菊苣多糖對免疫抑制小鼠免疫功能的影響

吳雨龍,朱 華,張藝鏻,江海濤,華 春

(1.南京曉莊學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院,江蘇南京 211171; 2.江蘇省高?！疤厥馍镔|(zhì)廢棄物資源化利用”重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京 211171; 3.江蘇第二師范學(xué)院,江蘇南京 210013)

免疫是指機(jī)體免疫系統(tǒng)通過免疫應(yīng)答識別自身和外來物質(zhì),消除抗原性異物,以維持機(jī)體在生理平衡下的功能[1]。免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)在預(yù)防疾病中起著重要的作用,活性物質(zhì)誘導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)和免疫刺激的研究越來越受到重視。近期研究表明,免疫調(diào)節(jié)劑可以增強(qiáng)機(jī)體的防御反應(yīng),這是提高抗病能力的有效途徑[2]。臨床研究表明,增強(qiáng)機(jī)體免疫力可以有效地防御病毒、病菌的入侵[3]。因此,有效調(diào)節(jié)免疫活性已成為研究的熱點(diǎn)。

多糖是一種生物大分子,與蛋白質(zhì)和核酸一樣是機(jī)體的重要組成部分。研究表明多糖具有多種生物活性,如抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)以及抗炎活性等[4-6]。大多數(shù)活性多糖具有免疫功能,有關(guān)多糖的免疫機(jī)制已被越來越多的研究者關(guān)注[7-9]。作為非特異性免疫和特異性免疫系統(tǒng)的一部分,巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞在機(jī)體防御中起著關(guān)鍵作用。據(jù)報(bào)道,多糖可激活巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的增殖[10]。

菊苣(CichoriumintybusL.)為菊科菊苣屬多年生藥食兩用草本植物,富含多糖、菊苣酸、多酚類等多種功能活性成分[11-12],其中菊苣多糖(chicory polysaccharide,CP)具有多種生物活性,如保護(hù)皮膚、抗氧化、抗疲勞、降脂保肝、延緩衰老等[13-17],但有關(guān)菊苣多糖提高免疫活性的研究尚未見報(bào)道。本研究利用免疫抑制小鼠模型評價(jià)菊苣多糖對免疫活性的調(diào)節(jié)作用,以期為進(jìn)一步研究和綜合開發(fā)利用菊苣資源提供一定的科學(xué)依據(jù)和參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菊苣多糖(白色粉末,相對分子量為8511.4 Da;主要由山梨醇、葡萄糖、果糖和糖醇組成,摩爾比為1.00∶5.58∶13.97∶10.32;屬雜多糖,含有α-糖苷鍵) 南京曉莊學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院生物功能分子研究室[15];ICR雄性小鼠 動物合格證號:SCXK(蘇)2017-0001,體質(zhì)量18～22 g,南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場提供;脾氨肽口服液 北京第一生物化學(xué)藥業(yè)有限公司;環(huán)磷酰胺 上海寶生物科技有限公司;乙二胺四乙酸(EDTA) 美國Sigma公司;雞紅細(xì)胞和綿羊紅細(xì)胞(SRBC) 北京博爾西科技有限公司;都氏試劑 北京中諾泰安科技有限公司;TNF-α酶聯(lián)免疫試劑盒(RAB0477-1KT)、IL-2酶聯(lián)免疫試劑盒(RAB0287-1KT)、IL-6酶聯(lián)免疫試劑盒(RAB0309-1KT) 德國Merck公司;其它試劑 均為國產(chǎn)分析純。

