大豆活性肽對(duì)肥胖小鼠降脂作用的研究

錢(qián)珊珊,馮 雪,于 彤,官夢(mèng)姝,李 佳,劉 月,徐 聰,侯俊財(cái),*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)資處,黑龍江哈爾濱 150030; 2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030)

大豆蛋白活性肽是大豆蛋白經(jīng)過(guò)酶解后分離得到的低聚肽混合物[1],主要由蛋白質(zhì)和少量游離氨基酸等成分組成[2]。大豆活性肽是平均肽鏈長(zhǎng)度為2～10的短肽,分子量在1000～20000 Da,其本身在原大豆蛋白序列中無(wú)活性,通過(guò)食品加工及人體內(nèi)酶的作用將這些活性肽釋放出來(lái)[3]。與傳統(tǒng)大豆蛋白相比,大豆活性肽更易消化吸收,能夠迅速給機(jī)體提供能量,無(wú)豆腥味,易溶于水,酸性條件下不產(chǎn)生沉淀,受熱不凝固,溶液粘度低[4],大豆活性肽已被證實(shí)具有多種生物功能,主要包括免疫調(diào)節(jié)[5-7],抗氧化[8]以及降膽固醇[9-11]等功效。

隨著社會(huì)的進(jìn)步,人們對(duì)健康和高質(zhì)量的生活提出了更高的要求,因而尋找新的、安全有效的減肥降脂藥品或保健品已成為重要研究課題之一[12]。大豆很早就被用于治療和預(yù)防肥胖癥,大豆中的大豆蛋白通過(guò)降低饑餓感,增加脂肪代謝及促進(jìn)體重降低來(lái)減少肥胖癥的發(fā)生,同時(shí)大豆還能降低肝臟中甘油三酯的累積[13]。研究發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白能減少肥胖小鼠和大鼠血液中甘油三酯,增加脂聯(lián)素含量,促進(jìn)脂肪代謝[14]。Zhong等[15]對(duì)大豆蛋白進(jìn)行堿性蛋白酶水解,然后使用凝膠過(guò)濾和反相高效液相色譜分離得到的大豆肽,其最高TC抑制率達(dá)94. 3%,通過(guò)氨基酸序列和質(zhì)譜分析鑒定短肽序列顯示為WGAPSL。Takenaka等[16]采用基因定點(diǎn)誘變和酶解技術(shù),從大豆蛋白中水解分離了多種具有降低膽固醇的肽段,如LPYPR、LPLPR等。包樂(lè)媛等[17]以小鼠建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?發(fā)現(xiàn)大豆活性肽可有效降低血脂,但對(duì)高脂蛋白的調(diào)節(jié)作用不明顯。陳棟梁[18]等用含12%大豆肽和88%紫蘇油制備的降脂合劑灌胃高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠40 d,實(shí)驗(yàn)組TC及TG濃度明顯低于高血脂模型組,相反,HDL濃度則明顯升高。停止灌胃1周后,血清TC仍維持在較低水平。

大豆活性肽作為一種新型大豆深加工產(chǎn)品,亦可作為食品、醫(yī)藥、飼料等領(lǐng)域的優(yōu)質(zhì)原料進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用,具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和良好的市場(chǎng)前景[19]。本文通過(guò)建立高脂誘導(dǎo)小鼠肥胖模型,進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn),分析了大豆活性肽對(duì)高脂誘導(dǎo)引起的小鼠肥胖和血脂代謝異常的影響,為大豆肽的研究與開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

ICR小鼠 鼠齡5周左右,體重18～20 g,購(gòu)于哈爾濱獸醫(yī)研究所,合格證號(hào):SCXK(黑)2011-007;普通飼料和高脂飼料 均購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司;總膽固醇測(cè)定試劑盒、甘油三酯測(cè)定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇測(cè)定試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所;大豆分離蛋白 谷神生物科技集團(tuán)有限公司。

LGJ 21型真空冷凍干燥機(jī) 上海醫(yī)用分析儀器廠(chǎng);DM I8倒置熒光顯微鏡 德國(guó)徠卡公司;Pellicon型小型切向流超濾系統(tǒng) 美國(guó)Millipore儀器公司;無(wú)菌操作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大豆活性肽的制備與分離 參考李峰等[20]的方法,并加以改進(jìn),選用風(fēng)味蛋白酶作為水解酶,工藝條件為:pH7.7,底物濃度8%,酶/底物比為90 mg/g,溫度60 ℃,時(shí)間2 h。酶解后沸水浴10 min滅酶,冷卻至室溫,3000 r/min,離心20 min,取上清液即酶解液。

