基于多息薄層色譜法的黃甲軟肝顆粒的鑒別研究

王宗權(quán) 黃朝情 黃志輝 高 進(jìn) 張麗麗 張保獻(xiàn)* 滕利榮

1.盈科瑞(珠海)創(chuàng)新醫(yī)藥制造有限公司，廣東 珠海 519040；2.北京盈科瑞藥物研究院有限公司，北京 102200；3.盈科瑞(橫琴)藥物研究院有限公司/國(guó)家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心新型遞藥系統(tǒng)分中心/廣東省霧化吸入制劑工程技術(shù)研究中心，廣東 珠海 519000；4.吉林大學(xué)珠海學(xué)院，廣東 珠海 519041

黃甲軟肝顆粒是純中藥復(fù)方制劑，由黃芪、鱉甲、靈芝、丹參等10 味中藥組成。具有益氣舒肝、活血軟堅(jiān)的功效。用于肝纖維化和早期肝硬化脾虛肝郁，氣血瘀阻證。癥見脅肋刺痛或脹痛，食欲不振，脘腹脹滿，大便溏爛，神疲乏力，面色晦暗，舌暗，苔薄，脈弦。薄層色譜法是中藥復(fù)方制劑鑒別中最常用的定性方法，具有分離效率高、操作方便、分析速度快、專屬性好等特點(diǎn)[1]。近年來(lái)，隨著新方法、新技術(shù)的應(yīng)用，薄層色譜鑒別技術(shù)取得了長(zhǎng)足的發(fā)展，如中藥薄層指紋圖譜[2]、加壓薄層色譜[3]、微乳薄層色譜[4]、二維薄層色譜[5]等。但目前常用的薄層色譜鑒別法多為一塊薄層板檢測(cè)一種供試品，使用一種展開劑及顯色劑的情況下，多數(shù)可鑒別出一種或兩種藥味，并且樣品前處理復(fù)雜。基于多息法、整體觀在中藥質(zhì)量控制中的應(yīng)用，針對(duì)中藥薄層色譜鑒別法的現(xiàn)狀，提出了多息薄層色譜鑒別法[6]。探索中藥復(fù)方制劑的多息薄層色譜鑒別技術(shù)，有利于提升中藥復(fù)方制劑的檢驗(yàn)水平，減少檢測(cè)成本，節(jié)約檢測(cè)時(shí)間和降低環(huán)境污染。本研究對(duì)黃甲軟肝顆粒中的黃芪、丹參、三七、葛根、赤芍、柴胡建立了多息薄層色譜鑒別方法，在2塊薄層板上鑒別了6味藥，為建立中藥復(fù)方制劑的快速薄層色譜鑒別方法提供了思路。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 HWS-26型數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；SQP型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；KQ-500DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；WFH-201B型暗箱式紫外分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)；DHG-9070A型鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；硅膠G薄層板(青島海洋化分廠，10 cm×20 cm，厚度：0.2～0.25 mm)；硅膠 G薄層板(煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所，10 cm×20 cm，厚度：0.2～0.25 mm)；點(diǎn)樣方式：接觸式條帶狀點(diǎn)樣。

1.2 試劑與試藥 香草醛、甲醇、三氯甲烷、甲苯、對(duì)二甲氨基苯甲醛、乙酸乙酯、乙醚、正丁醇、氨試液、硫酸等均為分析純。

黃芪甲苷對(duì)照品(批號(hào)：110781-201717)；葛根素對(duì)照品(批號(hào)：110752-201816)；芍藥苷對(duì)照品(批號(hào)：110736-201943)；丹參酮IIA對(duì)照品(批號(hào)：110766-201721)；三七皂苷R1對(duì)照品(批號(hào)：110745-201820)；柴胡皂苷a對(duì)照品(批號(hào)：110777-201912)；柴胡皂苷d對(duì)照品(批號(hào)：110778-201912)；三七對(duì)照藥材(批號(hào)：120941-201409)；柴胡對(duì)照藥材(批號(hào)：120992-201509)均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。