JA3003N型電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;YT-CJ-2D超凈工作臺 蘇州凈化公司;XS-500i全自動血細(xì)胞分析儀 希森美康醫(yī)用電子(上海)有限公司;Forma TM 310細(xì)胞培養(yǎng)箱 美國Thermo公司;NIKON 50iH600L生物顯微鏡 日本尼康公司;SYNERGY/HTC全波段酶標(biāo)儀 美國BioTek公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 雄性ICR小鼠240只,適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后進(jìn)行隨機(jī)分為6組(空白組、模型組、藥物組(脾氨肽)、菊苣多糖(chicory polysaccharide,CP)低、中、高劑量組?？瞻捉M灌胃等體積(10 mL/kg)純凈水;模型組灌胃等體積純凈水;藥物組灌胃脾氨肽口服液(一種較為常見的免疫刺激性藥物)83 mg/kg;CP低劑量組灌胃CP 100 mg/kg;CP中劑量灌胃CP 200 mg/kg;CP高劑量組灌胃CP 300 mg/kg;持續(xù)35 d。除空白組外,其余各組小鼠從第28～30 d腹腔注射環(huán)磷酰胺(60 mg/kg/d)以建立免疫抑制模型。最后一次灌胃給藥24 h后,各組小鼠隨機(jī)取10只稱重、采血、處死,取胸腺、脾臟等器官,備用。

1.2.2 免疫抑制小鼠凈體質(zhì)量增率及免疫器官指數(shù)測定 根據(jù)之前記錄的小鼠的體質(zhì)量、胸腺、脾臟計(jì)算小鼠的凈體質(zhì)量增率和免疫器官指數(shù)。計(jì)算公式如下:

凈體質(zhì)量增率(%)=(最終體質(zhì)量-初始體質(zhì)量)/初始體質(zhì)量×100

式(1)

胸腺指數(shù)(%)=胸腺質(zhì)量(g)/體重(g)×100

式(2)

脾臟指數(shù)(%)=脾臟質(zhì)量(g)/體重(g)×100

式(3)

1.2.3 免疫抑制小鼠全血紅細(xì)胞和白細(xì)胞指標(biāo)的測定 在小鼠采血完成4 h內(nèi),利用全自動血細(xì)胞分析儀對小鼠全血中的白細(xì)胞和紅細(xì)胞含量進(jìn)行檢測。

1.2.4 免疫抑制小鼠血清IL-2、IL-6以及TNF-α水平的測定 將1.2.1中所采各組小鼠血,置于2 mL離心管中,3000 r/min離心10 min,得小鼠血清樣品,分別用ELISA試劑盒檢測各組小鼠血清中IL-2、IL-6以及TNF-α的水平。

1.2.5 免疫抑制小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)檢測 經(jīng)35 d處理后,根據(jù)Shimamura等[18]的方法,采用足跖增厚法測定遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)。先用2%(v/v)SRBC進(jìn)行腹腔免疫,每只小鼠注射0.2 mL,使其為致敏小鼠。免疫4 d后,用游標(biāo)卡尺測量各組小鼠的左后足跖部的厚度,然后在測量部位皮下注射20%(v/v)的SRBC,每只小鼠注射20 μL,注射后24 h內(nèi)同一時(shí)間測量左后足跖的厚度3次,取平均值。

1.2.6 小鼠血清溶血素的檢測 經(jīng)35 d處理后,根據(jù)Zou等[19]的方法檢測血清溶血素。各組小鼠腹腔注射2%的SRBC懸液0.2 mL。免疫4 d后,進(jìn)行眼眶取血,分離血清,用無菌的純凈水進(jìn)行稀釋(1∶100)。在5 mL離心管中,按順序加入1 mL稀釋血清溶液,體積分?jǐn)?shù)為10% SRBC 0.5 mL以及1 mL新鮮豚鼠血清混合均勻;空白組血清用純凈水代替。樣品在37 ℃恒溫水浴中孵育30 min,然后在0 ℃冰浴中停止反應(yīng)。3000 r/min離心10 min,得上清液。取1 mL上清與3 mL都氏試劑充分混合均勻,同時(shí),取0.25 mL 10% SRBC懸液加都氏試劑至4 mL充分混合均勻,將其作為半數(shù)溶血管。靜置10 min后,將空白組設(shè)置為參照,540 nm波長處測定各個(gè)樣品管的光密度值(OD),用半數(shù)最大溶血素抗體濃度(half-maximal hemolysin antibody concentration,HC50)表示各組小鼠血清溶血素的含量。計(jì)算公式如下:

HC50=(樣品管OD/半數(shù)溶血管OD)×稀釋倍數(shù)

式(4)

