi)始工作。檢測(cè)電路用于在傳感器上施加電壓并檢測(cè)電流響應(yīng),測(cè)得的UA濃度值被發(fā)送到NFC芯片,通過(guò)NFC天線傳輸?shù)街悄苁謾C(jī),并顯示在Android應(yīng)用程序(APP)上。使用無(wú)源POCT檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)尿酸進(jìn)行測(cè)量,計(jì)時(shí)安培法電流大小與尿酸濃度有良好的線性關(guān)系,并且檢測(cè)結(jié)果顯示出與參考儀器良好的一致性,同時(shí)應(yīng)用于血清的真實(shí)樣本測(cè)試,驗(yàn)證了該系統(tǒng)在POCT應(yīng)用中的可行性。

1 理論與方法

1.1 儀器與試劑

使用到的試劑包括尿酸；尿酸酶(生物技術(shù)級(jí),10μ/mg)；牛血清蛋白；戊二醛；殼聚糖；抗壞血酸(AA)；丙酮；無(wú)水乙醇；氯化鉀；濃硫酸；氫氧化鉀；谷氨酸；半胱氨酸；葡萄糖；PBS(pH 7.4),所有試劑均為分析級(jí),購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。用CHI660E電化學(xué)分析儀(上海辰華有限公司)進(jìn)行了電化學(xué)表征；矢量網(wǎng)絡(luò)分析儀(深圳市鼎陽(yáng)科技有限公司,QG0703P_C01A)進(jìn)行天線特征參數(shù)的測(cè)量；示波器(Tektronix,DPO5104B)檢測(cè)電路模擬端輸入；SPE電極在PET襯底(厚0.25 mm)上印刷,由工作金電極,輔助金電極和Ag/AgCl參比電極組成。

1.2 天線設(shè)計(jì)

圖1 天線輸入反射率仿真與驗(yàn)證

天線是一個(gè)定制設(shè)計(jì)的平面線圈,從手機(jī)產(chǎn)生的射頻場(chǎng)中獲取能量。為了能夠使用移動(dòng)NFC讀取器進(jìn)行讀取,選擇了40 mm×24 mm環(huán)形天線,在1.6 mm厚的FR4上有6匝。跡線的寬度為0.254 mm,跡線之間的間隙為1 mm。通過(guò)HFSS軟件仿真可得f＝13.56 MHz時(shí)其等效電感值L1為1.989μH,S11圖如圖1(a),可以看到,在13.56 MHz頻率處的S11達(dá)到了最小值(反射系數(shù)最小,此時(shí)的能量傳遞效率最高)。通過(guò)矢量網(wǎng)絡(luò)分析儀測(cè)得實(shí)際天線等效電感值L2為1.284μH,S11圖如圖1(b)與仿真結(jié)果基本一致。CIC為NFC芯片內(nèi)部電容50 pF,矢量網(wǎng)絡(luò)分析儀測(cè)量天線寄生電容Cp為34 pF,根據(jù)公式(L值為測(cè)得的等效電感L2,fr為共振頻率):

計(jì)算得到調(diào)諧電容Ctuning為18 pF,即可使標(biāo)簽天線共振頻率在13.56 MHz。規(guī)定了天線的形狀和調(diào)諧電容的大小即可完成該部分硬件電路的設(shè)計(jì)。

1.3 尿酸生物傳感器的制備與改性

使用的SPE在PET基底上印刷了金工作電極、對(duì)電極和Ag/AgCl參比電極,并使用絕緣體油墨隔絕連接區(qū)與電化學(xué)反應(yīng)區(qū)。其中工作電極呈圓形,直徑為4 mm,酶和介體等生化活性物種可被固定化。該實(shí)驗(yàn)中工作電極用尿酸酶修飾,牛血清蛋白(BSA)的自由巰基連接蛋白質(zhì)交聯(lián)劑戊二醛固定尿酸酶,殼聚糖(CS)提供了整體的外界保護(hù)層。首先將2 mg尿酸酶與2 mg BSA和1μL 8%戊二醛溶液混合于200μL PBS(pH 7.4)中。將5μL混合溶液滴在工作電極上,室溫干燥30 min,對(duì)工作電極進(jìn)行功能化。接下來(lái),電極表面滴涂5μL 0.2 wt%的殼聚糖溶液,干燥后放入4℃冰箱保存?zhèn)溆谩PE及其功能化如圖2所示。傳感器檢測(cè)原理如反應(yīng)式(2)和(3)所示。

