諾鄧火腿加工過程中細(xì)菌群落的動(dòng)態(tài)變化

王馨蕊,史 巧,*,劉畢琴,雷永德,湯回花,張紹智,張軍軍,李 宏,*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,云南昆明 650000; 2.云南瑞通牧業(yè)科技開發(fā)有限公司,云南大理 671000)

諾鄧火腿出產(chǎn)于云南滇西的千年白族古村諾鄧村?；鹜纫援?dāng)?shù)厣B(yǎng)豬為原料,用獨(dú)特的井鹽腌制[1],經(jīng)過復(fù)雜的加工后,在當(dāng)?shù)販睾偷臍夂蛳陆?jīng)過至少10個(gè)月的發(fā)酵,形成了富有特色的諾鄧火腿,其與宣威火腿、鶴慶圓腿并稱為云南三大著名火腿。

在火腿成熟過程中微生物對風(fēng)味的形成起著一定的關(guān)鍵作用[2],自然發(fā)酵火腿中微生物的群落組成和消長受氣候及地域的影響,這也決定了火腿的特色。國內(nèi)開展了金華火腿、云南火腿等微生物區(qū)系的研究[3-5],大部分是基于純培養(yǎng)的方法,再利用微生物的形態(tài)學(xué)、生理生化特性或者測序進(jìn)行鑒定,工作量相對較大,也容易遺漏一些不可培養(yǎng)的微生物,不能完整的反映火腿中微生物組成情況。下一代測序技術(shù)(next generation sequencing)作為一種高效的方法,在傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物研究中已經(jīng)有廣泛運(yùn)用[6]。運(yùn)用高通量測序技術(shù),能夠更全面、真實(shí)的掌握發(fā)酵過程中微生物的種群結(jié)構(gòu)和變化。

火腿中細(xì)菌多樣性的研究,現(xiàn)多集中于不同年限成品火腿及其表面的微生物。黨喜軍[7]研究了不同年份的成品諾鄧火腿,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵3年的火腿較1、2和4年的樣品表面細(xì)菌多樣性更高,葡萄球菌屬、嗜冷桿菌屬、Solitalea和志賀氏菌屬為優(yōu)勢細(xì)菌。郭明亮[8]對發(fā)酵4個(gè)月、2年的金華火腿和成品宣威火腿的細(xì)菌菌群進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)檸檬酸菌屬、嗜冷桿菌屬、庫爾特氏桿菌屬、葡萄球菌屬、耶爾森氏菌屬、魏斯氏菌屬、乳桿菌屬和芽孢桿菌屬為主要菌群。母雨等[9]對來自3個(gè)不同地區(qū)的盤縣火腿開展研究,發(fā)現(xiàn)成品盤縣火腿中的優(yōu)勢細(xì)菌來自葡萄球菌屬和鹽單胞菌屬。對于諾鄧火腿各加工階段內(nèi)部細(xì)菌群落動(dòng)態(tài)變化還未有報(bào)道。本研究通過MiSeq平臺(tái)對諾鄧火腿內(nèi)部細(xì)菌測序,并測定火腿部分理化指標(biāo),分析比較諾鄧火腿加工過程中不同階段的細(xì)菌組成和變化,結(jié)合與各理化指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性分析,以期為開發(fā)針對諾鄧火腿特點(diǎn)的發(fā)酵劑提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

諾鄧火腿 原料來自當(dāng)?shù)貍鹘y(tǒng)工藝加工廠家;酚酞(C2OH14O4)、氫氧化鈉(NaOH)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、谷氨酸(C5H9NO4)、茚三酮(C9H6O4)、鉻酸鉀(K2CrO4)、硝酸(HNO3)、硝酸銀(AgNO3)、鹽酸(HCl)、基準(zhǔn)氯化鈉(NaCl)、無水乙醇(CH3CH2OH) 均為國產(chǎn)分析純試劑。

