丹參多酚酸鹽對(duì)腎間質(zhì)纖維化模型大鼠的改善作用及機(jī)制研究

魏丹丹 張超 朱星昊 梁磊 李閃閃 劉湘花 李真珍 蔣士卿

中圖分類號(hào) R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）08-0915-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.08.04

摘 要 目的：研究丹參多酚酸鹽對(duì)腎間質(zhì)纖維化（RIF）模型大鼠的改善作用及可能機(jī)制。方法：將50只雄性SD大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組、模型組、氯沙坦組（陽(yáng)性對(duì)照組，9 mg/kg）和丹參多酚酸鹽低、高劑量組（18、36 mg/kg），每組10只。除正常組外，其余各組大鼠均灌胃腺嘌呤250 mg/kg建立RIF模型。造模結(jié)束后，各給藥組大鼠灌胃相應(yīng)藥物，正常組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，灌胃體積均為10 mL/kg，每天1次，連續(xù)30天。末次給藥后，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)大鼠血清中肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）和尿液中24 h尿蛋白（24 h UPro）水平;采用蘇木精-伊紅染色法和Masson染色法分別觀察大鼠腎組織病理學(xué)特點(diǎn)和纖維化情況，對(duì)腎小管損傷、腎小球硬化程度進(jìn)行評(píng)分并計(jì)算腎組織陽(yáng)性染色面積百分比;采用免疫組化法和Western blot法分別測(cè)定大鼠腎組織中Wnt蛋白（Wnt5a、Wnt5b）、β-聯(lián)蛋白（β-catenin）的表達(dá)水平。結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠Scr、BUN、24 h UPro水平和腎小管損傷評(píng)分、腎小球硬化評(píng)分、腎組織陽(yáng)性染色面積百分比以及Wnt5a、β-catenin蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05），Wnt5b蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）;顯微鏡下可見大鼠腎組織出現(xiàn)系膜增生、纖維組織增多、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理學(xué)變化。與模型組比較，氯沙坦組和丹參多酚酸鹽低、高劑量組大鼠的上述指標(biāo)均顯著改善（P<0.05），且丹參多酚酸鹽的作用具有一定的劑量依賴性趨勢(shì)。結(jié)論：丹參多酚酸鹽對(duì)腺嘌呤致RIF模型大鼠具有改善作用，其機(jī)制可能與抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞 丹參多酚酸鹽;腺嘌呤;腎間質(zhì)纖維化;腎功能;Wnt蛋白/β-聯(lián)蛋白信號(hào)通路;大鼠

Study on Improvement Effect of Salvianolate on Renal Interstitial Fibrosis Model Rats and Its Mechanism

WEI Dandan1，ZHANG Chao1，ZHU Xinghao1，LIANG Lei1，LI Shanshan1，LIU Xianghua1，LI Zhenzhen2，JIANG Shiqing1（1. First Clinical College， Henan University of TCM， Zhengzhou 450046， China; 2. Medical Research Center， the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University， Zhengzhou 450052， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the improvement effect of salvianolate on renal interstitial fibrosis （RIF） model rats and its possible mechanism. METHODS： Totally 50 male SD rats were randomly divided into normal group， model group， losartan group （positive control group， 9 mg/kg） and salvianolate low-dose and high-dose groups （18， 36 mg/kg） according to body weight， with 10 rats in each group. Except for normal group， other groups were given adenine 250 mg/kg intragastrically to establish RIF model. After modeling， administration groups were given relevant medicine intragastrically， and normal group and model group were given constant volume of normal saline intragastrically， the volume was 10 mL/kg， once a day， for consecutive 30 days. After last medication， the serum levels of creatinine （Scr）， urea nitrogen （BUN） and 24 h proteinuria （24 h UPro） were detected by ELISA. HE staining and Masson staining were used to observe the histopathological characteristics and fibrosis of the kidney. The degree of renal tubular injury and glomerulosclerosis were scored， and the percentage of positive staining area of renal tissue was calculated;immunohistochemistry and Western blot assay were used to determine the protein expression of Wnt5a， Wnt5b， and β-catenin. RESULTS： Compared with normal group， Scr， BUN and 24 h UPro levels， renal tubular injury score，? glomerulosclerosis score， the percentage of positive staining area in renal tissue， the protein expression of Wnt5a and β-catenin were increased significantly in model group （P<0.05）， while the expression of Wnt5b protein was decreased significantly （P<0.05）. Pathological changes such as mesangial hyperplasia， fibrous tissue increase and inflammatory cell infiltration were observed under microscope. Compared with model group， above indexes of rats were improved significantly in losartan group， salvianolate low-dose and high-dose groups （P<0.05）， and the effect of salvianolate had dose-dependent trend. CONCLUSIONS： Salvianolate has the improvement effect on RIF model rats induced by adenine， and its mechanism may be related to inhibition of Wnt/β-catenin signal pathway.