超濾器進(jìn)樣壓力設(shè)定在0.18～0.2 MPa,用恒流泵將制備的大豆多肽液在室溫下(25 ℃)下依次通過(guò)分子截留量為 10和5 kDa的超濾膜,最后收集超濾液并進(jìn)行冷凍干燥。

1.2.2 肥胖小鼠模型的建立 肥胖小鼠模型的建立參考盧申姣等人的方法[21],60只ICR小鼠,飼養(yǎng)溫度20～25 ℃,晝夜明暗交替日光燈照明,自由飲水,普通飼料適應(yīng)喂養(yǎng)1周后,按照體重隨機(jī)選取10只設(shè)為普通飼料組,喂養(yǎng)普通飼料,其余50只設(shè)為高脂飼料組,用高脂飼料飼養(yǎng),期間每3 d測(cè)定一次空腹體重,連續(xù)喂養(yǎng)6周后平均體質(zhì)量超過(guò)對(duì)照組平均體質(zhì)量1.2倍判定肥胖模型造模成功(一般認(rèn)為體質(zhì)量超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量的20%者為肥胖)。隨機(jī)選取建模成功的肥胖小鼠32只和普通飼料組小鼠8只用于大豆活性肽減肥試驗(yàn)。

1.2.3 試驗(yàn)小鼠分組及給藥 8只普通飼料組小鼠作為正常對(duì)照組,32只建模成功的ICR肥胖小鼠,隨機(jī)分為4組,高脂對(duì)照組、大豆活性肽低劑量組(200 mg/kg BW)、中劑量組(400 mg/kg BW)和高劑量組(800 mg/kg BW),連續(xù)喂養(yǎng)4周。實(shí)驗(yàn)期間,小鼠均喂養(yǎng)正常飼料,各組動(dòng)物單籠飼養(yǎng),環(huán)境溫度控制在(23±2) ℃,濕度控制在50%±10%,12 h光照、12 h黑暗自動(dòng)控制,自由攝食飲水。

1.2.4 體重、Lee’s指數(shù)、攝食量的測(cè)定 每3 d測(cè)量小鼠體重1次,記錄飼料消耗量。在實(shí)驗(yàn)的最后3 d,收集糞便,凍干并于-70 ℃保存。用鹽酸塞拉嗪注射液1 mg/kg肌肉注射進(jìn)行麻醉后,測(cè)小鼠體長(zhǎng)(從鼻尖到肛門(mén)的長(zhǎng)度),計(jì)算Lee’s指數(shù)和體重增加量。計(jì)算公式(1)如下:

式(1)

1.2.5 肝臟分離及脂肪系數(shù)的測(cè)定 小鼠取血后,頸椎脫臼處死小鼠,立即分離肝臟,腸系膜周?chē)窘M織、左右雙側(cè)腎周脂肪組織及左右雙側(cè)附睪周?chē)窘M織,用濾紙吸干組織液后分別稱(chēng)重,計(jì)算脂肪系數(shù)。計(jì)算公式(2)如下:

脂肪系數(shù)(%)=(腸系膜+雙側(cè)附睪+雙側(cè)腎周?chē)緣|)/小鼠體重×100

式(2)

1.2.6 血清制備及其血脂指標(biāo)的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),小鼠禁食12 h,不禁水,稱(chēng)體重,摘眼球取血,收集血液,然后頸椎脫臼處死,將血液4000 r/min 4 ℃離心15 min得到血清,立即保存于-70 ℃。

血清TG的測(cè)定參照甘油三酯(TG)測(cè)定試劑盒(單試劑GPO-PAP法),37 ℃孵育10 min,510 nm處測(cè)定吸光度。

血清TC的測(cè)定參照總膽固醇(TC)測(cè)定試劑盒(單試劑GPO-PAP法),37 ℃孵育10 min,510 nm處測(cè)定吸光度。

血清HDL-C的測(cè)定參照高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測(cè)定試劑盒(雙試劑直接法),37 ℃孵育5 min,546 nm處測(cè)定吸光度。

血清LDL-C的測(cè)定參照低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)測(cè)定試劑盒(雙試劑直接法),37 ℃孵育5 min,546 nm處測(cè)定吸光度。

1.2.7 肝臟TC的測(cè)定 采用Folch法[22]用酶法測(cè)定肝臟中TC含量。稱(chēng)取0.5 g肝臟在10 mL氯仿甲醇(2∶1,v/v)中勻漿,過(guò)濾,向?yàn)V液中加入2 mL冰冷的蒸餾水,充分混勻,3000 r/min離心10 min,收集有機(jī)相用氮?dú)獯蹈珊蠹尤牒?0% TritonX-100的異丙醇1 mL溶解脂質(zhì),得到的樣品用試劑盒測(cè)定。

