免疫層析試紙條技術(shù)在食品安全領(lǐng)域的研究進(jìn)展

閆靈芝

（運(yùn)城學(xué)院生命科學(xué)系，山西運(yùn)城 044000）

食品安全是指食品無毒、無害，符合應(yīng)當(dāng)有的營養(yǎng)要求，對(duì)人體健康不造成任何急性、亞急性或者慢性危害。隨著食品工業(yè)的發(fā)展，不法商販為了謀取更大的利潤(rùn)，向食品中添加非法添加物，與此同時(shí)由食源性致病菌造成的食品污染事件頻頻爆發(fā)，農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥、獸藥殘留超標(biāo)問題屢禁不止。國內(nèi)外的食品安全惡性事件接連不斷的發(fā)生，食品安全問題已經(jīng)成為全球性的大問題。因此，發(fā)展食品安全快速檢測(cè)技術(shù)對(duì)于有害物質(zhì)的分析尤為重要。

ICTS結(jié)合免疫技術(shù)和色譜層析技術(shù)，作為食品安全快速檢測(cè)傳感器的一種，具有操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)快速，成本低廉等特點(diǎn)，這些優(yōu)點(diǎn)也使得試紙條技術(shù)對(duì)于致病菌[1]、激素殘留[2]、細(xì)菌毒素[3]、重金屬[4]以及農(nóng)獸藥殘留[5]等有毒有害物質(zhì)的檢測(cè)越來越廣泛。傳統(tǒng)的免疫層析試紙條主要以膠體金作為標(biāo)記物，通過金顆粒在檢測(cè)線處的聚集對(duì)待檢目標(biāo)物進(jìn)行定性或者半定量檢測(cè)，這種檢測(cè)方法檢測(cè)靈敏度較低，同時(shí)最早的試紙條只能用來檢測(cè)單種目標(biāo)物。為了提升傳統(tǒng)試紙條的檢測(cè)性能，眾多研究者做了巨大的努力。本論文主要對(duì)近年來試紙條的檢測(cè)新技術(shù)進(jìn)行綜述，以期為試紙條的進(jìn)一步開發(fā)利用提供借鑒。

1 傳統(tǒng)的免疫層析試紙條的檢測(cè)原理

傳統(tǒng)的免疫層析試紙條主要由樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜、吸水墊以及聚氯乙烯（Polyvinylchloride，PVC）襯板五部分組成，其相互交疊順序如圖1所示。 同時(shí)在硝酸纖維素膜上包被兩條線，檢測(cè)線（test line，T線）和質(zhì)控線（control line，C線）。根據(jù)待檢測(cè)物質(zhì)分子量的大小可以分為雙抗體夾心法和競(jìng)爭(zhēng)抑制法。

1.1 雙抗體夾心法

雙抗體夾心法主要用來檢測(cè)具有多個(gè)抗原表位的大分子物質(zhì)和顆粒性抗原（細(xì)菌、病毒和蛋白質(zhì)等），當(dāng)樣品溶液滴加到樣品墊時(shí)，樣品通過毛細(xì)管虹吸作用和金標(biāo)墊處的金標(biāo)抗體結(jié)合形成待檢抗原-金標(biāo)抗體復(fù)合物，隨著免疫層析的繼續(xù)進(jìn)行，該復(fù)合物會(huì)和T線處的捕獲抗體結(jié)合，形成捕獲抗體-待檢抗原-金標(biāo)抗體復(fù)合物的夾心結(jié)構(gòu)。未結(jié)合的金標(biāo)抗體和待檢抗原-金標(biāo)抗體復(fù)合物會(huì)和C線處的羊抗鼠IgG結(jié)合。在雙抗體夾心法中T線處的信號(hào)顏色會(huì)隨著待檢物的增多而增強(qiáng)。