KEYWORDS? ?Salvianolate; Adenine; Renal interstitial fibrosis; Renal function; Wnt/β-catenin signal pathway; Rat

腎間質(zhì)纖維化（RIF）是各種病理因素引發(fā)的慢性腎病發(fā)展至終末期腎衰竭的主要病理特征，主要包括腎血管纖維化、腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化[1-2]。RIF發(fā)生的主要環(huán)節(jié)包括炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、致纖維化因子激活、腎小管上皮細(xì)胞-腎間質(zhì)肌成纖維細(xì)胞分化以及細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積等[3]。目前研究認(rèn)為，纖維化期是腎病治療的關(guān)鍵時(shí)期，若患者在此時(shí)期能得到及時(shí)、有效的治療，便能有效緩解其疾病進(jìn)展，從而提高患者生活質(zhì)量[4]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，RIF的主要病機(jī)為腎脈瘀阻，其中瘀血是主要的致病因素[5]。因此，可采用祛瘀通腎法進(jìn)行治療，發(fā)揮活血祛瘀、恢復(fù)腎氣、改善腎臟缺血狀態(tài)、調(diào)節(jié)微循環(huán)和腎血流動(dòng)力學(xué)異常狀態(tài)等作用，以減緩RIF的發(fā)展。丹參多酚酸鹽為活血化瘀中藥丹參Salvia mil- tiorrhiza Bge.的主要活性成分，目前主要用于心腦血管疾病的治療，其具有較好的抗氧化、促進(jìn)血管新生等作用[6]。Wnt蛋白/β-聯(lián)蛋白（Wnt/β-catenin）信號(hào)通路是目前研究腎臟固有細(xì)胞轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞（即上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化調(diào)控機(jī)制）的主要通路之一，故可通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化來延緩腎纖維化進(jìn)程[7-9]。鑒于此，本研究基于中醫(yī)祛瘀通絡(luò)的治療理念，選用活血化瘀類常用中藥丹參的活性成分丹參多酚酸鹽對(duì)RIF模型大鼠進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)大鼠腎臟功能及纖維化的影響，并通過考察Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況來探討丹參多酚酸鹽對(duì)RIF模型大鼠的改善作用及可能機(jī)制，旨在為丹參多酚酸鹽的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

MR-96TB型酶標(biāo)儀購(gòu)自騁克儀器（上海）有限公司;YD-6D型組織包埋機(jī)、YD-A型組織攤片機(jī)、YD-B型組織烤片機(jī)均購(gòu)自金華市科迪儀器設(shè)備有限公司;RM2235型石蠟切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica公司;D3024R型臺(tái)式高速冷凍微量離心機(jī)購(gòu)自大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司;DN260型滅菌鍋購(gòu)自浙江新豐醫(yī)療器械有限公司;HWS-24型水浴鍋購(gòu)自上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;SG-300型顯微鏡購(gòu)自蘇州神鷹光學(xué)有限公司;ChemiScope 6200 Touch型化學(xué)發(fā)光成像儀購(gòu)自上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