DHG-9140A鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;GYW-1W水分活度測定儀 深圳冠亞水分儀科技有限公司;AUY220電子天平 島津制作所;XW-80A渦旋振蕩器 上海精科實(shí)業(yè)有限公司;KQ5200E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;XMTD-7000電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司;3H16RI高速冷凍離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司;FiveEasy Plus pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;MULTISKAN GO酶標(biāo)儀 Thermo Fisher Scientific。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集 選擇十二支重量接近的洋三元豬后腿隨機(jī)編號,并作統(tǒng)一處理和后續(xù)管理,在4個(gè)不同的加工時(shí)期以相同的方式在半膜肌部位取樣,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3支,取樣階段分別為腌制期(上3次鹽后)、風(fēng)干期(上掛48 d)、發(fā)酵期(上掛104 d)、成熟期(上掛278 d),相應(yīng)的編號為S1、S2、S3、S4。用于理化性質(zhì)測定的樣品為半膜肌內(nèi)部中心瘦肉;用于高通量測序的樣品需灼燒半膜肌表面,在無菌操作下切取內(nèi)部約1 g瘦肉,置于無菌凍存管中,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 理化性質(zhì)測定 水分含量的測定參照GB 5009.3-2016《食品中水分的測定》中的直接干燥法。氯化物含量的測定參照GB 5009.44-2016《食品中氯化物的測定》中的直接滴定法。酸堿度的測定參照GB 5009.237-2016《食品pH的測定》。游離氨基酸含量的測定,以劉慧燕等[10]方法作為參考,略作調(diào)整后方法如下:反應(yīng)體系為1 mL樣品溶液+0.5 mL pH8.0的磷酸鹽緩沖液+0.5 mL 2%茚三酮的溶液,反應(yīng)液水浴加熱15 min,冷卻10 min后蒸餾水定容至25 mL,靜置10 min,在570 nm處測定吸光度,以谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1.4933x-0.0801,R2=0.9968。以上理化指標(biāo)均設(shè)三個(gè)重復(fù),利用Excel 2010軟件對測定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

1.2.3 DNA抽提和PCR擴(kuò)增 根據(jù)FastDNA? SPIN Kit for Soil(MP Biomedicals,Solon,OH,U.S.)說明書進(jìn)行微生物群落總DNA抽提,使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質(zhì)量,使用NanoDrop2000測定DNA 濃度和純度;使用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對16S rRNA基因V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增程序如下:95 ℃預(yù)變性3 min,27個(gè)循環(huán)(95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s),然后72 ℃穩(wěn)定延伸10 min,最后在4 ℃進(jìn)行保存(PCR儀:ABI GeneAmp? 9700型)。PCR反應(yīng)體系為:5×TransStart FastPfu緩沖液4 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2 μL,上游引物(5 μmol/L)0.8 μL,下游引物(5 μmol/L)0.8 μL,TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL,模板DNA 10 ng,補(bǔ)足ddH2O至20 μL。每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)。

表1 諾鄧火腿理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of Nuodeng dry-cured ham

1.2.4 Illumina MiSeq測序 將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物,利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences,Union City,CA,USA)進(jìn)行回收產(chǎn)物純化,2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并用QuantusTMFluorometer(Promega,USA)對回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測定量。使用NEXTFLEX? Rapid DNA-Seq Kit進(jìn)行建庫:a.接頭鏈接;b.使用磁珠篩選去除接頭自連片段;c.利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫模板的富集;d.磁珠回收PCR產(chǎn)物得到最終的文庫。利用Illumina公司的MiSeq PE300平臺(tái)進(jìn)行測序 上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用fastp[11](https://github.com/OpenGene/fastp,version 0.20.0)軟件對原始測序序列進(jìn)行質(zhì)控,使用FLASH[12](http://www.cbcb.umd.edu/software/flash,version 1.2.7)軟件進(jìn)行拼接:

a.過濾reads尾部質(zhì)量值20以下的堿基,設(shè)置50 bp的窗口,如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20,從窗口開始截去后端堿基,過濾質(zhì)控后50 bp以下的reads,去除含N堿基的reads。

b.根據(jù)PE reads之間的重疊區(qū)域(overlap)關(guān)系,將成對reads拼接(merge)成一條序列,最小overlap長度為10 bp。

c.拼接序列的overlap區(qū)允許的最大錯(cuò)配比率為0.2,篩選不符合序列。

d.根據(jù)序列首尾兩端的核苷酸標(biāo)簽(barcode)和引物區(qū)分樣品,并調(diào)整序列方向,barcode允許的錯(cuò)配數(shù)為0,最大引物錯(cuò)配數(shù)為2。

