與莖腐病抗性基因ZmCCT緊密連鎖的分子標(biāo)記的設(shè)計(jì)與應(yīng)用

朱先飛 吳潔 楊焰華 李婧婧 付求來(lái) 李威

摘 要：利用已經(jīng)克隆的ZmCCT基因的核酸序列，在基因功能區(qū)設(shè)計(jì)新引物，鑒定到針對(duì)安徽豐大種業(yè)股份有限公司玉米骨干自交系0908的功能區(qū)序列差異，開(kāi)發(fā)了基于PCR的新的插入/缺失（insert-deletion，InDel）標(biāo)記，標(biāo)記與基因功能緊密連鎖。通過(guò)擴(kuò)增、電泳檢測(cè)和接種鑒定，結(jié)果表明，新開(kāi)發(fā)的標(biāo)記能有效地鑒別玉米莖腐病抗性，可用于分子標(biāo)記輔助育種。

關(guān)鍵詞：玉米;莖腐病;抗性基因;分子標(biāo)記輔助育種

中圖分類(lèi)號(hào) S274.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2021）08-0015-03

Abstract： Based on the cloned nucleic acid sequence of ZmCCT gene， new primers were designed in the functional region of the gene， and the sequence differences of the functional region of our Backbone Inbred Line 0908 were identified. A new insert deletion （indel） marker based on PCR was developed， which was closely linked with the gene function. Amplification and electrophoresis showed that the primer amplification was stable. The results showed that the newly developed marker could effectively identify the resistance of maize to bacterial wilt and could be used in molecular marker assisted breeding.

Key words： Corn; Stem rot; Resistance gene; Molecular marker assisted breeding in maize

玉米莖腐病又稱(chēng)青枯病，是國(guó)內(nèi)外玉米生產(chǎn)中的重要病害之一，近年來(lái)，隨著機(jī)械收獲和籽粒直收，莖腐病已成為玉米生產(chǎn)中極具威脅性的病害[1]。一般發(fā)病年份，莖腐病田間發(fā)病率在5%～10%，在病害重發(fā)年份，田間發(fā)病率可達(dá)20%～30%，一些高感病品種的發(fā)病率達(dá)40%～100%[2]。目前，最經(jīng)濟(jì)有效的防治手段是培育抗病品種。李莉等[3]研究表明，利用分子標(biāo)記輔助選擇（markerassistedselection，MAS）結(jié)合常規(guī)育種方法，可快速有效地定向改良骨干系的抗病性，為抗病新品種選育提供優(yōu)良的親本材料。

Yang等[4]用自交系1145×Y331的F2、BC2F1和BC3F1群體作為研究群體，證實(shí)qRfg1為抗莖腐病主效QTL，通過(guò)追蹤BC4F1至BC6F1代的精細(xì)定位研究，認(rèn)為qRfg1通過(guò)發(fā)揮遺傳能力能顯著提高玉米的抗莖腐病能力。Qing等[5]報(bào)道這個(gè)抗病QTL是一個(gè)包含CCT結(jié)構(gòu)域的基因，命名為ZmCCT，包含CCT結(jié)構(gòu)域的這類(lèi)基因可能通過(guò)影響光周期進(jìn)而影響農(nóng)作物的其他農(nóng)藝性狀，是一個(gè)有重大價(jià)值、可應(yīng)用于作物遺傳改良的關(guān)鍵基因。

1 材料與方法

1.1 供試材料 攜帶抗性基因的為玉米1145自交系，1145抗病強(qiáng)、抗譜廣[6]，0908是安徽豐大種業(yè)選育的玉米骨干自交系，但是在莖腐病易發(fā)地區(qū)表現(xiàn)感病。本研究以1145和0908分別為供體和受體材料，以及1145×0908的F1、F2為測(cè)試材料。

1.2 DNA提取 采用堿煮法提取[7]，切取1/20大小的玉米籽粒胚乳，加入40mL的0.2Mol/L的氫氧化鈉水溶液，在100℃條件下水浴3min，再加入60mL的0.17Mol/L的tris-HCL，在100℃條件下水浴1min，取出后放4℃冰箱備用。