黃甲軟肝顆粒，批號(hào)：20190615，由盈科瑞(橫琴)藥物研究院有限公司提供。

各藥味陰性樣品，是從處方中減去待鑒別藥味后按照已經(jīng)確定的工藝條件制備而成，均由盈科瑞(橫琴)藥物研究院有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 丹參、葛根、赤芍薄層鑒別

2.1.1 樣品的制備 稱取供試品顆粒3 g，研細(xì)，加入甲醇10 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液40 ℃揮干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另分別取缺丹參的陰性樣品、缺葛根的陰性樣品、缺赤芍的陰性樣品各3 g，同法制成陰性樣品溶液。再分別取丹參酮IIA、葛根素及芍藥苷對(duì)照品適量，分別加甲醇制成1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.1.2 展開顯色 吸取上述供試品溶液4 μL和陰性樣品溶液各4 μL、對(duì)照品溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，使呈條帶狀，先以三氯甲烷-甲醇-水(7∶2.5∶0.25)為展開劑，展開，展至約5 cm，取出，晾干，再以甲苯-乙酸乙酯(24∶1)為展開劑，展開，展至約8 cm，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，置105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，分別置日光和紫外光燈(365 nm)下檢視。

2.1.3 結(jié)果 供試品色譜中，丹參酮IIA對(duì)照品顯示紅色的斑點(diǎn)，樣品中相應(yīng)的位置上有紅色的斑點(diǎn)較明顯，對(duì)應(yīng)的陰性樣品無(wú)干擾。葛根素對(duì)照品顯示藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，樣品中相應(yīng)的位置上有藍(lán)色熒光斑點(diǎn)較明顯，對(duì)應(yīng)的陰性樣品無(wú)干擾。芍藥苷對(duì)照品顯示藍(lán)紫色的斑點(diǎn)，樣品中相應(yīng)的位置上有藍(lán)紫色的斑點(diǎn)，對(duì)應(yīng)的陰性樣品無(wú)干擾。如圖1所示。

2.2 黃芪、三七、柴胡薄層鑒別

2.2.1 樣品的制備 稱取供試品顆粒3 g，研細(xì)，加入甲醇25 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液水浴蒸干，殘?jiān)铀?5 mL使溶解，用乙醚振搖提取3次，每次25 mL，棄去乙醚液，水液用水飽和正丁醇振搖提取2次，每次25 mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌3次，每次25 mL，棄去氨試液，用正丁醇飽和水洗滌2次，每次20 mL，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另分別取缺黃芪的陰性樣品、缺三七的陰性樣品、缺柴胡的陰性樣品各3 g，同法制成陰性樣品溶液。再分別取黃芪甲苷、三七皂苷R1及柴胡皂苷a對(duì)照品適量，分別加甲醇制成1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。繼取三七對(duì)照藥材0.5 g，加水25 mL回流提取30 min，放冷，濾過(guò)，濾液自“用乙醚振搖提取3次”起，同法制成對(duì)照藥材溶液。

2.2.2 展開顯色 吸取上述供試品溶液和陰性樣品溶液各4 μL、對(duì)照品溶液和對(duì)照藥材溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，使呈條帶狀，以正丁醇-乙酸乙酯-水(4∶3∶5)的上層溶液為展開劑，展開，展至約17 cm，取出，晾干，噴以含2%對(duì)二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液，80 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，分別置日光和紫外光燈(365 nm)下檢視。

2.2.3 結(jié)果 供試品色譜中，黃芪甲苷對(duì)照品顯示棕褐色斑點(diǎn)，樣品中相應(yīng)的位置上有棕褐色斑點(diǎn)，對(duì)應(yīng)的陰性樣品無(wú)干擾。三七對(duì)照藥材顯示4個(gè)紫色的斑點(diǎn)，樣品中相應(yīng)的位置上有紫色的斑點(diǎn)，三七皂苷R1對(duì)照品相應(yīng)位置上有相同的紫色斑點(diǎn)，對(duì)應(yīng)的陰性樣品無(wú)干擾。柴胡皂苷a對(duì)照品顯示黃綠色的熒光斑點(diǎn)，樣品中相應(yīng)的位置上有黃綠色的熒光斑點(diǎn)較明顯，對(duì)應(yīng)的陰性樣品無(wú)干擾。如圖2所示。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)按照處方中所含有藥味主要的化學(xué)成分的極性進(jìn)行初步分類，并且參照處方組成以及制備工藝，將欲鑒別的黃甲軟肝顆粒中6味藥，分為皂苷類成分及其他類成分。對(duì)藥典中各藥味的鑒別方法進(jìn)行細(xì)致分析，由于有些供試品制備過(guò)程及所用展開劑極性相似，故嘗試同步檢識(shí)。再查閱相關(guān)文獻(xiàn)，摸索不同比例的展開劑，經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，尋找合適的展開條件。

