正交試驗(yàn)優(yōu)選制洋金花的炮制工藝研究

夏永嚴(yán) 李 婭 秦昆明,3 楊 超 蔡寶昌,3, 金俊杰,3*

1.蘇州大學(xué)附屬?gòu)埣腋坩t(yī)院藥劑科，江蘇 蘇州 215600；2.南京海昌中藥集團(tuán)有限公司，江蘇 南京 210061；3.南京海源中藥飲片有限公司，江蘇 南京 210061；4.南京中醫(yī)藥大學(xué) 國(guó)家教育部中藥炮制規(guī)范化及標(biāo)準(zhǔn)化工程研究中心，江蘇 南京 210023

洋金花Daturaeflos為茄科植物白花曼陀羅DaturametelL.干燥花，性味辛溫、有毒[1]。研究表明洋金花具有麻醉人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用，伍玉哲等[2]對(duì)87例臨床患者進(jìn)行鎮(zhèn)痛研究表明洋金花制劑鎮(zhèn)痛明顯，故洋金花以“中藥麻醉”臨床功效而被廣泛使用[3]。洋金花具有毒性，內(nèi)服急性中毒報(bào)道6例[4]，多由誤服或用量過(guò)度所導(dǎo)致，在內(nèi)服用量上需謹(jǐn)慎[5]。對(duì)于洋金花在臨床使用有明顯鎮(zhèn)痛效果，表明其具有臨床使用價(jià)值，但因其本身具有毒性或臨床使用量不精確，臨床上解決方法：一方面可以通過(guò)控制臨床用量，減少其毒性反應(yīng)出現(xiàn)，另一方面對(duì)洋金花進(jìn)行炮制，達(dá)到減毒增效和提高其內(nèi)在質(zhì)量穩(wěn)定性的效果。對(duì)制洋金花的炮制工藝進(jìn)行研究，獲得穩(wěn)定的炮制工藝參數(shù)，形成質(zhì)量均一穩(wěn)定的制洋金花，有助于制洋金花的臨床使用安全有效。

制洋金花只有《上海市中藥飲片炮制規(guī)范》[6]收載：將生洋金花用生姜汁拌勻，待吸透，略潤(rùn)，切成1～2 mm細(xì)絲，置鍋內(nèi)，炒干，趁熱噴灑白酒，拌勻，稍悶，晾干(每生洋金花100 kg，用生姜25 kg打汁，60°白酒12.5 kg)。目前，《藥典》規(guī)定洋金花含量測(cè)定成分為東莨菪堿[1]，未有相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)制洋金花的炮制工藝優(yōu)化報(bào)道，對(duì)于炮制工藝中“將生洋金花用生姜汁拌勻”中生姜汁加水量及之后進(jìn)行的悶潤(rùn)時(shí)間和“置鍋內(nèi)，炒干”中的炒制溫度和炒制時(shí)間未有明確的參數(shù)，為將其更好地用于臨床，本課題組對(duì)其進(jìn)行最佳炮制工藝探索。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-20AT型高效液相色譜儀(SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器)(日本島津公司)、BP211D型萬(wàn)分之一電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)、FN1004N型十萬(wàn)分之一電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)、PHS-3C精密數(shù)顯臺(tái)式酸度計(jì)PH計(jì)(上海雷磁儀器有限公司)、RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(BUCHI)、KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、XL-10B型500g密封型搖擺式高速粉碎機(jī)(廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司)、SHZ-D(III)型循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)、榨汁機(jī)JYZ-D57(九陽(yáng))。

1.2 試藥 洋金花(產(chǎn)地安徽)和生姜(產(chǎn)地山東)，購(gòu)自南京海源中藥飲片公司，并經(jīng)南京海源中藥飲片有限公司首席質(zhì)量官執(zhí)業(yè)中藥師丁斐鑒定，洋金花Daturaeflos為茄科植物白花曼陀羅DaturametelL.干燥花。氫溴酸東莨菪堿對(duì)照品(成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)18113008，純度≥98%)。磷酸鈉、十二烷基硫酸鈉、磷酸、鹽酸、濃氨水、三氯甲烷均為分析純，乙腈為色譜純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 制洋金花中東莨菪堿含量測(cè)定方法的建立[1]