圖1 免疫層析試紙條示意圖Fig.1 Schematic diagram of ICTS

1.2 競(jìng)爭(zhēng)抑制法

競(jìng)爭(zhēng)抑制法主要用來檢測(cè)小分子物質(zhì)（細(xì)菌毒素、農(nóng)獸藥殘留以及激素等），這種方法在T線處包被的是捕獲抗原，當(dāng)把帶有小分子的待檢溶液滴加到樣品墊時(shí)，待檢小分子隨著層析的作用會(huì)和金標(biāo)抗體結(jié)合形成待檢小分子-金標(biāo)抗體復(fù)合物，該復(fù)合物層析到檢測(cè)線處時(shí)，待檢小分子和捕獲抗原對(duì)于金標(biāo)抗體的特異性位點(diǎn)存在競(jìng)爭(zhēng)作用，使得只有沒和待檢小分子結(jié)合的金標(biāo)抗體才可以和T線處的捕獲抗原結(jié)合，形成捕獲抗原-金標(biāo)抗體復(fù)合物。所以競(jìng)爭(zhēng)法中小分子濃度越高，檢測(cè)線處的信號(hào)強(qiáng)度越弱，并且抗體使用量越少，檢測(cè)靈敏度也會(huì)越高。

2 免疫層析試紙條檢測(cè)技術(shù)發(fā)展方向

2.1 開發(fā)新型納米標(biāo)記材料

納米材料是指三維空間尺寸至少有一維尺寸在1～100 nm范圍內(nèi)的超微粒子，由于其較大的表面積、獨(dú)特的光學(xué)特性、表面帶電性以及較好的生物相容性，作為免疫層析試紙條的標(biāo)記物得到了廣泛的應(yīng)用?；谀z體金試紙條的眾多檢測(cè)弊端，為了提升試紙條的檢測(cè)性能，近年來研究人員對(duì)試紙條的納米標(biāo)記材料進(jìn)行了不斷的探索。目前應(yīng)用于試紙條的納米材料如表1所示。

在免疫層析技術(shù)中，單個(gè)納米材料表現(xiàn)出的信號(hào)強(qiáng)度有限，為了增強(qiáng)試紙條的靈敏度，研究者試圖將單個(gè)納米材料富集起來，材料信號(hào)的富集提高了試紙條標(biāo)記信號(hào)的發(fā)光強(qiáng)度[30]。Xu等[31]以硅納米棒作為載體，將納米金顆粒修飾到硅納米棒上，納米金顆粒在硅納米棒上的富集增強(qiáng)了試紙條的信號(hào)強(qiáng)度，這種方法的檢測(cè)靈敏度比常規(guī)膠體金免疫層析試紙條高50倍。Huang等[32]使用四氧化三鐵作為核，二氧化硅為殼的核殼納米材料作為富集量子點(diǎn)的載體進(jìn)而合成Fe3O4@SiO2@QDs納米材料（圖2），用這種方法檢測(cè)豬尿中的鹽酸克倫特羅，檢測(cè)靈敏度為0.22 ng·mL?1，比常規(guī)膠體金免疫層析試紙條靈敏度高4倍。Zhang等[33]開發(fā)了以硅納米材料為核量子點(diǎn)為殼的納米材料，該材料以帶正點(diǎn)的聚乙烯亞胺作為中間層，使得許多羧基功能化的量子點(diǎn)富集到硅納米材料表面，使其具有較好的發(fā)光性能。用該納米材料檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌，檢測(cè)限為5×102cfu· mL?1。也有研究者將菌體作為納米材料的信號(hào)富集載體，例如Huang等[34]將納米金顆粒富集在細(xì)菌上，以此作為試紙條的信號(hào)標(biāo)簽來檢測(cè)食品中的克倫特羅，對(duì)克倫特羅的檢測(cè)限為0.1 ng mL?1，靈敏度與傳統(tǒng)的膠體金試紙條相比提高了20倍。Bu等[35]利用微生物構(gòu)建了一種新型的試紙條信號(hào)載體，利用納米金顆粒功能化酵母菌和乳酸桿菌，實(shí)現(xiàn)富集金納米顆粒的作用進(jìn)而放大檢測(cè)信號(hào)（圖3），用該試紙條檢測(cè)食品中的赭曲霉毒素A（ochratoxin，OTA），檢測(cè)限為0.1 ng·mL?1，與傳統(tǒng)的膠體金試紙條相比靈敏度可以提高8倍。大量的納米材料聚集在一起提高了試紙條的檢測(cè)靈敏度，靈敏度的提高降低了試紙條對(duì)有毒有害物質(zhì)檢測(cè)的檢測(cè)限，對(duì)食品安全檢測(cè)的意義尤為重要。