圖2 顯示了尿酸酶SPE結(jié)構(gòu)及改性

1.4 電化學(xué)系統(tǒng)評(píng)價(jià)

在無(wú)線電源和數(shù)據(jù)傳輸方面,我們用NFC智能手機(jī)(HUAWEI nova7)評(píng)估了POCT檢測(cè)平臺(tái)電化學(xué)檢測(cè)電路的性能。為了設(shè)計(jì)更靈活的檢測(cè)系統(tǒng),所以要控制檢測(cè)系統(tǒng)整體體積,但其和天線所留的凈空區(qū)的大小相矛盾,我們分別設(shè)計(jì)了電路置于天線內(nèi)和天線外的檢測(cè)系統(tǒng),測(cè)量了與智能手機(jī)的垂直距離從0到20 mm變化時(shí)對(duì)電路供電電壓的影響。用萬(wàn)用表檢測(cè)電源電壓(NFC芯片的電壓輸出)。

為了評(píng)估恒電位電路(包括電壓信號(hào)采集、處理和模數(shù)轉(zhuǎn)換)的檢測(cè)準(zhǔn)確性和可靠性,設(shè)定模擬前端(AFE,Analog front end)輸入0～2 V的三角波,使用示波器測(cè)試DAC輸出同時(shí)與手機(jī)APP顯示數(shù)據(jù)對(duì)比。

1.5 測(cè)定尿酸

根據(jù)先前的研究,人體液中生理濃度范圍內(nèi)的UA,包括血清240μmol/L～520μmol/L、尿液1.4 μmol/L～4.4μmol/L和唾液100μmol/L～250 μmol/L[14]。實(shí)際樣品選擇血尿酸(Blood UA,BUA)進(jìn)行測(cè)量,因此,我們選擇UA的典型濃度為0～800μmol/L。首先用商用的電化學(xué)工作站CHI66E測(cè)試了傳感器的線性范圍、穩(wěn)定性和抗干擾性。然后使用無(wú)源POCT尿酸檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)同濃度的UA進(jìn)行了測(cè)量并與電化學(xué)工作站所得結(jié)果進(jìn)行比較。最后用于實(shí)際血液檢測(cè),并對(duì)結(jié)果進(jìn)行了分析。該小節(jié)所有的測(cè)量都是在先前描述的SPE中進(jìn)行的,使用計(jì)時(shí)安培法在0.35 V(vs.Ag/AgCl)的電壓下工作60 s,記錄工作過(guò)程。

2 結(jié)果與討論

2.1 系統(tǒng)設(shè)計(jì)與操作

完整的POCT平臺(tái)如圖3(a)所示,共顯示了系統(tǒng)的三個(gè)主要部分:①印制板電路(PCBs),用于信號(hào)處理、傳輸、電源管理和連接SPE；②智能手機(jī),應(yīng)用程序運(yùn)行顯示檢測(cè)結(jié)果。這兩部分通過(guò)NFC天線之間的感應(yīng)耦合無(wú)線連接,進(jìn)行電能和數(shù)據(jù)傳輸；③光敏樹脂3D打印制造的外殼,以支撐整個(gè)系統(tǒng)作為配件依附于手機(jī)。

圖3(b)PCB設(shè)計(jì)被分成兩個(gè)不同的PCB。PCB1包含整個(gè)檢測(cè)電路和射頻(RF)天線,PCB2負(fù)責(zé)連接SPE。兩部分通過(guò)排針垂直連接,這樣的設(shè)計(jì)一方面是為了減小體積使PCB1被天線包裹,從天線內(nèi)部垂直連接SPE,不會(huì)影響NFC天線,另一方面是為了使電極與智能手機(jī)保持距離,防止待測(cè)溶液損壞手機(jī)。