使用UPARSE[13]軟件(http://drive5.com/uparse/,version 7.1),根據(jù)97%[13-14]的相似度對序列進(jìn)行OTU聚類并剔除嵌合體。利用RDP classifier[15](http://rdp.cme.msu.edu/,version 2.2)對每條序列進(jìn)行物種分類注釋,比對Silva 16S rRNA數(shù)據(jù)庫(v138),設(shè)置比對閾值為70%。

2 結(jié)果與分析

2.1 諾鄧火腿加工過程中理化性質(zhì)的變化

諾鄧火腿在四個(gè)時(shí)期主要理化指標(biāo)結(jié)果見表1。含水量隨著發(fā)酵的進(jìn)行,總體呈下降趨勢。風(fēng)干期(S2)空氣比較干燥,含水量下降較快。5月雨水較多,空氣濕度大,發(fā)酵期(S3)的火腿含水量有小幅增加[16]。經(jīng)過9個(gè)多月的發(fā)酵后,火腿中的含水量最終降到33.40%左右。已有的研究發(fā)現(xiàn)諾鄧火腿成品腿的含水量在30.66%～35.22%左右[7,17]。繆婷等[18]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過9個(gè)月發(fā)酵的云腿,含水量為43.45%。李澤眾等[19]對三川火腿的研究顯示,第320 d時(shí)火腿中的水分含量為44.27%?？傮w上看,諾鄧火腿半膜肌部位相較于云南其他地域的火腿,含水量偏低。

腌制期鹽含量較低,鹽含量約為4.95%。隨著火腿不斷失水,鹽含量相應(yīng)地升高,在風(fēng)干期達(dá)到7.21%。雨季來臨后,含水量的增加稍微降低了火腿中鹽含量,成熟期的火腿鹽含量在6.7%。食鹽含量在1%～3%時(shí)可以抑制一些微生物的生長,當(dāng)達(dá)到10%～15%的含鹽量時(shí),只有少部分耐鹽微生物能夠生長。高鹽含量的火腿雖然不易變質(zhì),但是由于內(nèi)源酶和微生物受到抑制也不會(huì)產(chǎn)生火腿特有的香味[20]。并且攝入過多的氯化鈉會(huì)對人的心血管健康造成影響[21]?？婃玫妊芯康脑仆塞}分含量為9.62%[18],發(fā)酵12個(gè)月的宣威火腿鹽含量為10.97%[22],15個(gè)月的大河烏豬火腿食鹽含量為10.05%[23],諾鄧火腿較其他品類的火腿含鹽量比較適中。

火腿的酸堿度在各個(gè)時(shí)期各有不同。腌制期pH較低,風(fēng)干期由于蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的堿性物質(zhì)[4,24],pH增加至6.10。發(fā)酵期可能由于溫度較高,產(chǎn)酸細(xì)菌大量繁殖和代謝,酸堿度有一定幅度的降低,適當(dāng)?shù)乃峄梢援a(chǎn)生一些風(fēng)味上的變化[25]。隨著火腿的不斷發(fā)酵成熟,pH呈現(xiàn)上升的趨勢,成熟期達(dá)到6.05左右,與黨喜軍測定的1年諾鄧火腿pH基本一致[7]。其他品類的火腿pH基本在5.58～6.75之間[18,22,26-27]。

諾鄧火腿中的游離氨基酸含量,隨著時(shí)間的推移不斷增加,成熟期增加速度較快,9個(gè)多月后達(dá)到了1862.33 mg/100 g。蛋白質(zhì)水解可產(chǎn)生大量小肽和游離氨基酸,火腿中的非蛋白氮70%～80%為多肽氮和氨基酸態(tài)氮[28]。游離氨基酸本身是火腿中重要的滋味物質(zhì)和營養(yǎng)成分,一些特定的氨基酸形成揮發(fā)性香氣的前體物質(zhì),氨基酸與其他化合物參與美拉德反應(yīng)可以產(chǎn)生小分子香氣成分[29]。根據(jù)現(xiàn)有報(bào)道,一年左右的火腿游離氨基酸含量在1.97%～3.67%[7,19],與本實(shí)驗(yàn)當(dāng)年腌制的不足一年火腿蛋白質(zhì)降解趨勢吻合。