1.2.7 免疫抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞功能測定 根據(jù)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的方法來檢測腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力[20]。取1.2.1各組中剩下的10只小鼠,腹腔注射6%淀粉肉湯(含臺盼藍(lán))1 mL,連續(xù)注射3 d后,每只小鼠再注射1%雞紅細(xì)胞懸液1 mL,輕按小鼠腹部,使懸液分散。30 min后,頸椎脫臼法處死小鼠。將小鼠置于超凈工作臺內(nèi),75%乙醇腹部消毒,剖開腹腔,用吸管吸取腹腔液,滴1滴于干凈載玻片上,用細(xì)胞培養(yǎng)箱37 ℃孵育30 min,鏡檢,每片計(jì)數(shù)100個(gè)巨噬細(xì)胞,觀察記錄吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)數(shù)及被吞噬的雞紅細(xì)胞數(shù)。吞噬百分率和吞噬指數(shù)計(jì)算公式如下:

吞噬百分率(%)=(吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/巨噬細(xì)胞總數(shù))×100

式(5)

吞噬指數(shù)=巨噬細(xì)胞吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)/吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞總數(shù)

式(6)

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 CP對免疫抑制小鼠凈體質(zhì)量增率及免疫器官指數(shù)的影響

胸腺和脾臟是機(jī)體的主要免疫器官,胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)反映了機(jī)體的非特異性免疫情況[21]。因此,藥物對胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響可作為研究動物模型免疫藥理學(xué)機(jī)制的初步指標(biāo)[22]。環(huán)磷酰胺能夠抑制淋巴細(xì)胞的分化,減少免疫器官中淋巴細(xì)胞的數(shù)量,導(dǎo)致脾臟、胸腺和身體重量的減少[1]。由圖1A可知,與空白組相比,模型組小鼠的凈體質(zhì)量增率極顯著下降(P<0.01);而經(jīng)CP處理后,低、中、高三個(gè)劑量組小鼠凈體質(zhì)量增率與模型組相比均上升,且呈一定的劑量依賴性。由圖1B可知，與模型組相比，CP中、高劑量組和藥物組顯著提高了脾臟指數(shù)(P<0.05)，而CP低劑量組差異不明顯。由圖1C可知，與模型組相比，CP高劑量處理組和藥物組顯著提高了胸腺指數(shù)(P<0.05)，而CP低、中劑量組雖然提高了胸腺指數(shù)，但不存在顯著差異。 結(jié)果表明，CP高劑量組能夠改善環(huán)磷酰胺引起的小鼠免疫器官的萎縮，對免疫器官有明顯的免疫增強(qiáng)作用。

圖1 CP對免疫抑制小鼠凈體質(zhì)量增率、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的作用Fig.1 Effect of CP on net mass increase,spleen index and thymus index in immunosuppressed mice注:與模型組相比,*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01);ns表示與模型組相比差異不顯著; 與空白組相比,#表示差異顯著(P<0.05);##表示差異極顯著(P<0.05)。圖2～圖6同。

2.2 CP對免疫抑制小鼠全血紅細(xì)胞和白細(xì)胞指標(biāo)的影響

機(jī)體血液中的紅細(xì)胞具有識別攜帶抗原,清除循環(huán)中免疫復(fù)合物,增強(qiáng)T細(xì)胞依賴反應(yīng),效應(yīng)細(xì)胞樣作用,促進(jìn)吞噬作用以及參與相關(guān)的免疫調(diào)控過程,是機(jī)體免疫系統(tǒng)中的重要組成部分[23]。機(jī)體血液中的白細(xì)胞包括粒細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞)、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。白細(xì)胞主要功能是防衛(wèi)作用。當(dāng)病菌侵入人體體內(nèi)時(shí),白細(xì)胞能通過變形而穿過毛細(xì)血管壁,集中到病菌入侵部位,將病菌包圍﹑吞噬,白細(xì)胞數(shù)量的變化能影響機(jī)體的免疫力[23]。因此,檢測動物外周血紅細(xì)胞和白細(xì)胞數(shù)量變化能說明機(jī)體的免疫功能。同時(shí),環(huán)磷酰胺是臨床上常用的細(xì)胞毒性化療藥物,對骨髓和免疫力具有抑制作用,可以導(dǎo)致血小板和白細(xì)胞的降低。由圖2可知,模型組的紅細(xì)胞顯著低于空白組(P<0.05),白細(xì)胞水平極顯著低于空白組(P<0.05);與模型組相比,CP各劑量組和藥物組均能提高機(jī)體中紅細(xì)胞和白細(xì)胞的水平,其中CP高劑量組和藥物組能顯著提高紅細(xì)胞和白細(xì)胞水平(P<0.05)。結(jié)果表明,CP高劑量組能夠增加經(jīng)環(huán)磷酰胺處理的免疫抑制小鼠中紅細(xì)胞和白細(xì)胞的數(shù)量,具有恢復(fù)免疫抑制小鼠的免疫活性。