2.2 納米材料標(biāo)記羊抗鼠抗體法

傳統(tǒng)的試紙條是利用納米材料標(biāo)記單克隆抗體，羊抗鼠抗體只作為質(zhì)控線上的抗體用來判定試紙條的有效性。但是近年來研究者開始探索將納米材料標(biāo)記羊抗鼠抗體來提高試紙條的檢測(cè)靈敏度。

Yao等[36]使用羧基化的磁性納米粒子標(biāo)記羊抗鼠抗體（magnetic nanoparticles-goat anti mouse antibody，MNPs-GAMA），并將其和未標(biāo)記的單克隆抗體一并加入待檢溶液中，用于檢測(cè)食品中的β-雌二醇（17β-estradiol，E2），當(dāng)檢測(cè)體系中不存在E2時(shí)，檢測(cè)溶液中會(huì)形成單克隆抗體-GAMA-MNPs復(fù)合物，該復(fù)合物會(huì)隨著免疫層析的作用和檢測(cè)線處E2-BSA相結(jié)合，形成E2-BSA-單克隆抗體-GAMAMNPs復(fù)合物，使得檢測(cè)線處呈現(xiàn)MNPs的黃顏色。當(dāng)檢測(cè)體系中存在E2時(shí)，E2和E2-BSA對(duì)于單克隆抗體的競(jìng)爭(zhēng)作用，使得檢測(cè)線處顏色變淺。用該試紙條檢測(cè)食品中的E2，研究發(fā)現(xiàn)和用納米材料標(biāo)記單克隆抗體的傳統(tǒng)方法相比，檢測(cè)靈敏度提高了5倍。同樣的原理，Majdinasab等[37]利用熒光銪納米粒子標(biāo)記羊抗鼠抗體，用未標(biāo)記的單克隆抗體捕獲待檢溶液中的OTA，這種方法對(duì)于OTA的檢測(cè)限可以低至0.4 pg·mL?1，檢測(cè)限降低了100倍。

表1 在免疫層析試紙條技術(shù)中應(yīng)用的納米顆粒Table 1 Application of nanoparticles in ICTS

圖2 Fe3O4@SiO2@QDs的結(jié)構(gòu)模型圖[32]Fig.2 Structural model of Fe3O4@SiO2@QDs[32]

圖3 免疫層析技術(shù)中利用金納米顆粒功能化微生物[35]Fig.3 Gold nanoparticles-functionalized microorganisms in ICTS[35]

這種方法引起靈敏度提高的原因?yàn)槿缦聝蓚€(gè)方面：第一，由于一個(gè)單克隆抗體可以捕獲多個(gè)MNPs-GAMA，磁性納米粒子的聚集致使信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)；第二，由于在溶液中未標(biāo)記的單克隆抗體可以和目標(biāo)分析物更充分的結(jié)合，使得單克隆抗體的用量減少，對(duì)于檢測(cè)小分子的競(jìng)爭(zhēng)法試紙條來說，單克隆抗體的減少會(huì)引發(fā)待檢小分子和小分子-BSA之間對(duì)于單抗更激烈的競(jìng)爭(zhēng)進(jìn)而提高試紙條檢測(cè)的靈敏度。

