半乳糖凝集素3抑制劑對大鼠椎間盤軟骨終板細胞基質(zhì)金屬蛋白酶-3、趨化因子（C-C基元）配體3及聚蛋白多糖表達的影響

劉巖路，胡 煒，艾克拜爾·艾拜也都拉，伊力亞·依力哈木，黃異飛

新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院脊柱二科，烏魯木齊 830000

下腰痛主要表現(xiàn)為肋緣和臀下皺襞之間的疼痛、僵硬及肌肉緊張，發(fā)生率高，已成為全球性的醫(yī)療保健問題［1-2］。在臨床上，下腰痛可能是多種疾病的癥狀，而椎間盤退行性變是導致下腰痛發(fā)生的主要因素［3］。椎間盤內(nèi)無血管走行，營養(yǎng)供應和物質(zhì)代謝主要靠終板來完成［4］。當軟骨終板發(fā)生損傷時，會導致椎間盤纖維化、炎性細胞浸潤及細胞外基質(zhì)減少，致使損傷終板所在椎間盤發(fā)生漸進性結(jié)構(gòu)改變，最終導致椎間盤形態(tài)、穩(wěn)定性和功能的缺失，從而引起下腰痛［5-7］。

半乳糖凝集素3是一種分子量為29 000 ~ 35 000的蛋白質(zhì)，屬于β-半乳糖苷結(jié)合動物凝集素家族，在多種組織中均有表達［8］。近年研究［9］發(fā)現(xiàn)，半乳糖凝集素3可作為軟骨細胞的標志物和促生因子，促進軟骨細胞存活和軟骨基質(zhì)礦化。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，半乳糖凝集素3可能主要通過調(diào)節(jié)炎性因子和趨化因子的表達在骨關(guān)節(jié)炎的進展中發(fā)揮作用［10］。本研究旨在探討半乳糖凝集素3對基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）、趨化因子（C-C基元）配體3（CCL3）及聚蛋白多糖的影響，為闡明椎間盤退行性變的機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大鼠軟骨終板細胞和大鼠軟骨終板細胞培養(yǎng)基購自武漢普諾賽生命科技有限公司。MTT試劑盒購自德國BioFroxx公司；胎牛血清、胰蛋白酶-EDTA（0.25%）購自美國GIBCO公司；TIANScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）實時熒光定量PCR試劑購自北京天根生化科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；CCL3兔抗多克隆抗體（A7568）購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；MMP-3抗體（EP1186Y）購自美國Abcam公司；聚蛋白多糖多克隆抗體購自北京安諾倫生物科技有限公司。

1.2 細胞傳代及分組

參考文獻［11］的操作方法，將大鼠軟骨終板細胞（1周內(nèi)提?。囊旱腥〕觯焖俜湃?7℃水浴鍋中，輕搖凍存管使凍存液溶解；溶解后把細胞轉(zhuǎn)移到含有5 mL培養(yǎng)基的離心管中，離心收集細胞（1 000 r/min，離心10 min，離心半徑為13.5 cm），用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基懸浮細胞；將細胞接種到培養(yǎng)皿中，輕輕吹打混勻，在37℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。間隔2 d更換1次培養(yǎng)液。細胞融合約80%時，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA收集細胞，按1∶3傳代，將P2代大鼠軟骨終板細胞以5×103個/孔接種于96孔板，同時設(shè)空白孔，37℃培養(yǎng)過夜。將細胞分為2組，一組加入含25 μmol/L GB1107半乳糖凝集素3抑制劑（抑制劑組），另一組加入等體積空白溶劑（對照組）。

1.3 細胞存活率分析

分組處理完成后12 h、24 h、48 h各取1塊96孔板，每孔加入10 μL MTT，37℃培養(yǎng)4 h；吸出培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO震蕩10 min。用酶標儀測定各孔568 nm處光密度值，計算細胞存活率。以上操作重復3次。