注射用丹參多酚酸鹽[批號(hào)18120224，規(guī)格每瓶裝50 mg（含丹參乙酸鎂40 mg）]購(gòu)自上海綠谷制藥有限公司;氯沙坦鉀片（批號(hào)429001，規(guī)格50 mg）購(gòu)自重慶科瑞制藥（集團(tuán)）有限公司;腺嘌呤（批號(hào)S18009）、Masson染色試劑盒（批號(hào)G1340）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;血尿素氮（BUN）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（批號(hào)C011-1-1）、血肌酐（Scr）ELISA試劑盒（批號(hào)C013-1-1）、24 h尿蛋白（24 h UPro）ELISA試劑盒（批號(hào)C035-2-1）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所;兔SP試劑盒（批號(hào)SP-9001）、DAB顯色試劑盒（批號(hào)ZLI-9017）均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒（批號(hào)C05-02001）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳（SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒（批號(hào)C-0047）、兔抗大鼠Wnt5a單克隆抗體（批號(hào)bs-1948R）、兔抗大鼠Wnt5b單克隆抗體（批號(hào)bs-8010R）、兔抗大鼠β-catenin單克隆抗體（批號(hào)bs-1165R）均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;兔抗大鼠β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）單克隆抗體（批號(hào)GB12001）、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（批號(hào)GB23303）均購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司;其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為蒸餾水。

1.3 動(dòng)物

健康SPF級(jí)SD大鼠50只，雄性，體質(zhì)量150～200 g，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK-（豫）2015-0004。動(dòng)物購(gòu)買后按嚙齒類動(dòng)物一級(jí)環(huán)境條件飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基地，實(shí)驗(yàn)過程依照河南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)和國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。所有大鼠均以普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)14天后開始實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將50只大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組、模型組、氯沙坦組（陽(yáng)性對(duì)照，9 mg/kg，成人臨床用量的等效劑量）和丹參多酚酸鹽低、高劑量組（18、36 mg/kg，分別為成人臨床用量的等效劑量和2倍等效劑量），每組10只。除正常組外，其余各組大鼠均按250 mg/kg灌胃2.5%的腺嘌呤生理鹽水混懸液以復(fù)制RIF模型：先每天灌胃1次，連續(xù)12 天;然后改為隔天灌胃1次，連續(xù)12 天，共24天[1];正常組大鼠在造模期間同步灌胃等體積生理鹽水。造模結(jié)束后，各給藥組大鼠灌胃相應(yīng)藥物（以生理鹽水溶解），正常組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水;灌胃體積均為10 mL/kg，每天1次，連續(xù)30天。

2.2 大鼠標(biāo)本采集及處理

末次給藥后，收集各組大鼠24 h尿液。然后腹腔注射氨基甲酸乙酯麻醉。于腹主動(dòng)脈取血，血樣以3 000 r/min離心10 min，取上層血清。然后將大鼠處死，解剖取其腎組織，以生理鹽水沖洗后，一部分保存于4 %多聚甲醛溶液中用于制作病理切片;另一部分保存于凍存管中，經(jīng)液氮速凍后放入-80 ℃冰箱中凍存，用于Western blot實(shí)驗(yàn)。

2.3 大鼠血清中Scr、BUN水平和尿液中24 h UPro水平檢測(cè)

采用ELISA法以酶標(biāo)儀檢測(cè)血清中Scr、BUN水平和尿液中24 h UPro水平，具體操作嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明書方法進(jìn)行。

2.4 大鼠腎臟病理組織學(xué)觀察

2.4.1 蘇木精-伊紅染色 取4%多聚甲醛溶液固定的腎組織適量，經(jīng)脫水、透明、包埋后切片（厚度約4 μm），進(jìn)行常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色，然后在顯微鏡下進(jìn)行觀察。每張切片隨機(jī)選出5個(gè)不重疊的腎皮質(zhì)區(qū)，根據(jù)染色程度對(duì)腎小管損傷和腎小球硬化情況分別進(jìn)行評(píng)分：正常，記為0分;輕度染色（染色面積≤25%），記為1分;中度染色（染色面積>25%～50%），記為2分;重度染色（染色面積>50%～75%），記為3分;極重度染色（染色面積>75%），記為4分[1]。取平均值作為評(píng)價(jià)結(jié)果。

2.4.2 Masson染色 另取上述石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟后，按Masson試劑盒說明書方法進(jìn)行染色，其中肌纖維呈紅色，膠原纖維呈藍(lán)色。采用Image J v1.8.0軟件測(cè)定每個(gè)視野中藍(lán)色陽(yáng)性染色面積占總面積的百分比（簡(jiǎn)稱“陽(yáng)性染色面積百分比”），以此評(píng)價(jià)腎小管萎縮及腎間質(zhì)纖維化水平[1]。