2.3 待檢目標(biāo)物攜帶信號(hào)法

傳統(tǒng)的免疫層析試紙條是用納米材料標(biāo)記單克隆抗體，用標(biāo)記有信號(hào)的抗體檢測(cè)待檢物質(zhì)。而近年來，有研究者報(bào)道了將待檢測(cè)的物質(zhì)結(jié)合上信號(hào)而不標(biāo)記單克隆抗體。

Wang等[38]開發(fā)了一種表面帶正電的富氮碳納米材料（positively charged nitrogen-rich carbon，pNC），以這種材料吸附沙門氏菌，同時(shí)也將其作為一種顯色的信號(hào)標(biāo)簽，將單克隆抗體包被在檢測(cè)線上。當(dāng)待檢體系中有沙門氏菌時(shí)，將pNC和待檢溶液混合，pNC在靜電作用和氫鍵的作用下捕獲目標(biāo)菌，最后在免疫層析的作用下被檢測(cè)線上的特異性單克隆抗體捕獲，形成pNC-沙門氏菌-抗體的夾心結(jié)構(gòu)。該試紙條對(duì)沙門氏菌的檢測(cè)限為102cfu·mL?1。Bu等[39]將廣譜的抗生素氨芐青霉素（ampicillin, Amp）引入了免疫層析試紙條技術(shù)中，將Amp作為抗體的替代物和目標(biāo)菌結(jié)合，利用羧基化的磁性納米顆粒（magnetite nanoparticles，MNPs）標(biāo)記Amp，使得形成的MNPs-Amp復(fù)合物，該復(fù)合物在待檢溶液中具有結(jié)合，分離和富集目標(biāo)菌的能力。同時(shí)MNPs自帶的黃色可以作為一種試紙條的識(shí)別信號(hào)。該方法的特異性由包被在檢測(cè)線上的特異性單克隆抗體識(shí)別。試紙條對(duì)食品中腸炎沙門氏菌的檢測(cè)范圍可以達(dá)到102～103cfu·mL?1。同時(shí)Bu等[40]將革蘭氏染色的方法和免疫層析試紙條技術(shù)相結(jié)合，當(dāng)待檢溶液中存在目標(biāo)菌時(shí)，目標(biāo)菌可以通過一步染色法和結(jié)晶紫結(jié)合，結(jié)晶紫的紫色也可以作為試紙條的識(shí)別信號(hào)。包被于檢測(cè)線上的高特異性的單克隆抗體可以保證對(duì)目標(biāo)菌檢測(cè)的特異性。這種方法可以在11 min內(nèi)完成對(duì)沙門氏菌的檢測(cè)，檢測(cè)限可以達(dá)到80 cfu mL?1。Wang等[41]利用甘露糖和細(xì)菌鞭毛中的FimH蛋白特異性的識(shí)別機(jī)制，把甘露糖組裝到普魯士藍(lán)納米顆粒上用來檢測(cè)大腸桿菌O157:H7，當(dāng)樣品中存在大腸桿菌時(shí)，普魯士藍(lán)納米顆粒上的甘露糖會(huì)和大腸桿菌相結(jié)合，隨著免疫層析的進(jìn)行，大腸桿菌-普魯士藍(lán)納米顆粒復(fù)合物會(huì)和T線處的單克隆抗體結(jié)合。這種方法對(duì)于大腸桿菌的定量檢測(cè)范圍為102～108cfu·mL?1。對(duì)于致病菌的檢測(cè)，傳統(tǒng)的試紙條通常采用雙抗體夾心方法，需要可以和致病菌不同位點(diǎn)結(jié)合的一對(duì)特異性抗體，而該方法僅需要一種抗體包被于檢測(cè)線，用于目標(biāo)菌的特異性識(shí)別，最終使得檢測(cè)成本大大降低。