其他類成分(比如黃酮類、單萜類、菲醌類)制備方法簡(jiǎn)單，直接用甲醇超聲提取制備。而皂苷類成分因樣品成分復(fù)雜，干擾較大，故將樣品前處理方法加以改進(jìn)。設(shè)計(jì)了2種供試品溶液的制備方法：①采用甲醇直接超聲提取制備；②采用甲醇超聲提取，乙醚萃取后棄掉，再用水飽和正丁醇萃取制備(用氨試液及正丁醇飽和水溶液洗滌)。結(jié)果表明，三味藥(丹參、葛根、赤芍)采用方法①可以達(dá)到斑點(diǎn)清晰，分離效果好，簡(jiǎn)便易行。另三味藥(黃芪、三七、柴胡)需采用方法②可以達(dá)到斑點(diǎn)清晰，分離效果好。由于黃芪、三七、柴胡均含皂苷類化合物，易溶于水、醇類等極性較大的溶劑，在水飽和正丁醇中有較大的溶解度。本研究用乙醚除去部分脂溶性雜質(zhì)，在水飽和正丁醇中提取。又由于一些黃酮類化合物對(duì)皂苷類化合物的薄層鑒別干擾較大，故萃取液必須進(jìn)行堿化，洗滌掉部分干擾成分，還可以使黃芪甲苷的含量提高(黃芪皂苷I、黃芪皂苷II堿化后可以轉(zhuǎn)化為黃芪甲苷)。這樣就得到了清晰的薄層色譜圖，陰性無(wú)干擾。

研究中采用硅膠預(yù)制薄層板考察了不同展開劑系統(tǒng)及比例的展開效果。在丹參、葛根、赤芍的薄層鑒別中，參考葛根藥材的展開劑三氯甲烷-甲醇-水(7∶2.5∶0.25)[7]進(jìn)行展開，由于丹參酮IIA在此條件下展開效果不好，故參考丹參藥材薄層檢測(cè)的二次展開方法對(duì)丹參酮IIA進(jìn)行鑒別，結(jié)果陰性無(wú)干擾，專屬性強(qiáng)，適合作為黃甲軟肝顆粒中丹參、葛根、赤芍薄層鑒別方法。在黃芪、三七、柴胡的薄層鑒別中，對(duì)展開劑進(jìn)行了選擇對(duì)比，正丁醇-乙酸乙酯-水(4∶3∶5)；三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)；三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)[8]等展開條件，經(jīng)多次展開試驗(yàn)，優(yōu)選出正丁醇-乙酸乙酯-水(4∶3∶5)為試驗(yàn)展開條件，其他展開劑下易出現(xiàn)邊緣效應(yīng)且樣品斑點(diǎn)分離度較差。根據(jù)文獻(xiàn)[9]報(bào)道，柴胡皂苷d的醚鍵在高溫或酸性條件下可斷裂生成柴胡皂苷b2。而黃甲軟肝顆粒制備時(shí)柴胡經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間水煮，故本方不能使用柴胡對(duì)照藥材及柴胡皂苷d來(lái)鑒別。

多息薄層鑒別法的優(yōu)勢(shì)在于實(shí)現(xiàn)了一板多信息鑒別，完成了6味藥的鑒別。樣品處理和展開程序及成本大大降低，有效提高了檢測(cè)效率，節(jié)約了成本，突破了藥典的傳統(tǒng)鑒別模式。本研究建立了黃甲軟肝顆粒的多息薄層色譜鑒別法，探索了一種簡(jiǎn)便、省時(shí)、高效的鑒別方法，提升了黃甲軟肝顆粒的質(zhì)量控制水平，為中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量控制提供了思路。