1.4 MMP-3、CCL3及聚蛋白多糖mRNA的表達

分組處理完成后24 h收集細胞，提取總RNA，使用TIANScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用DNAMAN軟件設(shè)計MMP-3、CCL3及聚蛋白多糖的實時熒光定量PCR引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。內(nèi)參GAPDH正向引物為5"-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3"，反向引物為5"-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3"；MMP-3正向引物為5"-GAATCCCCTGATGTCCTCGT-3"，反向引物為5"-TTTTCGCCAAAAGTGCCTGT-3"；CCL3正向 引物為5"-GCATTTAGTTCCAGCTCAGTGA-3"，反向引物為5"-GGACGGCAAATTCCACGAAA-3"；聚蛋白多糖正向引物為5"-TGGACTTGTCTCAGGTTTC-3"，反向引物為5"-AGTTGG GGCAGTTATGGAT-3"。實時熒光定量PCR反應體系：10 μmol/L的上、下游引物各0.8 μL，2×SYBR Green預混液10 μL，去RNA酶水6.4 μL，cDNA模板2 μL，配制成20 μL體系，混合均勻。反應條件：95℃ 60 s；95℃ 10 s，60℃ 34 s，40個循環(huán)；94℃ 90 s，60℃ 60 s。從60℃按1.1℃/s升溫至94℃，獲得實時熒光定量PCR反應結(jié)果，采用2-ΔΔCt法量化目的基因表達水平。以上操作重復3次。

1.5 MMP-3、CCL3及聚蛋白多糖蛋白的表達

分組處理完成后24 h收集細胞，用PBS洗凈細胞，加入120 μL含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，在4℃下14 000×g（g=9.806 65 m·s-2）離心5 min（離心半徑13.5 cm）。取上清液適當稀釋后用BCA法測定蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度。取50 μg變性蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE充分分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，將膜放入5% BSA封閉液中，置于室溫下?lián)u床孵育1 h，加5 mL一抗稀釋液（工作濃度均為1∶1 000）于4℃冰箱過夜。次日用TBST洗膜3次，每次10 min，然后加10 mL二抗稀釋液（工作濃度為1∶50 000）置于搖床孵育2 h，顯色，在暗室中壓片曝光顯影。用Quantity-one圖像軟件分析并進行光密度值掃描，計算目的蛋白條帶與GAPDH強度比值。以上操作重復3次。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 半乳糖凝集素3抑制劑對大鼠軟骨終板細胞增殖活性的影響

MTT檢測結(jié)果顯示，抑制劑組大鼠軟骨終板細胞處理12 h后活性開始逐漸降低，24 h、48 h細胞活性分別為69%和54%。抑制劑組3個時間點的細胞增殖活性均低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖1）。

圖1 2組大鼠軟骨終板細胞活性變化Fig. 1 Changes of activity of rat cartilage endplate cells in 2 groups

2.2 半乳糖凝集素3抑制劑對大鼠軟骨終板細胞MMP-3、CCL3、聚蛋白多糖表達的影響

實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，抑制劑組大鼠軟骨終板細胞中MMP-3、CCL3及聚蛋白多糖的mRNA表達水平均低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖2）。蛋白質(zhì)印跡檢測結(jié)果顯示，抑制劑組大鼠軟骨終板細胞中MMP-3、CCL3及聚蛋白多糖的蛋白表達水平均低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖3）。

圖2 2組大鼠軟骨終板細胞MMP-3、CCL3及聚蛋白多糖的mRNA表達Fig. 2 Expressions of MMP-3，CCL3 and aggrecan mRNA of rat cartilage endplate cells in 2 groupsa：MMP-3的mRNA相對表達量 b：CCL3的mRNA相對表達量 c：聚蛋白多糖的mRNA相對表達量a：Relative expression of MMP-3 mRNA b：Relative expression of CCL3 mRNA c：Relative expression of aggrecan mRNA

圖3 2組大鼠軟骨終板細胞MMP-3、CCL3及聚蛋白多糖的蛋白表達Fig. 3 Expressions of MMP-3，CCL3 and aggrecan protein of rat cartilage endplate cells in 2 groupsa：蛋白質(zhì)印跡檢測 b：MMP-3的蛋白相對表達量 c：CCL3的蛋白相對表達量 d：聚蛋白多糖的蛋白相對表達量a：Western blotting b：Relative expression of MMP-3 protein c：Relative expression of CCL3 protein d：Relative expression of aggrecan protein