圖2 CP對免疫抑制小鼠紅細(xì)胞和白細(xì)胞的影響Fig.2 Effect of CP on red blood cell and white blood cell in immunosuppressed mice

2.3 CP對免疫抑制小鼠血清IL-2、IL-6以及TNF-α水平的影響

在免疫損傷的發(fā)生過程中,機(jī)體會產(chǎn)生一系列的炎癥反應(yīng),貫穿著促炎因子和抗炎因子的相互作用[24]。IL-2是體內(nèi)重要的抗炎因子,而IL-6和TNF-α是體內(nèi)重要的促炎因子。IL-2又名T細(xì)胞生長因子,能夠促進(jìn)T細(xì)胞增長、誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生、增加細(xì)胞增殖和分化的細(xì)胞因子以及參加自身免疫性反應(yīng)的過程[25]。因此,機(jī)體中IL-2水平的高低能從一定程度反映出機(jī)體免疫力的強(qiáng)弱,在免疫應(yīng)答中起著很重要的作用。環(huán)磷酰胺等免疫抑制劑能抑制IL-2的活性和生成。促炎癥因子IL-6是一種可刺激巨核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的增殖,可誘導(dǎo)單核細(xì)胞趨化蛋白-1的產(chǎn)生及內(nèi)皮細(xì)胞表面粘附分子的表達(dá),從而增強(qiáng)炎癥部位細(xì)胞的遷移,加劇炎癥反應(yīng)[26]。促炎因子TNF-α是由單核-巨噬細(xì)胞或其他多種細(xì)胞產(chǎn)生的促炎因子,其有雙重的生物學(xué)活性,一方面能在機(jī)體生理功能、免疫調(diào)節(jié)以及抗腫瘤等方面有重要作用,另一方面也能參與休克等疾病過程的發(fā)生與發(fā)展。由圖3A可知,模型組小鼠的抗炎因子IL-2水平極顯著低于空白組(P<0.01),而促炎因子IL-6和TNF-α含量分別顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)高于空白組;另外,與模型組相比,CP各劑量組均能提高IL-2的含量，降低IL-6和TNF-α的含量，其中，CP高劑量組和藥物組能顯著提高因環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的抗炎因子IL-2含量的降低，顯著降低因環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的促炎因子IL-6和TNF-α含量的提高(P<0.05)。結(jié)果表明，CP高劑量組可以調(diào)節(jié)小鼠血清中抗炎因子和促炎因子含量，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

圖3 CP對免疫抑制小鼠血清IL-2、 IL-6以及TNF-α水平的影響Fig.3 Effect of CP on serum IL-2,IL-6 and TNF-α levels in immunosuppressed mice

2.4 CP對免疫抑制小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響

遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)是細(xì)胞介導(dǎo)的免疫在T活化和細(xì)胞因子釋放中的重要表現(xiàn),可通過小鼠足跖腫脹來測量細(xì)胞免疫功能[27]。由圖4可知,與空白組相比,模型組的小鼠足跖厚度差顯著降低(P<0.05);CP中、高劑量組與模型組相比足跖厚度差顯著升高(P<0.05),其中CP中劑量組足跖厚度略高于CP高劑量組,究其原因,可能是個(gè)別小鼠對SRBC敏感性不夠;CP低劑量組雖升高,但與模型組相比未顯示出明顯的升高;藥物組與模型組相比足跖厚度差極顯著升高(P<0.01)。結(jié)果表明,CP中、高劑量組明顯加重小鼠足跖腫脹的差異,以激活機(jī)體T細(xì)胞參與的相關(guān)免疫反應(yīng),進(jìn)一步促進(jìn)遲發(fā)型超敏反應(yīng),提高免疫應(yīng)答,對動物體特異性的細(xì)胞的免疫功能有一定的增強(qiáng)作用,也表明CP的免疫調(diào)節(jié)活性可能與細(xì)胞免疫有關(guān)。