2.1.1 色譜條件 YMC-Pack ODS-A色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.07 mol/L磷酸鈉溶液(含0.0175 mol/L十二烷基硫酸鈉，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至6.0)(50∶100)為流動(dòng)相；流速：1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為216 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。氫溴酸東莨菪堿對(duì)照品和供試品的HPLC圖譜如圖1所示。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 取氫溴酸東莨菪堿對(duì)照品適量，精密稱定，加“2.1.1項(xiàng)下”流動(dòng)相制成每1 mL含0.679 mg的溶液，即得(東莨菪堿重量=氫溴酸東莨菪堿重量/1.445)。

2.1.3 供試品溶液的制備 取制洋金花樣品粉末(過(guò)三號(hào)篩)約1 g，精密稱定，置錐形瓶中，加入2 mol/L鹽酸溶液10 mL，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，濾過(guò)，濾渣和濾器用2 mol/L鹽酸溶液10 mL分?jǐn)?shù)次洗滌，合并濾液和洗液，用濃氨試液調(diào)節(jié)pH值至9，用三氯甲烷振搖提取4次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，回收溶劑至干，殘?jiān)昧鲃?dòng)相溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加“2.1.1項(xiàng)下”流動(dòng)相至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL各置于1 mL容量瓶中，加“2.1.1項(xiàng)下”流動(dòng)相定容至刻度，搖勻，制得13.58、27.16、40.74、54.32、67.90 μg/mL。分別吸取對(duì)照品溶液各10 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積值。將所得峰面積(Y)與對(duì)照品的濃度(X)進(jìn)行線性回歸，得氫溴酸東莨菪堿回歸方程、相關(guān)系數(shù)(R)及線性范圍為Y=12071X+148，R=0.9999，135.8～679 μg/mL。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄氫溴酸東莨菪堿峰面積和保留時(shí)間值，并計(jì)算RSD值，面積和保留時(shí)間RSD值分別為1.18%、0.66%，說(shuō)明該方法精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 于0、2、4、8、12、24 h精密吸取按“2.1.3”項(xiàng)下制備的供試品溶液10 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄氫溴酸東莨菪堿峰面積和保留時(shí)間值，計(jì)算 RSD值，面積和保留時(shí)間RSD值分別為1.77%、1.00%，說(shuō)明供試品溶液在24 h內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 制洋金花樣品粉末混合均勻分成6份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備得供試品溶液，分別吸取10 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄氫溴酸東莨菪堿含量和保留時(shí)間值，并計(jì)算RSD值，氫溴酸東莨菪堿平均含量0.15%，含量和保留時(shí)間RSD值分別為1.35%、0.72%，說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 制洋金花樣品粉末9份，每份0.5 g，各加入對(duì)照品溶液0.9、0.9、0.9、1.1、1.1、1.1、1.3、1.3、1.3 mL，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在三氯甲烷溶解蒸干后的殘?jiān)杏昧鲃?dòng)相溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加“2.1.1項(xiàng)下”流動(dòng)相至刻度。按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積值，計(jì)算回收率以及RSD值，氫溴酸東莨菪堿平均回收率為103.76%，RSD為1.40%，說(shuō)明該方法具有良好的準(zhǔn)確度，具體見(jiàn)表1。

表1 回收率測(cè)定結(jié)果 (n=9)

2.2 制洋金花炮制工藝單因素考察

2.2.1 生姜加水量考察 取50 g洋金花樣品，生姜用量12.5 g，榨汁機(jī)打汁后得到生姜汁10 mL，加水量見(jiàn)生姜打汁后加水量考察表，25 ℃下悶潤(rùn)30 min后切碎，炒制溫度190～220 ℃(500 W)，炒制時(shí)間5 min，樣品的溫度降到29～30 ℃時(shí)，噴灑60°白酒6.25 g，25 ℃下悶潤(rùn)30 min后晾干。按“2.1”項(xiàng)測(cè)定東莨菪堿含量。生姜打汁后加水量考察見(jiàn)表2。由表2可知，生姜打汁后加水量為2倍生姜汁體積的水(20 mL)、3倍生姜汁體積的水(30 mL)、4倍生姜汁體積的水(40 mL)時(shí)，東莨菪堿含量較高。