圖3(c)說(shuō)明的是檢測(cè)系統(tǒng)電路框圖。電路部分在功能上可分為六個(gè)部分,分別是NFC天線、NFC芯片、MCU、DAC芯片、恒電位電路和電極。當(dāng)智能手機(jī)靠近NFC天線時(shí),NFC芯片NT3H1101會(huì)自動(dòng)喚醒,如果能量收集模式被激活并且磁場(chǎng)強(qiáng)度足夠,高于閾值則NFC芯片獲得從RF場(chǎng)接收的多余能量,驅(qū)動(dòng)整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)工作。該系統(tǒng)中NFC芯片被編程從射頻中收集能量并調(diào)制輸出的穩(wěn)定電壓2.75 V,直接為整個(gè)系統(tǒng)供電。通過(guò)其串行外圍接口(I2C)總線與MCU進(jìn)行通信,MCU內(nèi)部自帶模數(shù)轉(zhuǎn)換器(ADC),用于將傳感器采集到的模擬量轉(zhuǎn)換為數(shù)字量,傳給NFC芯片后放于SRAM緩存區(qū),并快速傳輸數(shù)據(jù)于手機(jī)。智能手機(jī)開(kāi)發(fā)的應(yīng)用程序來(lái)控制NFC芯片的整個(gè)測(cè)量過(guò)程并可將數(shù)據(jù)保存下來(lái)以進(jìn)行系統(tǒng)性分析。采用外部超低功耗數(shù)模轉(zhuǎn)換器(DAC)MAX5530,在工作模式下僅需6μA的電流,為恒電位電路提供設(shè)定的電壓輸入。ADA4505運(yùn)算放大器采用軌到軌輸入與輸出擺幅,每個(gè)放大器的工作電流小于10μA。由四個(gè)運(yùn)算放大器處理三個(gè)電極的電壓信號(hào),包括偏置電路,恒電位電路和濾波電路,以輸出穩(wěn)定的模擬電壓。整個(gè)系統(tǒng)在檢測(cè)狀態(tài)下,供電2.75 V,工作電流3.5 mA(消耗功率9.625 mW)。

圖3 用于智能手機(jī)的尿酸POCT分析平臺(tái)的圖像和示意圖

2.2 系統(tǒng)性能測(cè)試

基于傳感器便攜性的考慮,所以要盡量縮小硬件電路部分的體積,但凈空區(qū)的減小會(huì)影響NFC芯片對(duì)手機(jī)產(chǎn)生RF場(chǎng)能量的收集,直接影響為整個(gè)系統(tǒng)供電。為此,我們分別設(shè)計(jì)了測(cè)試電路置于天線內(nèi)和天線外的檢測(cè)系統(tǒng),打開(kāi)手機(jī)NFC靠近貼片傳感器為其供電,測(cè)量了其與智能手機(jī)的垂直距離從0到20 mm變化時(shí)對(duì)電路供電電壓的影響。如圖4為檢測(cè)電路完全置于天線內(nèi)與互相分離的兩種電路設(shè)計(jì),用萬(wàn)用表檢測(cè)電路供電電壓(NFC芯片輸出電壓)結(jié)果。可以看到兩者都是在距離10 mm的位置電壓迅速降低為0,此時(shí)檢測(cè)電路幾乎沒(méi)有電壓輸入,所以在實(shí)際測(cè)量時(shí)應(yīng)使其緊貼于手機(jī)進(jìn)行測(cè)量。最終硬件電路的設(shè)計(jì)采用被天線包裹的方式。

圖4 供電電壓隨檢測(cè)電路與手機(jī)距離變化曲線

為了評(píng)估恒電位電路(包括電壓信號(hào)采集,處理和模數(shù)轉(zhuǎn)換)的檢測(cè)準(zhǔn)確性和可靠性,設(shè)定AFE輸入0～2 V的三角波,使用示波器測(cè)試DAC輸出同時(shí)與手機(jī)APP顯示數(shù)據(jù)對(duì)比(APP得到的電壓值V＝Vmax(2.75V)×Y(坐標(biāo)值)/256)。并分別用實(shí)驗(yàn)室穩(wěn)定電源裝置標(biāo)準(zhǔn)電壓輸入2.75 V和通過(guò)NFC芯片感應(yīng)手機(jī)射頻場(chǎng)供電進(jìn)行對(duì)比,如圖5為在設(shè)定輸入電壓下示波器和手機(jī)顯示結(jié)果。

圖5 示波器測(cè)試DAC輸出與手機(jī)APP顯示數(shù)據(jù)對(duì)比

2.3 對(duì)尿酸的反應(yīng)

首先,用電化學(xué)工作站CHI66E評(píng)估了尿酸酶SPE的電化學(xué)性能。為了覆蓋高尿酸血癥患者在診斷和治療應(yīng)用中的UA水平,在電流響應(yīng)中測(cè)試了動(dòng)態(tài)濃度范圍為0～800μmol/L濃度的UA。圖6(a)顯示了UA濃度以100μmol/L增量遞增的計(jì)時(shí)安培圖。數(shù)據(jù)表明,SPE尿酸酶生物傳感器對(duì)UA非常敏感,并具有寬線性范圍。相應(yīng)的電流響應(yīng)與UA濃度成正比,響應(yīng)結(jié)果如圖6(d)中曲線A,線性校準(zhǔn)曲線為y(μA)＝0.0186x(μmol/L)＋0.1704(R2＝0.9973)。