2.2 測序結(jié)果及Alpha多樣性

分別對4個(gè)不同加工階段,共12個(gè)諾鄧火腿樣本內(nèi)部的細(xì)菌16S rRNA V3-V4區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增,獲得有效序列數(shù)目為587967 reads,有效堿基251376192 bp,序列平均長度約為428 bp。由于不同樣本具有個(gè)體差異性,為使各樣本在相同OTU序列數(shù)水平上進(jìn)行對比,保留至少在3個(gè)樣本中的序列數(shù)都大于等于5的OTU,按最小樣本序列數(shù)將所有樣本的序列隨機(jī)抽取至統(tǒng)一數(shù)據(jù)量,

表2 Alpha多樣性指數(shù)表Table 2 Alpha diversity index

抽平后各樣本有效序列數(shù)為31426,有效序列總數(shù)為377112。4個(gè)時(shí)期的12個(gè)樣本細(xì)菌分類統(tǒng)計(jì)數(shù)目為7門,11綱,25目,47科,83屬,130個(gè)OTU。

通過統(tǒng)計(jì)隨機(jī)抽取的序列對應(yīng)樣本的Alpha多樣性指數(shù),繪制出稀釋曲線,若曲線較為平緩,則本次測序數(shù)據(jù)量是足夠的[30]。圖1為基于豐富度實(shí)際觀測值sobs指數(shù)的稀釋曲線,曲線已達(dá)到平臺(tái)期說明測序量充足,大部分多樣性已經(jīng)產(chǎn)生,繼續(xù)增加測序量也很少有新物種出現(xiàn)。

圖1 稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves

各個(gè)階段內(nèi)火腿中微生物群落的多樣性可以通過Alpha多樣性來反映,常用sobs指數(shù)、Chao1指數(shù)、heip均一度指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù)等來計(jì)算和比較[31]。不同時(shí)期諾鄧火腿中細(xì)菌群落的Alpha多樣性在表2中表示,其中sobs指數(shù)、Chao1指數(shù)用來反映群落的豐富度,heip均一度指數(shù)用來反映群落的均一性,群落多樣性則通過香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù)、覆蓋率等來表示。S1的細(xì)菌豐富度最高,S4次之,S2和S3較低。S1的細(xì)菌群落分布最均勻。通過香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù)發(fā)現(xiàn)S1的多樣性最高,S4多樣性較高,S2、S3多樣性明顯低于S1、S4。

2.3 物種組成

對于火腿加工過程中內(nèi)部的細(xì)菌,已有研究者通過傳統(tǒng)培養(yǎng)的方式發(fā)現(xiàn)其總體變化趨勢。大體上從腌制期至風(fēng)干期菌落總數(shù)持續(xù)上升,從約102CFU/g增加至106CFU/g,在發(fā)酵期初期達(dá)到峰值,之后不斷減少,到成熟期只有約10CFU/g的細(xì)菌被培養(yǎng)出來[4,5,32-33],但對于考察火腿成品食用安全性有重要意義。在前人對細(xì)菌數(shù)量變化研究的基礎(chǔ)上,通過高通量測序方法更為全面的檢測,有助于進(jìn)一步了解加工過程中諾鄧火腿內(nèi)部細(xì)菌多樣性及其演變規(guī)律。