表2 生姜打汁后加水量考察表

2.2.2 悶潤(rùn)時(shí)間考察 取50 g洋金花樣品，生姜用量12.5 g，榨汁機(jī)打汁后得到生姜汁10 mL，加3倍生姜汁體積的水(30 mL)，25 ℃下悶潤(rùn)后切碎，悶潤(rùn)時(shí)間見(jiàn)悶潤(rùn)時(shí)間考察表，炒制溫度190～220 ℃(500 W)，炒制時(shí)間5 min，樣品的溫度降到29～30 ℃時(shí)，噴灑60°白酒6.25 g，25 ℃下悶潤(rùn)30 min后晾干。按“2.1”項(xiàng)測(cè)定東莨菪堿含量。悶潤(rùn)時(shí)間考察見(jiàn)表3。由表3可知，悶潤(rùn)時(shí)間為30 min、40 min、50 min時(shí)，東莨菪堿含量較高。

表3 悶潤(rùn)時(shí)間考察表

2.2.3 炒制溫度考察 取50 g洋金花樣品，生姜用量12.5 g，榨汁機(jī)打汁后得到生姜汁10 mL，加3倍生姜汁體積的水(30 mL)，25 ℃下悶潤(rùn)30 min后切碎，炒制溫度見(jiàn)炒制溫度考察表，炒制時(shí)間5 min，樣品的溫度降到29～30 ℃時(shí)，噴灑60°白酒6.25 g，25 ℃下悶潤(rùn)30 min后晾干。按“2.1”項(xiàng)測(cè)定東莨菪堿含量。炒制溫度考察見(jiàn)表4。由表4可知，炒制溫度為100～130 ℃、190～220 ℃、270～300 ℃時(shí)，東莨菪堿含量較高。

表4 炒制溫度考察表

2.2.4 炒制時(shí)間的考察 取50 g洋金花樣品，生姜用量12.5 g，榨汁機(jī)打汁后得到生姜汁10 mL，加3倍生姜汁體積的水(30 mL)，25 ℃下悶潤(rùn)30 min后切碎，炒制溫度190～220 ℃(500 W)，炒制時(shí)間見(jiàn)炒制時(shí)間考察表，樣品的溫度降到29～30 ℃時(shí)，噴灑60°白酒6.25 g，25 ℃下悶潤(rùn)30 min后晾干。按“2.1”項(xiàng)測(cè)定東莨菪堿含量。炒制時(shí)間考察見(jiàn)表5。由表5可知，炒制時(shí)間為5 min、6 min、7 min時(shí)，東莨菪堿含量較高。

表5 炒制時(shí)間考察表

2.3 制洋金花炮制工藝正交試驗(yàn)

2.3.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，取洋金花樣品選擇生姜打汁后加水量(A)、悶潤(rùn)時(shí)間(B)、炒制溫度(C)、炒制時(shí)間(D)為考察因素，以東莨菪堿含量和水分含量評(píng)價(jià)為指標(biāo)，進(jìn)行正交設(shè)計(jì)安排實(shí)驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表6。

表6 因素水平

2.3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 采用L9(34)表安排試驗(yàn)，以東莨菪堿含量和水分含量評(píng)價(jià)為指標(biāo)，制洋金花中水分測(cè)定方法見(jiàn)2015版《中國(guó)藥典》通則0832第二法[7]。以綜合加權(quán)評(píng)分法來(lái)評(píng)價(jià)，評(píng)分方法為東莨菪堿含量占80%，水分含量占20%。東莨菪堿含量和水分含量的滿分均為10分，綜合評(píng)價(jià)=東莨菪堿含量/最大的東莨菪堿含量×10×80%+水分含量評(píng)價(jià)/最大的水分含量評(píng)價(jià)×10×20%。水分含量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如表7，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表8，方差分析見(jiàn)表9。