3 討 論

椎間盤退行性變是引起下腰痛的主要因素之一，其致病因素主要包括應力損傷、炎性反應、衰老、菌類感染、營養(yǎng)障礙、遺傳和腫瘤等［12-14］。終板是椎間盤的重要組成部分，在維持椎骨正常形態(tài)、保護椎骨承受壓力及吸收靜態(tài)壓力等方面起著積極作用，同時終板是椎體中滲透轉(zhuǎn)運能力的主要承擔者，是椎體的主要營養(yǎng)供應通路［15］。終板的退行性變與椎間盤退行性變的產(chǎn)生有著密切聯(lián)系，但其確切機制仍不十分清楚。

有研究［16］表明，當軟骨終板發(fā)生損傷時，促炎細胞因子水平升高，基質(zhì)降解酶活性增加，軟骨細胞外基質(zhì)中的蛋白多糖活性降低，使細胞外基質(zhì)大量降解，誘導軟骨終板破壞，促進軟骨終板發(fā)生退行性變，最終導致椎間盤穩(wěn)態(tài)降低、結(jié)構(gòu)破壞等一系列病理改變。本研究結(jié)果顯示，抑制半乳糖凝集素3后，大鼠軟骨終板細胞增殖活性顯著降低，加劇細胞退行性變的發(fā)生，表明半乳糖凝集素3可以調(diào)控軟骨細胞活性，進而可能對軟骨結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定造成影響，參與椎間盤退行性變的發(fā)生。

聚蛋白多糖一般以聚合體的形式在軟骨終板細胞基質(zhì)內(nèi)發(fā)揮聚合作用，起到支撐細胞合成代謝的功能［17］。本研究結(jié)果顯示，抑制半乳糖凝集素3后，聚蛋白多糖表達量降低，導致細胞支撐力下降，促使細胞凋亡，表明半乳糖凝集素3可以調(diào)控聚蛋白多糖表達，進而通過影響軟骨細胞的合成代謝，參與椎間盤退行性變的發(fā)生。

MMP-3是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的主要成員，有研究［18-19］證明，MMP-3過表達會引起細胞外基質(zhì)降解，最終導致椎間盤發(fā)生退行性變。本研究結(jié)果顯示，抑制半乳糖凝集素3后，大鼠軟骨終板細胞MMP-3的mRNA和蛋白表達水平均降低，提示半乳糖凝集素3可能通過調(diào)控軟骨終板細胞外基質(zhì)降解在椎間盤退行性變中發(fā)揮作用。

CCL3又被稱為巨噬細胞炎性蛋白，具有募集巨噬細胞的功能，在炎性反應和免疫應答中發(fā)揮重要作用［20］，而巨噬細胞的數(shù)量與椎間盤退行性變程度呈正相關(guān)［3］。本研究結(jié)果顯示，抑制半乳糖凝集素3后，大鼠軟骨終板細胞CCL3的mRNA和蛋白表達水平均降低，表明半乳糖凝集素3可影響CCL3的表達，可能在椎間盤軟骨終板炎性細胞浸潤中發(fā)揮作用，影響椎間盤退行性變的發(fā)生。

綜上所述，在軟骨終板細胞中抑制半乳糖凝集素3表達會降低軟骨終板細胞增殖活性及細胞中MMP-3、CCL3和聚蛋白多糖的表達水平。MMP-3、CCL3的表達水平降低對軟骨終板細胞起到保護作用，而聚蛋白多糖表達和軟骨終板細胞增殖活性的降低起到促進軟骨終板細胞凋亡作用。查閱文獻［21］發(fā)現(xiàn)，半乳糖凝集素3有2個具有爭議的作用，即促進凋亡和抑制凋亡。Heidi等［22］的研究表明，半乳糖凝集素3在細胞內(nèi)抑制關(guān)節(jié)和肥大軟骨細胞凋亡，促進細胞增殖。但針對某些細胞類型，半乳糖凝集素3也具有促進細胞凋亡作用［23-25］。本研究結(jié)果顯示，抑制半乳糖凝集素3表達會促進細胞凋亡，誘導椎間盤退行性變的發(fā)生。

4 結(jié) 論

本研究表明，抑制半乳糖凝集素3表達可抑制軟骨終板細胞增殖，促進軟骨終板發(fā)生退行性變。其可能是通過影響細胞外基質(zhì)降解、椎間盤炎性細胞浸潤和細胞內(nèi)合成代謝的多重相互作用，來發(fā)揮抑制細胞增殖活性的功能。本研究全新闡述了軟骨終板退行性變的可能作用機制，也為椎間盤退行性變的預防和治療提供了新的靶點。