1.2.8 糞便TC的測(cè)定 在小鼠處死前3 d,收集糞便,凍干后檢測(cè)糞便中膽固醇含量,方法同1.2.7。

1.2.9 肝組織切片制備與HE染色 處死小鼠后,取肝臟組織,立即浸泡在新鮮配制的4%中性甲醛固定液中固定,將固定好的組織進(jìn)行流水沖洗,制備石蠟切片,并進(jìn)行HE染色,用顯微鏡在40、100倍下觀(guān)察,拍照[23]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 建模過(guò)程中小鼠體重變化

實(shí)驗(yàn)持續(xù)6周,每3 d測(cè)1次體重,高脂模型組和普通對(duì)照組小鼠體重變化趨勢(shì)見(jiàn)圖1。研究開(kāi)始時(shí),普通對(duì)照組與高脂模型組小鼠體重均為18～22 g左右,高脂模型組再繼續(xù)飼喂高脂飼料后,體重增長(zhǎng)較快,建模結(jié)束時(shí),高脂模型組體重達(dá)到了35 g左右,而普通對(duì)照組為28 g左右,高脂模型組小鼠體重顯著高于普通對(duì)照組(P<0.05),高脂飼料組比普通飼料組小鼠體重超出20%即評(píng)定為肥胖模型建造成功[20],經(jīng)造模從50只高脂飼料組中選出建模成功的肥胖小鼠32只作為高脂模型組,從普通飼料組織選出8只作為普通對(duì)照組,進(jìn)行后面的大豆活性肽降脂實(shí)驗(yàn)。

圖1 試驗(yàn)期間小鼠體重變化Fig.1 Weight changes of mice during the experiment

2.2 大豆活性肽對(duì)小鼠體重、Lee’s指數(shù)、攝食量的影響

由表1和圖2可知,模型組與劑量組的初始體重?zé)o顯著性差異(P>0.05),模型組建模成功后改喂普通飼料不能使小鼠體重下降,而通過(guò)灌胃大豆活性肽使肥胖小鼠的體重顯著降低(P<0.05)。與模型組相比,大豆活性肽處理組小鼠的體重、Lee’s指數(shù)和食物攝入量隨著大豆活性肽劑量的增加而降低。這可能是因?yàn)榻o小白鼠飼喂大豆活性肽能刺激產(chǎn)生熱能的褐色脂肪組織(BAT)的活性,提高甲狀腺素在血液中的濃度,促進(jìn)體內(nèi)多余脂肪的消耗[15]。另一方面,攝食量也是導(dǎo)致小鼠體重變化的重要原因,大豆活性肽高劑量組和中劑量組的攝食量顯著低于模型組(P<0.05),其中高劑量組與正常對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(P<0.05)。這說(shuō)明高劑量灌胃肥胖小鼠后,小鼠的攝食量趨于正常。

表1 大豆活性肽對(duì)小鼠體重、飼料攝入量、Lee’s指數(shù)的影響Table 1 Effect of soybean peptides on body weight,food intake and Lee’s index of mice

圖2 口服不同濃度的大豆活性肽對(duì)肥胖小鼠體重的影響Fig.2 Effect of soybean peptides on the weight of obese mice

2.3 大豆活性肽對(duì)小鼠肝臟及脂肪組織重量的影響

體內(nèi)脂肪重量和脂肪系數(shù)是反映小鼠肥胖程度的一個(gè)重要指標(biāo)。從表2可知,各劑量組小鼠的肝臟和附睪周?chē)緣|的相對(duì)重量降低于模型組,小鼠腸系膜和腎周?chē)緣|的相對(duì)重量也具有同樣的趨勢(shì)但差異性并不顯著(P>0.05),可能是由于肝臟中的脂肪比起脂肪組織更早的被機(jī)體利用,所以導(dǎo)致肝臟的重量和腸系膜及腎周?chē)緣|重量不同。Aoyam[24]也得到了相似的結(jié)果。而從總體來(lái)看,同模型組相比,低劑量組的脂肪系數(shù)無(wú)顯著性差異(P>0.05),中劑量和高劑量組均顯著降低小鼠的脂肪系數(shù)(P<0.05),且與正常組相比差異不顯著(P>0.05)。

表2 大豆活性肽對(duì)小鼠肝臟、脂肪組織重量(g)及脂肪系數(shù)的影響Table 2 Effect of soybean peptides on the weight of liver,lipid composition in serum and fat coefficient