表7 水分含量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

表8 制洋金花L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表9 方差分析

由方差分析可知，生姜加水量對(duì)于制洋金花的炮制工藝具有顯著性影響，其影響因素重要性為：生姜打汁后加水量>炒制時(shí)間>炒制溫度>悶潤(rùn)時(shí)間。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，第5組實(shí)驗(yàn)綜合評(píng)價(jià)最高，其中東莨菪堿含量和水分含量評(píng)價(jià)均為最高值，所以選擇第5組實(shí)驗(yàn)方法為最優(yōu)炮制工藝，即取50 g洋金花樣品，用生姜12.5 g打汁后加3倍生姜汁體積的水(30 mL)，25 ℃下悶潤(rùn)40 min后切碎，在270～300 ℃下炒制5 min，29～30 ℃下噴灑6.25 g的60°白酒后，25 ℃下悶30 min，晾干。

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 采用確定的最優(yōu)炮制工藝條件，取洋金花樣品進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，計(jì)算東莨菪堿含量和水分，3次測(cè)定結(jié)果均優(yōu)于正交試驗(yàn)各工藝結(jié)果，說(shuō)明制洋金花的炮制工藝合理可行，結(jié)果見(jiàn)表10。

表10 驗(yàn)證試驗(yàn)

3 討論

生姜加水量范圍選擇，潤(rùn)透洋金花藥材考察得出，低于2倍生姜汁體積的水(20 mL)，洋金花藥材沒(méi)有潤(rùn)濕完全，高于5倍生姜汁體積的水(50 mL)，洋金花藥材過(guò)于潤(rùn)濕，有滴水現(xiàn)象。對(duì)炮制工藝中的噴灑60°白酒進(jìn)行考察，選取藥材溫度和噴灑60°白酒后的藥材悶潤(rùn)時(shí)間進(jìn)行考察，藥材溫度過(guò)高時(shí)噴灑過(guò)白酒的藥材進(jìn)行悶潤(rùn)，白酒揮發(fā)快，本項(xiàng)炮制工藝消耗時(shí)間短，結(jié)果酒味淡；藥材溫度過(guò)低時(shí)噴灑過(guò)白酒藥材悶潤(rùn)后，白酒揮發(fā)慢，本項(xiàng)炮制工藝消耗時(shí)間長(zhǎng)，結(jié)果酒味濃。本項(xiàng)炮制工藝優(yōu)選藥材溫度降到29～30 ℃時(shí)，噴灑60°白酒，25 ℃下悶潤(rùn)30 min后晾干，使炮制后的飲片有酒香氣，同時(shí)本項(xiàng)炮制工藝用時(shí)短，展示出本項(xiàng)炮制工藝效率。

在制洋金花的單因素考察中選取東莨菪堿含量為指標(biāo)，但在炮制過(guò)程中發(fā)現(xiàn)雖然水分在上海市中藥飲片炮制規(guī)范[6]中沒(méi)有明確規(guī)定，但其會(huì)影響貯藏時(shí)間、外觀等方面，在正交試驗(yàn)中以水分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以2015版《中國(guó)藥典》對(duì)洋金花水分[1]規(guī)定的不超過(guò)11%為上限，下限不低于5%，制洋金花炒制后表面太干燥，水分含量太少，外觀變形難識(shí)別，造成其性狀鑒別難度。

洋金花作為一種毒性藥材，臨床上多有不良反應(yīng)報(bào)道，本項(xiàng)研究對(duì)制洋金花進(jìn)行炮制工藝研究，運(yùn)用正交試驗(yàn)對(duì)制洋金花的炮制工藝研究，為其他研究工作者提供制洋金花的炮制工藝參考，提高制洋金花的內(nèi)在質(zhì)量穩(wěn)定性，同時(shí)在建立藥材內(nèi)在質(zhì)量穩(wěn)定性的情況下，才有藥材功效和毒性的穩(wěn)定性。優(yōu)化制洋金花的炮制工藝有利于其質(zhì)量控制和臨床用藥安全，下一步將開(kāi)展制洋金花的毒性試驗(yàn)研究，同時(shí)查找出制洋金花中的毒性標(biāo)記物成分。