2.3.1 物種組成Venn圖分析 由OTU水平上的Venn圖(圖2)可以看出,4個(gè)不同時(shí)期的火腿微生物有61個(gè)共有OTU,其中相對豐度最高的5個(gè)屬為葡萄球菌屬(Staphylococcus)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)和希瓦氏菌屬(Shewanella),這些微生物屬于厚壁菌門及變形菌門,其他還包括氣單胞菌屬(Aeromonas)、羅爾斯通菌屬(Ralstonia)和弧菌屬(Vibrio)等38個(gè)屬的細(xì)菌,為諾鄧火腿整個(gè)發(fā)酵過程中均有出現(xiàn)的微生物。每個(gè)時(shí)期的特異性O(shè)TU數(shù)目較少,S1有1個(gè),為Weeksellaceae科細(xì)菌;S4有4個(gè),分別為沙雷氏菌屬(Serratia)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、四聯(lián)球菌屬(Tetragenococcus)和Enteractinococcus屬細(xì)菌。由于發(fā)酵進(jìn)行至S2、S3時(shí)期時(shí)細(xì)菌群落多樣性較低,S1與S2、S2與S3、S3與S4時(shí)期之間共有,且其余時(shí)期不具有的OTU數(shù)目均較少,分別為1、2、1;而S1、S4由于多樣性較高,兩者之間的共有OTU有24個(gè)。

圖2 OTU水平物種組成Venn圖Fig.2 Venn diagram on OTU level 注:S1、S2、S3、S4分別為腌制期、風(fēng)干期、 發(fā)酵期、成熟期;數(shù)字代表OTU數(shù)目。

2.3.2 門水平的群落組成 S1、S2、S3、S4四個(gè)時(shí)期在門水平上的群落組成如圖(圖3)。4個(gè)時(shí)期的主要優(yōu)勢菌有厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)。占比最高的2個(gè)門在4個(gè)時(shí)期的相對豐度依次為厚壁菌門:S2>S3>S4>S1,變形菌門:S1>S4>S3>S2。腌制期(S1)主要由變形菌門微生物組成,相對豐度約92%;風(fēng)干期(S2)和發(fā)酵期(S3)主要由厚壁菌門及變形菌門組成,兩個(gè)時(shí)期的厚壁菌門相對豐度分別為94%、92%,變形菌門相對豐度分別為6%、8%,隨著發(fā)酵的進(jìn)行,厚壁菌門微生物占比逐漸減少,而變形菌門微生物相對增多;成熟期(S4)微生物組成相對復(fù)雜,有厚壁菌門(37%)、變形菌門(61%)及放線菌門(3%),相對于發(fā)酵期,成熟期的變形菌門微生物增加,厚壁菌門微生物明顯減少。

圖3 門水平的群落組成條形圖Fig.3 Community bar plot analysis on phylum level

圖4 屬水平的群落組成熱圖Fig.4 Community heatmap on genus level

2.3.3 屬水平的群落組成 選取4個(gè)時(shí)期豐度在前50的屬,繪制群落組成heatmap(圖4)。各時(shí)期火腿中細(xì)菌在屬水平上的組成形式存在明顯差異,根據(jù)各屬在4個(gè)時(shí)期豐度的相似性進(jìn)行聚類,可以聚為5個(gè)大類。第Ⅰ類由葡萄球菌屬(Staphylococcus)、沙雷氏菌屬(Serratia)和羅爾斯通菌屬(Ralstonia)3個(gè)屬組成,這3個(gè)屬在S4階段相對豐度很高,其中葡萄球菌屬在火腿加工的各個(gè)階段較其他2個(gè)屬細(xì)菌有較高豐度,與已有研究結(jié)果一致,葡萄球菌屬細(xì)菌為火腿中最常被檢測到高豐度的細(xì)菌[2,8-9]。葡萄球菌屬是火腿發(fā)酵中重要的細(xì)菌,這類細(xì)菌含有硝酸鹽還原酶和亞硝酸鹽還原酶,能夠促進(jìn)肉質(zhì)形成理想的紅色,并且在蛋白水解酶和脂肪酶作用下能夠增加產(chǎn)品風(fēng)味,防止脂質(zhì)氧化和酸敗[34-35]。成熟的盤縣火腿中也檢測到少量豐度的Ralstonia[9],這類細(xì)菌可能參與構(gòu)成火腿成熟期獨(dú)特細(xì)菌群落。第Ⅱ類在各個(gè)時(shí)期均有較高豐度,在S1時(shí)期分布最集中,由嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、希瓦氏菌屬(Shewanella)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)組成。傳統(tǒng)分離培養(yǎng)的方法一般認(rèn)為在腌制期的火腿優(yōu)勢細(xì)菌為葡萄球菌、乳酸菌和假單胞菌,高通量測序的方法發(fā)現(xiàn)了在腌制期火腿內(nèi)部其他高豐度細(xì)菌種類。這類細(xì)菌在發(fā)酵肉制品中較為常見,董蘊(yùn)等[36]發(fā)現(xiàn)恩施臘肉中嗜冷桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬等細(xì)菌也很豐富。第Ⅲ類為相對豐度中等,且分布較均勻的屬。第Ⅳ類為相對豐度稍低的一類,在S1、S4分布較S2、S3稍高,種類比較豐富。第Ⅴ類為S4時(shí)期豐度稍高,但在其他階段豐度較低的細(xì)菌,包括Cutibacterium、考克氏菌屬(Kocuria)、四聯(lián)球菌屬(Tetragenococcus)等屬的細(xì)菌。