2.4 大豆活性肽對(duì)小鼠血脂的影響

從表3的結(jié)果可以看出,與正常對(duì)照組相比,模型組血清TC、TG和LDL-C顯著升高(P<0.05),而HCL-C則顯著降低(P<0.05)。與模型組相比,與模型組相比,高劑量組TC、TG、LDL-C指標(biāo)顯著降低(P<0.05),HDL-C指標(biāo)顯著提高(P<0.05);而高劑量組與正常對(duì)照組相比,TC、TG、LDL-C、HDL-C的含量差異均不顯著(P>0.05),這與褚斌杰[25]等的研究結(jié)果相一致,說(shuō)明大豆活性肽可以通過(guò)降低TC、TG、LDL-C含量,提高HDL-C的含量來(lái)改善小鼠體內(nèi)與肥胖癥相關(guān)的指標(biāo),從而達(dá)到減肥的效果。

表3 大豆活性肽對(duì)小鼠血脂的影響Table 3 Effects of soybean peptides on serum lipid levels of mice

2.5 大豆活性肽對(duì)小鼠肝臟TC的影響

從圖3可以看出,與模型組相比,隨著大豆活性肽含量不斷增加,小鼠肝臟TC水平存在不同程度的降低,而低劑量組TC含量與模型組無(wú)顯著性差異(P>0.05),中劑量組和高劑量組TC含量顯著低于模型組(P<0.05),說(shuō)明大豆活性肽可以降低脂類(lèi)的合成并加速脂類(lèi)的代謝,降低肥胖小鼠肝臟的膽固醇含量。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與劉恩岐[26]的研究結(jié)果一致,這種大豆活性肽輔助降血脂的作用具有一定的量效關(guān)系。

圖3 大豆活性肽對(duì)小鼠肝臟TC的影響Fig.3 Effect of soybean peptides on the content of total cholesterol in the lives of mice

2.6 大豆活性肽對(duì)小鼠糞便TC的影響

由圖4可知,正常對(duì)照組與高脂模型組的小鼠糞便TC含量無(wú)顯著性差異(P>0.05),說(shuō)明糞便中的TC含量于攝食量無(wú)關(guān),而大豆活性肽低、高劑量組糞便中TC含量均顯著高于正常對(duì)照組和高脂模型組(P<0.05),且低、中、高三個(gè)劑量組之間無(wú)顯著性差異(P>0.05),這是由于大豆活性肽能刺激甲狀腺激素分泌,促使膽固醇代謝生產(chǎn)膽汁酸。膽汁酸又被食物纖維所吸附排出體外,從而加速膽固醇的代謝,促進(jìn)體內(nèi)多余脂肪的消耗,可以起到降低膽固醇作用[27]。

圖4 大豆活性肽對(duì)小鼠糞便TC的影響Fig.4 Effect of soybean peptides on the content of total cholesterol in faeces of mice

2.7 大豆活性肽對(duì)小鼠肝臟切片的影響

對(duì)肝臟組織進(jìn)行病理學(xué)觀(guān)察,結(jié)果如圖5所示,光鏡下HE染色顯示:正常對(duì)照組肝臟組織結(jié)構(gòu)清晰完整,無(wú)脂肪變性,細(xì)胞界限清楚,細(xì)胞中央有大而圓的核,細(xì)胞質(zhì)均勻,胞核大小形態(tài)正常;而高脂模型組肝細(xì)胞細(xì)胞排列松散,肝細(xì)胞腫脹,胞核變大,可見(jiàn)大小不一的脂滴形成,細(xì)胞變性嚴(yán)重,以中央靜脈周?chē)^明顯;大豆肽高、中、低劑量組均有輕到中等程度的小泡性細(xì)胞變性,但可以看出經(jīng)過(guò)大豆活性肽灌胃后,肝細(xì)胞脂肪變性程度較高脂模型組明顯減輕,且高劑量組的改善效果最明顯,肝細(xì)胞空泡更小更少,形態(tài)與正常對(duì)照組相似。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果與黃謹(jǐn)[28]的研究結(jié)果相類(lèi)似。

圖5 各組小鼠肝臟組織形態(tài)(100×)Fig.5 Observation of liver tissue morphology of mice in each group under microscope(100×)

3 結(jié)論

肥胖小鼠在灌胃大豆活性肽后,小鼠體重、Lee’s指數(shù)、攝食量、肝臟及脂肪組織重量均有所降低;小鼠血清中總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇含量顯著下降(P<0.05),而高密度脂蛋白膽固醇顯著性升高(P<0.05);肝臟組織切片結(jié)果表明,大豆活性肽能減輕肝臟的脂肪變性程度,且高劑量組的改善效果最明顯。因此,大豆活性肽對(duì)高脂誘導(dǎo)引起的小鼠肥胖和血脂代謝異常有良好的改善作用,且活性肽的劑量與這種改善作用具有一定的量效關(guān)系,但其作用機(jī)理目前仍不夠明確,還需進(jìn)一步研究。本研究為大豆肽在食品、醫(yī)藥、飼料等領(lǐng)域的研究與開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù),具有重要的理論意義和社會(huì)經(jīng)濟(jì)價(jià)值。