實(shí)際測(cè)量時(shí)由于人的體液,如血液,是包含多種干擾物的較復(fù)雜的基質(zhì),因此需要確保對(duì)于實(shí)際應(yīng)用的選擇性。如圖6(b)所示,通過(guò)在固定電位和攪拌條件下連續(xù)測(cè)量來(lái)評(píng)估選擇性,在0.1 mmol/L UA在連續(xù)加入1 mmol/L谷氨酸、半胱氨酸；5 mmol/L的葡萄糖；10 mmol/L的NO2－、Na＋、K＋、Cl－、Ca2＋；0.18 mmol/L抗壞血酸；0.1 mmol/L UA。在一些常見(jiàn)電活性物質(zhì)存在下,干擾物對(duì)UA電流信號(hào)沒(méi)有顯著影響(RSD<5%),這是由于尿酸氧化酶的特異性使生物傳感器高度適用于UA。

接下來(lái),通過(guò)在2 h內(nèi)以10 min的間隔對(duì)400μmol/L UA的響應(yīng)來(lái)進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)試,證實(shí)了連續(xù)監(jiān)測(cè)的可行性。圖6(c)說(shuō)明相應(yīng)的計(jì)時(shí)電流圖非常穩(wěn)定,在整個(gè)延長(zhǎng)的操作過(guò)程中都沒(méi)有明顯變化(RSD＝3.5%)。

使用無(wú)源尿酸檢測(cè)系統(tǒng)同樣測(cè)試了動(dòng)態(tài)濃度范圍為0～800μmol/L濃度UA電流響應(yīng),滴加待測(cè)液覆蓋電化學(xué)反應(yīng)區(qū)域即可,完整POCT尿酸檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)量過(guò)程如圖7(a)所示,每次檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)60 s。響應(yīng)結(jié)果如圖7(b)所示,相應(yīng)的電流響應(yīng)與UA濃度成正比,線性校準(zhǔn)曲線為y(μA)＝0.0186x(μmol/L)＋0.2189(R2＝0.9946)。UA生物傳感器在與儀器無(wú)關(guān)的整個(gè)生理濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系,且電化學(xué)工作站與無(wú)源POCT尿酸檢測(cè)系統(tǒng)兩種儀器之間具有良好的一致性(最大相對(duì)誤差為6.2%)。

圖6 尿酸酶SPE的電化學(xué)性能測(cè)試

圖7 POCT尿酸檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)試

為進(jìn)一步探究系統(tǒng)的實(shí)用性,幫助驗(yàn)證所開(kāi)發(fā)的傳感器在現(xiàn)場(chǎng)醫(yī)療監(jiān)測(cè)健康狀況方面的效用,在高尿酸血癥患者和健康志愿者兩種類型的志愿者中檢測(cè)了BUA水平,收集人體原始血清樣品,用PBS(0.1 mol/L,pH＝7.4)溶液將血清稀釋10倍,按分析方法操作測(cè)定,并用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行樣品回收率實(shí)驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表1。從表1中可見(jiàn),該傳感器對(duì)血清樣品中尿酸濃度檢測(cè)的結(jié)果令人滿意。

表1 血清中尿酸的測(cè)定及回收率

3 結(jié)論

本工作描述了一種可用于即時(shí)檢測(cè)UA的新型電化學(xué)生物檢測(cè)系統(tǒng),使用NFC技術(shù)依附于智能手機(jī)實(shí)現(xiàn)無(wú)源無(wú)線的工作模式,這極大地提高了系統(tǒng)的靈活性和小型化。使用簡(jiǎn)單快捷,只需滴涂待測(cè)液于SPE并將POCT平臺(tái)靠近手機(jī)即可,方便患者在多種場(chǎng)合下進(jìn)行自我監(jiān)測(cè)。用計(jì)時(shí)安培法驗(yàn)證了電化學(xué)反應(yīng)電流與UA濃度的線性關(guān)系,整個(gè)系統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)果與參考儀器有良好的一致性。同時(shí),實(shí)際樣品血清的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步表明該系統(tǒng)在即時(shí)醫(yī)療高度的可用性。未來(lái)的努力將嘗試改進(jìn)Android應(yīng)用程序以顯示更為詳細(xì)的信息,幫助患者進(jìn)行健康監(jiān)測(cè)和疾病診斷。