2.4 染色法

傳統(tǒng)的試紙條信號(hào)強(qiáng)度較弱，為了提高試紙條的檢測(cè)信號(hào)，研究者試圖通過染色的方法使得檢測(cè)信號(hào)進(jìn)一步增強(qiáng)。Huang等[42]開發(fā)了一種鉑染色的方法，這種方法首先利用膠體金試紙條對(duì)待檢目標(biāo)物進(jìn)行識(shí)別和捕獲進(jìn)而實(shí)現(xiàn)定性和半定量檢測(cè)，緊接著把檢測(cè)區(qū)域剪下來進(jìn)行染色，在硝酸銀和對(duì)苯二酚存在的情況下，會(huì)在檢測(cè)區(qū)域的納米金上包裹銀殼（Au@AgNPs），接著在H2PtCl6和抗壞血酸溶液中，檢測(cè)區(qū)域的Au@AgNPs上包裹鉑殼最終會(huì)形成Au@AgPtNPs。經(jīng)過一系列的染色，試紙條的檢測(cè)靈敏度大幅提高。銀染色法是在銀鹽溶液和對(duì)苯二酚存在的條件下，銀離子被膠體金試紙條上的金納米顆粒催化成金屬銀，進(jìn)而沉積在納米金顆粒表面，不僅使得粒子尺寸變大，也會(huì)形成更容易區(qū)分的黑色檢測(cè)區(qū)，最終也提高檢測(cè)靈敏度[43?44]。Yu等[45]用銀染色法對(duì)玉米樣品中的伏馬毒素B1（fumonisin B1,FB1）和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）進(jìn)行檢測(cè)，在最優(yōu)條件下對(duì)它們的檢測(cè)限分別為2.0和40 ng mL?1。和傳統(tǒng)的膠體金試紙條相比，靈敏度最少提高2倍。金染色法是以氯金酸（HAuCl4）和鹽酸羥胺（NH2OH·HCl）作為增強(qiáng)試劑，在膠體金試紙條檢測(cè)完畢后，通過滴加該增強(qiáng)試劑，膠體金試紙條上的金納米顆粒會(huì)催化HAuCl4和NH2OH·HCl形成新的金顆粒，并覆蓋到原始的納米金顆粒上使得檢測(cè)區(qū)域顏色變深，進(jìn)而提高了檢測(cè)靈敏度[46]。Bu等[47]利用金染色法對(duì)牛奶中的腸炎沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)限為104cfu·mL?1，相比于傳統(tǒng)的膠體金試紙條，檢測(cè)靈敏度提高了100倍。

上述方法中需要額外的步驟對(duì)試紙條進(jìn)行染色，最終使得檢測(cè)時(shí)間延長(zhǎng)。Kim等[48]在試紙條中引入核-殼納米纖維，該納米纖維的殼由水溶性的聚合物組成，核心分別由銀鹽溶液試劑和對(duì)苯二酚組成，這些納米纖維通過靜電紡絲技術(shù)而直接沉積到硝酸纖維素膜T線的前端。隨著樣品的加入，可溶性的納米纖維中的銀鹽溶液試劑和對(duì)苯二酚會(huì)隨著免疫層析的進(jìn)行而溶解出來，進(jìn)而在檢測(cè)線處的金納米顆粒上沉積上銀顆粒，最終使得T線處的顏色變黑。用該種方法可使得檢測(cè)限提高10倍，同時(shí)不會(huì)增加檢測(cè)的時(shí)間（圖4）。

圖4 核殼納米纖維沉積試紙條的原理圖[48]Fig.4 Schematic of a core-shell nanofiber-deposited test strip[48]

2.5 雙結(jié)合墊法

傳統(tǒng)的試紙條使用單個(gè)結(jié)合墊，結(jié)合墊上結(jié)合的是納米材料標(biāo)記的抗待檢目標(biāo)物的單克隆抗體（納米材料-Ab1），這種方法表現(xiàn)出的信號(hào)強(qiáng)度較弱，為了提高試紙條的檢測(cè)性能，研究者開始突破試紙條傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)的限制，開發(fā)了帶有雙結(jié)合墊的免疫層析試紙條。在雙結(jié)合墊方法中，一種方法是在第二個(gè)結(jié)合墊上結(jié)合納米材料標(biāo)記的抗牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）的單克隆抗體（納米材料-Ab2），由于在納米材料標(biāo)記單克隆抗體的過程中，會(huì)用到BSA來封閉納米材料表面的剩余位點(diǎn)，所以納米材料-Ab2會(huì)和納米材料-Ab1上的BSA結(jié)合，形成納米材料-Ab2-納米材料-Ab1復(fù)合物，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了納米材料的聚集，提高了信號(hào)強(qiáng)度[49?50]。