圖4 CP對免疫抑制小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of CP on delayed type hypersensitivity in immunosuppressed mice

2.5 CP對免疫抑制小鼠血清溶血素的影響

血清溶血素是體液免疫中重要的指標(biāo)之一,由于機(jī)體B細(xì)胞受到抗原刺激后產(chǎn)生相應(yīng)抗體,該水平反映了抗體生成量的高低。正常的細(xì)胞受到雞紅細(xì)胞等致敏免疫之后,能產(chǎn)生抗雞紅細(xì)胞抗體(溶血素),實(shí)驗(yàn)可檢測樣品上清液的吸光度OD值,從而間接判斷血清抗體生成數(shù)量,其中OD值越大,則表明機(jī)體產(chǎn)生的抗體數(shù)量越多[19]。由圖5可知,與空白組相比,模型組血清溶血素水平極顯著降低(P<0.01);與模型組相比,藥物組和CP高劑量組均能顯著提高血清溶血素的水平(P<0.05),CP低、中劑量組雖然能夠提高血清溶血素水平,但不具有顯著差異。結(jié)果表明,CP高劑量組對免疫抑制小鼠的體液免疫功能有一定的增強(qiáng)作用。

圖5 CP對免疫抑制小鼠血清溶血素的影響Fig.5 Effect of CP on serum hemolysin in immunosuppressed mice

2.6 CP對免疫抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞功能的影響

巨噬細(xì)胞是一種多功能免疫細(xì)胞,在機(jī)體非特異性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用?；罨木奘杉?xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)的吞噬能力并能分泌大量介質(zhì),如IL-2、IL-18、TNF、NO等細(xì)胞因子及信號分子,從而發(fā)揮抗病毒、抗微生物、抗腫瘤等作用。巨噬細(xì)胞功能的強(qiáng)弱能反映機(jī)體非特異性免疫能力的狀態(tài),因而巨噬細(xì)胞功能檢測被廣泛地運(yùn)用于臨床研究和體外評價(jià)某些藥物對機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用[28]。由圖6可知,與空白組相比,模型組小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力明顯減弱,吞噬率和吞噬指數(shù)顯著降低(P<0.05)。與模型組相比,藥物組和CP組均能夠提高免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力,其中藥物組能極顯著提高免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)(P<0.01),CP中、高劑量組也可以顯著提高免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬率(P<0.05)，CP各劑量組均能顯著提高免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)(P>0.05)。結(jié)果表明,CP具有激活、增強(qiáng)免疫抑制小鼠巨噬細(xì)胞吞噬異物的能力,促進(jìn)免疫抑制小鼠的非特異性免疫功能。

圖6 CP對免疫抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞功能的影響Fig.6 Effect of CP on peritoneal macrophage function in immunosuppressed mice注:白細(xì)箭頭所指為雞紅細(xì)胞;紅中箭頭所指為巨噬細(xì)胞; 黃粗箭頭所指為吞噬了雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞。

3 結(jié)論

本研究以環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠為模型,探討菊苣多糖提高免疫活性的功能,得出以下結(jié)論:CP中、高劑量組對免疫抑制小鼠的凈體重增率、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、吞噬率和吞噬指數(shù)均有增強(qiáng)作用,說明CP對免疫抑制小鼠的非特異性免疫功能有保護(hù)作用。CP高劑量組能夠提高免疫抑制小鼠全血中紅細(xì)胞和白細(xì)胞數(shù)量,血清溶血素水平和遲發(fā)型超敏反應(yīng),說明CP對免疫抑制小鼠的體液免疫和細(xì)胞免疫有一定的促進(jìn)作用。CP高劑量組對免疫抑制小鼠IL-2、IL-6和TNF-α水平有調(diào)節(jié)作用,使它們趨于正常水平,說明CP對免疫抑制小鼠的細(xì)胞免疫功能有一定的提高作用。綜上所述,CP對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠的免疫功能有增強(qiáng)作用。