2.4 不同階段樣本比較

在OTU水平上,根據(jù)Bray-Curtis距離算法得到Beta多樣性距離矩陣,利用非加權(quán)組平均法(Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Mean,UPGMA)對4個(gè)時(shí)期的不同樣本進(jìn)行層級聚類(Hierarchical clustering),可以清楚地看出樣本間群落結(jié)構(gòu)的相似或差異程度(圖5)。S4時(shí)期的兩個(gè)樣本聚為一類,成熟期的火腿微生物群落不同于其他3個(gè)時(shí)期,但組內(nèi)平行樣本仍存在個(gè)體差異性,近期另一諾鄧火腿研究也發(fā)現(xiàn)成熟腿平行樣本之間存在一定細(xì)菌組成差異性[7]。S1時(shí)期樣本單獨(dú)聚成一類,可見腌制期火腿組內(nèi)樣本的細(xì)菌群落組成相似性很高,并且與其他3個(gè)時(shí)期相比較為獨(dú)特。S2與S3兩個(gè)時(shí)期的細(xì)菌群落相似性較高。外部環(huán)境及火腿內(nèi)部理化條件的不同可能是差異發(fā)生的原因,腌制期火腿內(nèi)部含水量高,適合多種微生物的生長,細(xì)菌群落較其他3個(gè)時(shí)期豐富;風(fēng)干期含水量逐步降低,鹽濃度增加,只適合一部分細(xì)菌生存;發(fā)酵期火腿內(nèi)部環(huán)境與風(fēng)干期類似,但由于空氣濕度的變化,火腿內(nèi)部細(xì)菌群落會(huì)產(chǎn)生部分差異;成熟期內(nèi)部細(xì)菌數(shù)量已經(jīng)較少[32],但環(huán)境溫度較高,內(nèi)部細(xì)菌組成較前面的加工階段有所不同,而且由于內(nèi)部復(fù)雜的理化環(huán)境影響,各個(gè)樣本之間也會(huì)產(chǎn)生不同的變化。

圖5 基于OTU水平的樣本層級聚類樹Fig.5 Hierarchical clustering tree based on OTU level

圖6 諾鄧火腿理化性質(zhì)與細(xì)菌群落相關(guān)性分析Fig.6 Correlation analysis between physicochemical properties and bacterial community of Nuodeng dry-cured ham注:A:屬水平上的冗余分析;B:豐度前10的屬與理化性質(zhì)關(guān)聯(lián)熱圖;W代表含水量、S代表鹽含量、 AA代表游離氨基酸含量、pH代表酸堿度;* 0.01

2.5 理化性質(zhì)與樣本關(guān)聯(lián)性

冗余分析(Redundancy Analysis,RDA)是環(huán)境因子約束化的PCA分析,可以將樣本和環(huán)境因子反映在同一個(gè)二維排序圖上,從圖6A中可以直觀地看出樣本分布和環(huán)境因子間的關(guān)系。圖6A中代表含水量(W)、鹽含量(S)的環(huán)境因子箭頭長度最長,表示水分和鹽含量對于不同時(shí)期樣本細(xì)菌群落組成的影響程度最大;游離氨基酸含量(AA)次之;樣品酸堿度(pH)影響較小。將各環(huán)境因子變量射線延長,4個(gè)加工時(shí)期各樣本垂直投影于射線上,投影點(diǎn)越靠近箭頭所指方向的樣本,受環(huán)境因子的影響越大。分析發(fā)現(xiàn)含水量對腌制期(S1)樣本影響最大;含鹽量對風(fēng)干期(S2)和發(fā)酵期(S3)影響最明顯;樣品酸堿度和游離氨基酸含量與成熟期(S4)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)關(guān)聯(lián)性最大。