第二種方法是在第二個(gè)結(jié)合墊上結(jié)合納米材料標(biāo)記的羊抗鼠抗體（納米材料-GAMA），利用GAMA可以和待檢目標(biāo)物的單克隆抗體結(jié)合的原理，隨著免疫層析的進(jìn)行會(huì)形成納米材料-GAMA-Ab1-納米材料復(fù)合物，納米材料的聚集也提高了檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)度[51]。

第三種方法是引入生物素（biotin）-鏈霉親和素（streptavidin）系統(tǒng)，在第一個(gè)結(jié)合墊上結(jié)合納米材料標(biāo)記生物素化的單克隆抗體（納米材料-BAb），第二個(gè)結(jié)合墊上結(jié)合納米材料標(biāo)記的鏈霉親和素（納米材料-Sa），隨著免疫層析的進(jìn)行會(huì)形成納米材料-BAb-Sa-納米材料復(fù)合物，也實(shí)現(xiàn)了納米材料的聚集進(jìn)而提高了檢測(cè)的靈敏度[52]。

2.6 多元檢測(cè)法

傳統(tǒng)的免疫層析試紙條主要用來檢測(cè)單一的目標(biāo)物，為了提高試紙條的檢測(cè)效率，研究人員設(shè)計(jì)了可以同時(shí)檢測(cè)多種目標(biāo)物質(zhì)的試紙條。

為了實(shí)現(xiàn)多元檢測(cè)，一種方法是利用單一的納米顆粒標(biāo)記多種抗待檢目標(biāo)物質(zhì)的抗體，同時(shí)在試紙條上面設(shè)計(jì)多條檢測(cè)線[53]。Kong等[54]開發(fā)了基于金納米顆粒的免疫層析試紙條用來檢測(cè)谷類食物樣品中的20多種霉菌毒素，屬于玉米赤霉烯酮類、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇類、T-2毒素類、黃曲霉毒素類和伏馬毒素類五個(gè)大類。整個(gè)檢測(cè)過程共耗時(shí)20 min，大大提高了檢測(cè)速度。第二種方法是采用多種顏色的納米材料對(duì)多種目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，每種目標(biāo)物質(zhì)對(duì)應(yīng)的檢測(cè)線的顏色均不同，便于更好地區(qū)分待檢物質(zhì)[55]。Wu等[56]合成四種顏色的金納米材料（圖5），分別為紅色的金納米球（gold nanospheres，AuNSs），紫色的金納米仙人掌（gold nanocacti，AuNCs），藍(lán)色的金納米花（gold nanoflowers，AuNFs）和黑色的分枝金等離子體黑體（hyperbranched Au plasmonic blackbodies，AuPBs），用這四種金納米材料分別對(duì)FB1，玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN），OTA，和黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1, AFB1）進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，檢測(cè)限分別為3.27、0.70、0.10和0.06 ng·mL?1。Taranova等[57]利用在625、585和525 nm波長(zhǎng)處具有最大發(fā)射峰而呈現(xiàn)出紅色、黃色和綠色的多色量子點(diǎn)開發(fā)了一種“交通信號(hào)燈”的免疫層析試紙條，利用該試紙條對(duì)牛奶中氧氟沙星（ofloxacin，OFL）、氯霉素（chloramphenicol，CAP）和鏈霉素（streptomycin，STM）三種抗生素同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)這三種目標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)限為0.3, 0.12和0.2 ng mL?1。在使用相同抗體的條件下，檢測(cè)限比酶聯(lián)免疫吸附方法低80～200倍。