2.5 大鼠腎組織中Wnt5a、Wnt5b、β-catenin蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

2.5.1 免疫組化法 取石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化后，H2O2封閉，然后以磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗，以檸檬酸鹽緩沖液于121 ℃下熱修復(fù)，再滴加山羊血清封閉液，室溫孵育1 h后傾去液體，分別滴加Wnt5a、Wnt5b、β-catenin一抗（稀釋比例均為1 ∶ 100），4 ℃孵育過夜;滴加HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（稀釋比例均為1 ∶ 100），37 ℃孵育20 min。DAB顯色，水沖洗，蘇木精復(fù)染1～2 min;1%鹽酸乙醇溶液分化，水再次沖洗;然后經(jīng)常規(guī)脫水、透明、封片后置于顯微鏡下檢示（目標(biāo)蛋白會(huì)被染成棕黃色），每組選取3張切片，采用Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)定每個(gè)視野中細(xì)胞的積分光密度（IOD）值，取平均值作為檢測(cè)結(jié)果。

2.5.2 Western blot法 取腎組織，用冷PBS洗去血污后剪成小塊置于勻漿管中，加入10倍體積的RIPA裂解液徹底勻漿，冰浴30 min后，以12 000 r/min離心10 min，收集上清，即為總蛋白溶液。用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒定量分析后，加入上樣緩沖液，沸水浴15 min使蛋白變性。取變性后蛋白適量，進(jìn)行SDS-PAGE（濃縮膠電壓75 V，分離膠電壓120 V），然后以300 mA恒流電轉(zhuǎn)30 min至聚偏二氟乙烯膜上;5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，加入Wnt5a、Wnt5b、β-catenin、β-actin一抗（稀釋比例均為1 ∶ 3 000），4 ℃孵育過夜;TBST漂洗5 min×3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（稀釋比例均為1 ∶ 3 000），室溫孵育30 min;TBST漂洗5 min×3次，使用ECL試劑盒顯色，于化學(xué)發(fā)光成像儀上成像，然后采用Image J v1.8.0軟件測(cè)定條帶灰度值，以目標(biāo)蛋白條帶與內(nèi)參蛋白（β-actin）條帶的灰度值比值表示目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析;方差齊者組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊者組間兩兩比較采用Dennetts檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 丹參多酚酸鹽對(duì)RIF模型大鼠血清中Scr、BUN水平和尿液中24 h UPro水平的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清中Scr、BUN水平和尿液中24 h UPro水平均顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠血清中Scr、BUN水平和尿液中24 h UPro水平均顯著降低（P<0.05），而各給藥組血清中上述指標(biāo)水平組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組大鼠血清中Scr、BUN水平和尿液中24 h UPro水平檢測(cè)結(jié)果見表1。

3.2 丹參多酚酸鹽對(duì)RIF模型大鼠腎臟病理組織學(xué)的影響

3.2.1 HE染色結(jié)果 病理取材時(shí)可見模型組大鼠腎臟代償性增大，表面存在凸起。HE染色結(jié)果顯示：正常組大鼠腎小管結(jié)構(gòu)排列整齊，腎小球形態(tài)規(guī)則，無系膜增生，間質(zhì)正常，未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn);模型組大鼠可見系膜增生，腎小管擴(kuò)張或萎縮，腎小球硬化且形態(tài)不規(guī)則，球囊粘連，纖維化組織增多，間質(zhì)增寬，可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn);丹參多酚酸鹽低、高劑量組和氯沙坦組大鼠腎小管擴(kuò)張或萎縮減輕，炎性細(xì)胞減少。與正常組比較，模型組大鼠腎小管損傷評(píng)分、腎小球硬化評(píng)分均顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠腎小管損傷評(píng)分、腎小球硬化評(píng)分均顯著下降（P<0.05），而各給藥組上述指標(biāo)評(píng)分組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組大鼠腎組織HE染色顯微圖見圖1，腎小管損傷評(píng)分、腎小球硬化評(píng)分結(jié)果見表2。