通過計(jì)算4個(gè)環(huán)境因子與豐度最高的10個(gè)屬之間的spearman等級相關(guān)系數(shù),獲得數(shù)值矩陣,繪制出heatmap。從圖6B中可以看出有4個(gè)屬與環(huán)境因子之間有顯著相關(guān)關(guān)系。葡萄球菌屬(Staphylococcus)與含鹽量顯著正相關(guān),其在4個(gè)階段的相對豐度占比依次為S2(94%)>S3(86%)>S4(47%)>S1(1.7%),伴隨著火腿失水,鹽含量的增加一定程度上增加了葡萄球菌在火腿微生物群落中的數(shù)量。以葡萄球菌為代表的凝固酶陰性球菌(CNC,Coagulase-negative cocci)是火腿中經(jīng)常被報(bào)道的優(yōu)勢菌,在帕爾馬、伊比利亞火腿中也較為常見。在腌制前期,帕爾馬火腿內(nèi)部以革蘭氏陰性菌(55%)占據(jù)主導(dǎo),25 d后CNC成為優(yōu)勢菌,并且一直保持至211 d,一年后豐度有所下降但仍為主要的細(xì)菌組成部分[27]。諾鄧火腿內(nèi)部細(xì)菌群落的演替與其規(guī)律相符,提示在干腌火腿加工過程中CNC作為普遍存在的原生菌發(fā)揮了特定作用,現(xiàn)已被廣泛用于肉制品發(fā)酵[37]。氣單胞菌屬(Aeromonas)與含水量顯著正相關(guān),這個(gè)屬的相對豐度占比在4個(gè)時(shí)期中S1最高,腌制期較多的水分可能有利于該屬的分布。嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、希瓦氏菌屬(Shewanella)2個(gè)屬與游離氨基酸含量極顯著負(fù)相關(guān),游離氨基酸含量在S4階段達(dá)到較高水平,該階段這2個(gè)屬的細(xì)菌占比相較于其他階段低。

3 結(jié)論與討論

本研究通過高通量測序方法對諾鄧火腿4個(gè)不同加工階段的細(xì)菌群落進(jìn)行了分析,更為高效、全面的反映了其動(dòng)態(tài)變化,發(fā)現(xiàn)腌制期的細(xì)菌多樣性最高,成熟期多樣性較高,風(fēng)干期和發(fā)酵期多樣性相對較低,同時(shí)腌制期細(xì)菌的豐富度和均一性也是最高的?；鹜劝l(fā)酵過程中厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、擬桿菌門等細(xì)菌為優(yōu)勢菌群。4個(gè)加工階段共有的61個(gè)OTU主要由葡萄球菌屬、嗜冷桿菌屬、假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬及希瓦氏菌屬等43個(gè)屬的細(xì)菌組成,為諾鄧火腿發(fā)酵發(fā)酵過程中均有出現(xiàn)的菌群。腌制期細(xì)菌物種比較豐富,與其他3個(gè)時(shí)期差異較大,風(fēng)干和發(fā)酵期物種組成最相似。整個(gè)加工過程中豐度占比最高的為葡萄球菌屬,其在腌制初期不占優(yōu)勢,從風(fēng)干期開始成為優(yōu)勢菌群,隨著發(fā)酵的進(jìn)行又逐漸緩慢減少。對諾鄧火腿理化指標(biāo)的分析發(fā)現(xiàn)火腿中的含水量總體為下降趨勢,最終達(dá)到約33.4%,較其他種類火腿偏低;通過關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)含水量對腌制期細(xì)菌群落影響最大。隨著火腿不斷失水,含鹽量呈上升趨勢,成熟期的諾鄧火腿含鹽量約為6.7%,與云南其他火腿相比含鹽量較為適中;含鹽量對風(fēng)干期和發(fā)酵期菌群組成影響最明顯,在這兩個(gè)時(shí)期豐度占比最高的葡萄球菌屬與含鹽量顯著正相關(guān)。成熟期的菌群結(jié)構(gòu)與火腿酸堿度及游離氨基酸含量關(guān)聯(lián)度最大,這個(gè)時(shí)期的酸堿度為6.05左右,與其他火腿基本一致,游離氨基酸含量在這一階段增長較快,發(fā)酵9個(gè)多月后達(dá)到1.86%。傳統(tǒng)火腿加工過程中主要通過觀察外部霉菌的生長情況來判斷產(chǎn)品質(zhì)量,而細(xì)菌不能直接被觀察到。干腌火腿是我國重要的發(fā)酵肉制品,利用二代測序技術(shù)研究其內(nèi)部細(xì)菌的報(bào)道相對較少,研究尚不充分,研究對象也大多為成品火腿,加工過程中細(xì)菌的組成和變化有必要加以探索。諾鄧火腿是云南重要的特色食品,其加工過程中內(nèi)部的細(xì)菌動(dòng)態(tài)變化是首次報(bào)道。為滿足現(xiàn)代多樣化飲食的需求,成品火腿被用于生食,成熟期細(xì)菌的組成為保證其食品安全提供了參考。