圖5 基于多色金納米材料的免疫層析試紙條傳感器示意圖[56]Fig.5 Schematic illustration of multicolor AuNP-based multiplex ICTS nanosensor[56]

2.7 物理阻礙作用法

在免疫層析技術(shù)中通過減小紙張的空隙和減慢液體流動(dòng)的速度可以提高試紙條的檢測(cè)性能。Quesada-González等[58]將纖維素納米纖維（cellulose nanofbers，CNF）噴涂到免疫層析試紙條的檢測(cè)區(qū)域，CNF浸入到硝酸纖維素膜的空隙內(nèi)部，進(jìn)而減小了檢測(cè)區(qū)域膜的孔徑。這種修飾使得檢測(cè)區(qū)的抗體更接近試紙條表面，最終使得試紙條表面金納米顆粒的結(jié)合數(shù)量增多，使得檢測(cè)靈敏度提高了36.6%（圖6）。Wu等[59]在試紙條下面放置磁鐵以提供外加磁場(chǎng)，該磁場(chǎng)會(huì)和試紙條上的磁性納米標(biāo)記材料Fe3O4@Au相互作用，減慢了免疫試劑的流動(dòng)速度同時(shí)增加了試劑之間的相互作用時(shí)間，最終使得檢測(cè)靈敏度提高。Choi等[60]通過在試紙條上增加玻璃纖維分流墊以及在試紙條上設(shè)置聚二甲基硅氧烷障礙點(diǎn)來減慢免疫試劑在試紙條上的流動(dòng)速度，同時(shí)也增加了試劑之間的反應(yīng)時(shí)間，用該方法檢測(cè)乙型肝炎病毒，使得檢測(cè)靈敏度提高了10倍。

圖6 檢測(cè)線處沒有修飾（上）和修飾纖維素納米纖維（下）的原理圖[58]Fig.6 Schematic representation of TL not modified (up) and modified with cellulose nanofibers dispensed (down)[58]

2.8 淬滅熒光法

Morales-Narváez等[61]使用量子點(diǎn)代替?zhèn)鹘y(tǒng)試紙條質(zhì)控線上的羊抗鼠抗體，在檢測(cè)線處包被量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測(cè)抗體（Ab-QDs），同時(shí)結(jié)合氧化石墨烯對(duì)于量子點(diǎn)的淬滅能力對(duì)大腸桿菌進(jìn)行檢測(cè)。在有目標(biāo)檢測(cè)菌大腸桿菌存在的情況下，大腸桿菌可以和檢測(cè)線處的Ab-QDs結(jié)合形成Ab-QDs-大腸桿菌復(fù)合物，緊接著在試紙條上滴加氧化石墨烯，大腸桿菌的存在阻礙了量子點(diǎn)和石墨烯之間的能量轉(zhuǎn)移，此時(shí)石墨烯不能淬滅量子點(diǎn)的熒光。而在沒有目標(biāo)菌存在的情況下，檢測(cè)線處Ab-QDs的熒光可以被石墨烯淬滅。這種方法對(duì)瓶裝水和牛奶中的大腸桿菌的檢測(cè)限為100 cfu·mL?1。Hassan等[62]用該種方法對(duì)牛肉餡和河水中的大腸桿菌O157:H7進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)牛肉 餡 的 檢 測(cè) 限 為178 cfu·g?1，河 水 的 檢 測(cè) 限 為133 cfu·mL?1。檢測(cè)靈敏度相比傳統(tǒng)的試紙條提高了1000倍，同時(shí)量子點(diǎn)代替羊抗鼠抗體也使得檢測(cè)成本降低了60%。

2.9 多種模式讀取信號(hào)法

傳統(tǒng)的膠體金試紙條主要是根據(jù)試紙條上納米標(biāo)記材料的顏色進(jìn)行比色來判斷結(jié)果，近年來，研究者開發(fā)出了既能肉眼比色檢測(cè)也能使得試紙條可以通過一定的化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行定量分析結(jié)果的試紙條。