1.3 PCR擴(kuò)增 含Mg2+的10X Buffer 2μL，10mM的dNTP 0.4μL，5μM的如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列和5μM的如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列各2μL，從待測(cè)玉米中提取的基因組DNA 1μL，5U/μL的taq酶0.5μL，其余為超純水，反應(yīng)體積為20μL，滴加1滴礦物油覆蓋;PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃5min;94℃60s，53.5℃60s，72℃60s，35個(gè)循環(huán);72℃10min。

1.4 聚丙烯酰胺電泳檢測(cè) 用6%的聚丙烯酰胺變性凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，主要包括以下3個(gè)步驟：（1）制膠：稱(chēng)取9.6g尿素，加45mL蒸餾水和8mL 10×TBE，攪拌溶解，加入12mL40%丙烯酰胺溶液，混勻后加入0.8mL 10%過(guò)硫酸銨和35μL TEMED，攪拌均勻后立即注入已用瓊脂糖凝膠封口的玻璃板中，注滿后傾斜放置。插入梳子，靜置，使膠凝固;（2）點(diǎn)樣：待膠完全凝固后，小心拔出梳子，盡量保持點(diǎn)樣孔完整。將玻璃板固定垂直電泳槽上，加入適量的1×TBE電泳緩沖液;取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，每管PCR產(chǎn)物中加入4μL上樣緩沖液（0.25%溴酚藍(lán)、0.25%二甲苯氰、50%甘油），混勻后用微量進(jìn)樣器吸5μL注入點(diǎn)樣孔;（3）電泳：調(diào)電壓至200V，電泳時(shí)間約3～4h。電泳完畢后，將玻璃板從電泳槽上拆下，取出凝膠，在蒸餾水中漂洗2次;轉(zhuǎn)移至0.1%AgNO3溶液中染色，在搖床上輕搖約10min;然后將凝膠轉(zhuǎn)移至蒸餾水中漂洗2次;最后轉(zhuǎn)入顯色液（6g氫氧化鈉、0.076g四硼酸鈉、1.6mL甲醛，加水定容至400mL）中顯色約10min，著色后用水漂洗2次，終止顯色反應(yīng)并去除附著的顯色液。用凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果。

1.5 引物設(shè)計(jì)

1.5.1 雙親基因組擴(kuò)增和測(cè)序 采用堿煮法提取1145和0908葉片的基因組DNA，以Qing等[5]公布的序列，設(shè)計(jì)引物，由核苷酸序列5′-tctggcaggattggaaaatatct-3′和核苷酸序列5′-atatcgcagaatctggtagcca-3′組成，委托北京梓熙生物公司合成后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送去測(cè)序，測(cè)序公司為北京梓熙生物公司。

1.5.2 引物設(shè)計(jì) 測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行在線比對(duì)，結(jié)果見(jiàn)圖1。圖中虛線區(qū)域表示41bp的缺失，其中query代表1145父本，高抗莖腐病的序列;sbjct代表0908母本，不抗莖腐病的序列。表明0908在此區(qū)域多了41bp堿基。根據(jù)圖1的測(cè)序比對(duì)結(jié)果，利用在線引物設(shè)計(jì)軟件Primer3.0設(shè)計(jì)引物。在跨越2個(gè)序列有41bp插入缺失差異區(qū)域設(shè)計(jì)引物。設(shè)計(jì)完成的新引物命名為ZmCCT-2016，上游引物核苷酸序列為5′-ctagttcatttttcaagatc-3′，下游引物核苷酸序列為5′-atatcgcagaatctggtagcca-3′。委托北京梓熙生物公司合成。上游引物和下游引物均位于基因ZmCCT內(nèi)部功能區(qū)域。