在諾鄧火腿的自然發(fā)酵過程中,腌漬和失水作用初期細(xì)菌種類豐富,主要有嗜冷桿菌屬、假單胞菌屬、希瓦氏菌屬等細(xì)菌,但大部分屬于食品加工中不希望出現(xiàn)的微生物。隨著發(fā)酵進(jìn)行,發(fā)酵肉制品中的常見有益菌[38]葡萄球菌占比持續(xù)增加,而雜菌不斷減少。在腌制期加入適合的發(fā)酵劑,可以有效抑制雜菌的生長,降低衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn),保證產(chǎn)品品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化[39]。干腌肉制品的味道是火腿組織中的大分子在各種酶和非酶作用下分解后產(chǎn)生的,風(fēng)味的形成一般分為兩個(gè)階段,第一階段是在腌制期、風(fēng)干期和發(fā)酵前期發(fā)生的自然氧化,而第二階段是在發(fā)酵后期及成熟期發(fā)生的微生物次生代謝,特別是氨基酸的分解代謝[27]。CNC是肉制品發(fā)酵中主要的原生微生物群體[38],也是發(fā)酵肉制品工業(yè)上常用的發(fā)酵菌種。其能夠適應(yīng)一定濃度氯化鈉、硝酸鹽存在的環(huán)境,在發(fā)酵過程中可迅速占據(jù)主導(dǎo)地位,通過參與蛋白水解和脂肪降解,影響產(chǎn)品最終的風(fēng)味品質(zhì)。諾鄧火腿自然發(fā)酵過程中出現(xiàn)的CNC為研究者今后在發(fā)酵劑的選擇上提供了重要依據(jù),特別是篩選那些很好地適應(yīng)了火腿發(fā)酵條件的菌株。在加工過程中,研究者們可以通過掌握的諾鄧火腿內(nèi)部細(xì)菌總體變化信息,設(shè)計(jì)原生菌種發(fā)酵劑,形成優(yōu)勢菌落,促進(jìn)產(chǎn)品風(fēng)味的標(biāo)準(zhǔn)化。已有研究者篩選出了如木糖葡萄球菌、馬胃葡萄球菌等有利于火腿品質(zhì)形成菌種為發(fā)酵劑[39],產(chǎn)生的產(chǎn)品具有良好的色澤和風(fēng)味。為了提高諾鄧火腿生產(chǎn)效率、保證產(chǎn)品質(zhì)量,利用火腿中具有良好功能特性的原生菌種,研究其對產(chǎn)品安全性、風(fēng)味品質(zhì)的影響,開發(fā)特色菌種發(fā)酵劑是下一步研究的方向。