Ouyang等[63?64]通過使用魯米諾還原氯金酸制備出了魯米諾還原的金納米粒子（Luminol-reduced gold nanoparticles，LuReGNPs），該方法以LuReGNPs在試紙條上的紅顏色作為定性和半定量的判定結(jié)果，在免疫層析過程完成后，將檢測(cè)區(qū)域剪下來放入微孔板的孔內(nèi)，在孔內(nèi)加入辣根過氧化物酶（HRP）和過氧化氫，最終可收集到另外的化學(xué)發(fā)光信號(hào)，此信號(hào)可以作為定量檢測(cè)的依據(jù)。用該方法檢測(cè)農(nóng)藥殘留，對(duì)甲基對(duì)硫磷和甲氰菊酯的檢測(cè)限分別為0.17 ng·mL?1和0.10 ng·mL?1。同時(shí)Ouyang等[27]以MnO2納米花作為試紙條的信號(hào)標(biāo)簽，檢測(cè)線處表現(xiàn)出MnO2納米花的棕色可以作為定性和半定量的檢測(cè)信號(hào)，同時(shí)MnO2納米花對(duì)魯米諾-H2O2化學(xué)發(fā)光體系具有顯著的影響，也可以通過剪下檢測(cè)區(qū)域來收集化學(xué)發(fā)光信號(hào)，用該方法對(duì)毒死蜱的檢測(cè)限為0.033 ng·mL?1。同理Ouyang等[22]也開發(fā)了g-C3N4/BiFeO3納米符合材料，通過雙信號(hào)讀出對(duì)毒死蜱和西維因進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)它們的檢測(cè)限為0.033 ng·mL?1。Wang等[41]使用普魯士藍(lán)納米顆粒開發(fā)了三種讀出模式的試紙條，分別為肉眼定性檢測(cè)，軟件分析檢測(cè)線信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行定量檢測(cè)，以及利用普魯士藍(lán)納米顆粒的過氧化物酶活性催化四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色的比色信號(hào)進(jìn)行定量檢測(cè)。

3 結(jié)語

ICTS經(jīng)過多年的發(fā)展已經(jīng)較為成熟，在眾多領(lǐng)域已經(jīng)實(shí)現(xiàn)商品化應(yīng)用。本文簡(jiǎn)要總結(jié)了近年來該技術(shù)相比于傳統(tǒng)的膠體金試紙條的改進(jìn)方向，盡管ICTS性能有很大的提升，但在實(shí)際應(yīng)用方面仍然存在很多的問題。目前，主要面臨的問題及發(fā)展的趨勢(shì)簡(jiǎn)述如下：（1）試紙條技術(shù)中對(duì)于有害物質(zhì)的特異性分析依賴于單克隆抗體，但是單克隆抗體制備速度較慢，需要消耗大量的人力物力，快速地開發(fā)廉價(jià)、高親和力的單克隆抗體仍然是目前的一大挑戰(zhàn)，隨著納米抗體在免疫分析中的應(yīng)用越來越廣泛，未來可以考慮將納米抗體應(yīng)用于ICTS[65?66]。（2）有些納米標(biāo)記材料的合成需要嚴(yán)苛的化學(xué)反應(yīng)條件，同時(shí)合成時(shí)間較長(zhǎng)，開發(fā)可以在溫和條件下快速合成的納米材料對(duì)ICTS具有重要的作用。（3）檢測(cè)樣品的復(fù)雜成分會(huì)影響試紙條的檢測(cè)靈敏度，降低檢測(cè)基質(zhì)對(duì)于試紙條的檢測(cè)性能的影響對(duì)檢測(cè)性能的提高具有重要的意義。（4）ICTS準(zhǔn)確的檢測(cè)信號(hào)讀出依賴于信號(hào)讀出設(shè)備，開發(fā)簡(jiǎn)易便攜便宜的小型儀器也是未來的發(fā)展趨勢(shì)。