3.2.2 Masson染色結(jié)果 正常組大鼠腎間質(zhì)可見少量纖維化;模型組大鼠腎間質(zhì)纖維化程度明顯增加;氯沙坦組和丹參多酚酸鹽低、高劑量組大鼠腎間質(zhì)纖維化程度均較模型組明顯改善。與正常組比較，模型組大鼠腎組織陽(yáng)性染色面積百分比顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠腎組織陽(yáng)性染色面積百分比均顯著降低（P<0.05）。與氯沙坦組比較，丹參多酚酸鹽低劑量組大鼠腎組織陽(yáng)性染色面積百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但丹參多酚酸鹽高劑量組大鼠腎組織陽(yáng)性染色面積百分比顯著降低（P<0.05）。與丹參多酚酸鹽低劑量組比較，丹參多酚酸鹽高劑量組大鼠腎組織陽(yáng)性染色面積百分比顯著降低（P<0.05）。各組大鼠腎組織Masson染色顯微圖見圖2，陽(yáng)性染色面積百分比檢測(cè)結(jié)果見表2。

3.3 丹參多酚酸鹽對(duì)RIF模型大鼠腎組織中Wnt5a、Wnt5b、β-catenin蛋白表達(dá)的影響

3.3.1 免疫組化檢測(cè)結(jié)果 與正常組比較，模型組大鼠腎組織中有大量Wnt5a、β-catenin蛋白沉積，其IOD值均顯著升高（P<0.05）;有少量Wnt5b蛋白沉積，其IOD值顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠腎組織中Wnt5a、β-catenin蛋白沉積減少，其IOD值均顯著降低（P<0.05）;Wnt5b蛋白沉積增多，其IOD值均顯著升高（P<0.05）。與氯沙坦組比較，丹參多酚酸鹽低劑量組大鼠各蛋白沉積無明顯變化，其IOD值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;但丹參多酚酸鹽高劑量組大鼠腎組織中Wnt5b蛋白沉積減少，其IOD值顯著降低（P<0.05）。與丹參多酚酸鹽低劑量組比較，丹參多酚酸鹽高劑量組大鼠腎組織中有少量β-catenin蛋白沉積，其IOD值顯著降低（P<0.05）。各組大鼠腎組織中Wnt5a、Wnt5b、β-catenin蛋白表達(dá)的免疫組化染色圖見圖3，IOD值檢測(cè)結(jié)果見表3。

3.3.2 Western blot檢測(cè)結(jié)果 與正常組比較，模型組大鼠腎組織中Wnt5a、β-catenin蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05），Wnt5b蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠腎組織中Wnt5a、β-catenin蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），Wnt5b蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）。與氯沙坦組比較，丹參多酚酸鹽低劑量組大鼠腎組織中各蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但丹參多酚酸鹽高劑量組大鼠腎組織中Wnt5a蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。與丹參多酚酸鹽低劑量組比較，丹參多酚酸鹽高劑量組大鼠腎組織中β-catenin蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。各組大鼠腎組織中Wnt5a、Wnt5b、β-catenin蛋白表達(dá)的電泳圖見圖4，表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果見表4。

4 討論

RIF是慢性腎病的共同特征之一，其主要特征是肌纖維母細(xì)胞浸潤(rùn)和細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積，常會(huì)導(dǎo)致腎功能喪失[9]。腺嘌呤是嘌呤類含氮雜環(huán)化合物，主要用于化療藥物引起的白細(xì)胞減少癥的治療[10]。在黃嘌呤氧化酶作用下，腺嘌呤可生成2，8-二羥基腺嘌呤而使腎小管堵塞，導(dǎo)致氮質(zhì)化合物排出受到影響，從而造成血清中Scr、BUN和尿酸水平升高。而血清中結(jié)晶的過飽和尿酸會(huì)在腎小管、間質(zhì)及腎小球部位沉積形成異物，使腎局部發(fā)生肉芽腫性炎癥，引起大量腎單位損傷，最終引發(fā)RIF [11]。本研究采用腺嘌呤構(gòu)建大鼠RIF模型，發(fā)現(xiàn)模型大鼠血清中Scr、BUN及尿液中24 h UPro水平均顯著升高，腎纖維化組織增多、間質(zhì)增寬，表明造模成功。該模型由腺嘌呤化合物沉積于腎小管及間質(zhì)引起，與臨床上腎后性梗阻形成的慢性腎衰類似[12]，可以用于RIF的研究。