1.6 莖腐病病菌接種與調(diào)查 在玉米播種時(shí)、覆土前，將帶有病原菌的玉米籽粒均勻蓋在種子上面、種后灌溉1次，此后保持充足的土壤水分。所使用的病原菌由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。發(fā)病后，通過(guò)田間鑒定，葉片莖腐或黃枯，果穗倒掛，莖基變軟變褐并腐爛的，則認(rèn)為是感病株，其他記為抗病植株。對(duì)田間調(diào)查結(jié)果進(jìn)行記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物效果 利用新合成的引物擴(kuò)增1145和0908以及兩者的雜交種F1。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，快速銀染法染色并觀察拍照，見(jiàn)圖1。圖中0908、1145和雜交種，每個(gè)材料各2個(gè)重復(fù)，Marker大小為250bp。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，從擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖可以清晰地看出，1145只有1條電泳帶，經(jīng)測(cè)序所述電泳帶對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物為274bp堿基片段;0908只有1條電泳帶，經(jīng)測(cè)序所述電泳帶對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物為233bp堿基片段;雜交品種有2條電泳帶，經(jīng)測(cè)序所述電泳帶對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物為274bp和233bp堿基片段。圖1結(jié)果顯示，新設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增效果好，電泳帶型清晰無(wú)雜帶，引物可用于2種基因型的鑒別。

2.2 擴(kuò)增產(chǎn)物與玉米莖腐病抗性性狀的相關(guān)性 以高抗莖腐病材料1145和不抗莖腐病材料0908作親本，兩者雜交后自交的420個(gè)F2 代材料作為試驗(yàn)對(duì)象。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，銀染法染色并觀察拍照記錄，其中純合274bp有103株，純合233bp有97株，雜合帶型有220株。同時(shí)，對(duì)這420株材料進(jìn)行接種鑒定。由表1可知，供試玉米樣本中存在純合274bp有103株，其中101株表現(xiàn)為抗病，有2株感病;而不帶有274bp片段的97個(gè)材料中92株感病，有5株抗病;雜合的220株，216株表現(xiàn)為抗病，4株感病;兩者的一致性達(dá)到97.0%。因此，新設(shè)計(jì)的引物ZmCCT-2016是與莖腐病抗性性狀相關(guān)位點(diǎn)相緊密連鎖的分子標(biāo)記，完全可用于玉米分子標(biāo)記輔助育種。

3 討論與結(jié)論

由于抗性品種的缺乏與耕作制度的變化（秸稈還田、保護(hù)性耕作等），莖腐病等土傳性病害已成為我國(guó)玉米生產(chǎn)的主要病害之一[8]。隨著種植方式的改變以及缺少抗菌譜廣的抗性穩(wěn)定品種，莖腐病危害逐年加重，已成為繼大斑病、小斑病和絲黑穗病后我國(guó)玉米生產(chǎn)上又一重要病害[9]。分子標(biāo)記輔助選擇育種以其準(zhǔn)確、快速，且不受環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于作物育種實(shí)踐中[10-11]。在玉米莖腐病抗性分子育種方面，已經(jīng)成功選育出多個(gè)優(yōu)良抗病新品系或新材料[12-13]。玉米莖腐病抗性是典型的質(zhì)量數(shù)量性狀，容易受環(huán)境影響，常規(guī)育種中的表型選擇往往不準(zhǔn)確，育種效率低。分子標(biāo)記輔助育種是通過(guò)標(biāo)記基因型分析和選擇代替表型選擇，選擇準(zhǔn)確性和育種效率大大提高[14]。

本研究篩選獲得的分子標(biāo)記，在F1群體中的抗病表型選擇效率達(dá)97.0%;設(shè)計(jì)的分子標(biāo)記位于莖腐病抗性基因ZmCCT的基因內(nèi)部，與玉米莖腐病抗性基因ZmCCT緊密連鎖;與非基因內(nèi)部標(biāo)記相比，新設(shè)計(jì)的InDel分子標(biāo)記不會(huì)與基因功能出現(xiàn)分離，可以更有效地提高育種效率。

本研究設(shè)計(jì)的分子標(biāo)記可以很好地?cái)U(kuò)增經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單處理所得到提取的基因組，克服了現(xiàn)有技術(shù)中與該基因緊密連鎖的其他分子標(biāo)記需要依靠CTAB等較為煩瑣的方法提取基因組的問(wèn)題，更加簡(jiǎn)便實(shí)用，進(jìn)一步提高了育種效率。

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（責(zé)編：張宏民）