丹參是唇形科植物丹參的干燥根及根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰之功效[13]。丹參多酚酸鹽是由從丹參中提取的多酚酸鹽類化合物，可依靠多途徑保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，且具有抗纖維化作用[14]。根據(jù)RIF中醫(yī)病機(jī)，并結(jié)合纖維化的臨床及病理特點(diǎn)，本課題組認(rèn)為活血化瘀通絡(luò)能改善腎纖維化狀態(tài)，故選用丹參多酚酸鹽為治療藥物。氯沙坦鉀片是血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑類降壓藥，除能有效控制患者血壓、減少心血管并發(fā)癥外，還能降低尿蛋白水平及保護(hù)腎臟，且已有多篇腎纖維化研究文獻(xiàn)選擇其作為陽(yáng)性對(duì)照藥物[15-16]，故本研究選用氯沙坦鉀片為陽(yáng)性藥物。本研究結(jié)果顯示，丹參多酚酸鹽能降低RIF模型大鼠血清中Scr、BUN水平及尿液中24 h UPro水平，并使其腎臟纖維化組織和炎性細(xì)胞減少、腎小管擴(kuò)張或萎縮減輕，表明丹參多酚酸鹽對(duì)RIF模型大鼠具有較好的改善作用，且丹參多酚酸鹽的作用具有一定的劑量依賴性趨勢(shì)。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路因果蠅基因Wingless而得名，可以調(diào)控胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化過程，是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化調(diào)控機(jī)制的主要通路之一[8-9]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在正常腎臟中處于沉默狀態(tài)，而當(dāng)該通路相關(guān)蛋白表達(dá)增多時(shí)，腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程就會(huì)相對(duì)較快[9]。因此，可以通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活化來延緩腎纖維化進(jìn)程[9]。Wnt蛋白是由Wnt基因編碼的一種分泌型糖蛋白，也是Wnt/β-catenin信號(hào)途徑的重要因子，具有Wnt5a、Wnt5b等多個(gè)亞型[17-18]。其中，Wnt5a兼有誘導(dǎo)細(xì)胞分化成熟和異常激活Wnt/β-catenin信號(hào)途徑的功能，而Wnt5b則對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)途徑具有抑制作用[19]。β-catenin是Wnt/β-catenin信號(hào)途徑的核心因子之一，其被活化后可在細(xì)胞中大量聚集，并與DNA親和蛋白LEF/TCF結(jié)合，激活CyclinD1、C-myc等靶基因，從而啟動(dòng)細(xì)胞核中的細(xì)胞復(fù)制程序;此外，β-catenin還可與E-鈣黏蛋白結(jié)合形成復(fù)合體，從而促進(jìn)細(xì)胞間黏附，當(dāng)其表達(dá)缺失時(shí)，細(xì)胞間黏附作用將降低或喪失[20-22]。本研究結(jié)果顯示，RIF模型大鼠腎組織中Wnt5a、β-catenin蛋白表達(dá)上調(diào)，Wnt5b蛋白表達(dá)下調(diào);而丹參多酚酸鹽可以顯著下調(diào)RIF模型大鼠腎組織中Wnt5a、β-catenin蛋白表達(dá)，上調(diào)Wnt5b蛋白表達(dá)，且其作用具有一定的劑量依賴性趨勢(shì)。

綜上所述，Wnt/β-catenin信號(hào)途徑在RIF模型大鼠腎組織中存在異常激活現(xiàn)象，而丹參多酚酸鹽可以通過下調(diào)Wnt5a、β-catenin蛋白的表達(dá)以及上調(diào)Wnt5b蛋白的表達(dá)來抑制該信號(hào)途徑的異常激活，從而發(fā)揮對(duì)RIF模型大鼠的改善作用，且在本研究劑量范圍內(nèi)具有一定的劑量依賴性趨勢(shì)。以上研究為丹參多酚酸鹽在腎纖維化治療方面的深入開發(fā)利用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但其更多的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

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（收稿日期：2020-12-02 修回日期：2021-02-23）

（編輯：林 靜）