馬氏珠母貝酶解蛋白粉營養(yǎng)組成及其對斑馬魚學(xué)習(xí)記憶能力的影響

魏 偉，朱國萍,2，章超樺,2，高加龍,2，曹文紅,2，鄭惠娜,2，秦小明,2

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院// 2.廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室// 水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室// 國家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心(湛江)，廣東 湛江 524088）

學(xué)習(xí)記憶能力的基礎(chǔ)是神經(jīng)元的突觸可塑性。隨著全球老齡化的加劇，與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的腦健康問題愈發(fā)凸顯，導(dǎo)致家庭與社會的負(fù)擔(dān)日益加重[1]。衰老過程中促炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β 等長期刺激可導(dǎo)致慢性、低度、微炎性等炎性衰老狀態(tài)[2]。相關(guān)研究表明，衰老可觸發(fā)激活腦部的免疫細(xì)胞——小膠質(zhì)細(xì)胞分泌促炎癥細(xì)胞因子，炎性衰老狀態(tài)損傷神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)長時程增強(qiáng)，從而引起學(xué)習(xí)記憶能力衰退甚至導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病[3-5]。Mcgeer等[6]發(fā)現(xiàn)，通過抑制慢性炎癥反應(yīng)可以改善由衰老引起的學(xué)習(xí)記憶能力衰退，進(jìn)而提升老年人的生活質(zhì)量。

馬氏珠母貝（Pinctada martensii）是我國海水珍珠養(yǎng)殖的主要品種，主要分布于日本和我國南海沿岸，其營養(yǎng)豐富，產(chǎn)量巨大，是一種尚待開發(fā)的海洋資源[7]。據(jù)報道，馬氏珠母貝酶解產(chǎn)物具有抗衰老[8]、抗炎[9]、增強(qiáng)免疫[10]、抗氧化[11]、抗疲勞[12]等多種生物活性。但是關(guān)于馬氏珠母貝酶解產(chǎn)物改善學(xué)習(xí)記憶能力的功效研究報道較少。本研究通過分析馬氏珠母貝酶解蛋白粉營養(yǎng)組成，以自然衰老斑馬魚作為動物模型，飼喂馬氏珠母貝酶解蛋白粉，比較其T 迷宮行為學(xué)以及生物指標(biāo)的變化，探究馬氏珠母貝酶解蛋白粉對衰老斑馬魚（Daniorerio）空間學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用，旨在為馬氏珠母貝酶解蛋白粉改善老年記憶功能衰退的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與實(shí)驗(yàn)動物

馬氏珠母貝酶解蛋白粉（Enzymolysis protein powder ofPinctada martensii，EPP），廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院預(yù)制酶解蛋白粉。

6 月齡和18 月齡的斑馬魚，體長分別為2.5～3.0 cm、2.8～ 3.3 cm，購于上海乙諾水族科技有限公司。

1.2 試劑與儀器

BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒，南京諾唯贊生物科技有限公司；斑馬魚白細(xì)胞介素1β（IL-Iβ）試劑盒，（批號20190702-95471A）、斑馬魚腫瘤壞死因子（TNF-α）試劑盒（批號20190702-95472A）、斑馬魚白細(xì)胞介素 10（IL-I0）試劑盒（批號：20190702-96083A）、斑馬魚腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）試劑盒（批號：20190702-98030A），江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司。

硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、鹽酸、硼酸、苯酚、無水葡萄糖、石油醚等試劑均為分析純。

SZF-06A 脂肪測定儀，上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司；組織研磨儀，卡尤迪生物科技有限公司；SL1-700 恒溫孵育箱，上海愛朗儀器有限公司；Multiskan FC 酶標(biāo)儀，美國 Thermo 公司；ZEBRALAB 魚類高通量實(shí)驗(yàn)監(jiān)控系統(tǒng)，法國Viewpoint life sciences 公司；T 型迷宮，法國Viewpoint life sciences 公司。

1.3 方法

1.3.1馬氏珠母貝酶解蛋白粉的制備 采用課題組預(yù)制馬氏珠母貝酶解蛋白粉進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。酶解工藝條件參照課題組前期優(yōu)化條件[13]。

1.3.2馬氏珠母貝酶解蛋白粉基本營養(yǎng)成分的測定 水分測定采用常壓干燥法按GB 5009.3—2016測定；灰分測定采用高溫灼燒法按GB 5009.4—2016 測定；粗蛋白質(zhì)測定采用凱氏定氮法按GB 5009.5—2016 測定；粗脂肪測定采用索氏抽提法按GB 5009.6—2016 測定；總糖測定采用苯酚-硫酸法按GB/T 9695.31—2008 測定。

1.3.3馬氏珠母貝酶解蛋白粉氨基酸組成測定氨基酸組成采用氨基酸分析儀按GB5009.124—2016 測定。

1.3.4馬氏珠母貝酶解蛋白粉金屬含量測定 鈣、鐵、鋅、硒、銅、錳含量測定采用微波消解-電感耦合等離子體-質(zhì)譜法按GB 5009.268—2016 測定。

1.3.5實(shí)驗(yàn)動物分組及給藥 所有的斑馬魚置于14 h 光照/10 h 黑暗的循環(huán)中（光照階段從7：00 am開始），控制溫度（25±2）℃、空氣濕度（60±5）%，養(yǎng)殖用水是曝曬兩周后的自來水。不同年齡段的斑馬魚被盛于不同的長方形水箱（35 cm×24 cm×20 cm）中，水箱配備過濾、溫控裝置，密度1.5 尾/L。

將40 尾18 月齡斑馬魚隨機(jī)分成兩組，每組20尾。另取20 尾6 月齡斑馬魚作為對照。分為對照組（6 月齡飼料喂養(yǎng)）、模型組（18 月齡飼料喂養(yǎng)）、實(shí)驗(yàn)組（18 月齡飼料按3.0 g/kg 劑量拌喂EPP）3組。適應(yīng)性喂養(yǎng)兩周（14 d）后，進(jìn)行連續(xù)分組飼養(yǎng)30 d，每天一次。實(shí)驗(yàn)組EPP 飼喂量參照《保健食品檢驗(yàn)與評價技術(shù)規(guī)范（2003 年版）》[14]按人體推薦劑量20 倍，3.0 g/kg 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.6斑馬魚T 迷宮試驗(yàn) 參照葡韻竹[15]的方法并適當(dāng)改進(jìn)。本試驗(yàn)所用 T 型迷宮由水平等長的左右臂和垂直輔道組成。材料均為白色不透明的塑料板，以避免外界顏色對斑馬魚行為學(xué)產(chǎn)生影響。在測試期，T 迷宮與ZEBRALAB 魚類高通量實(shí)驗(yàn)監(jiān)控系統(tǒng)聯(lián)合使用。該試驗(yàn)分適應(yīng)期與測試期兩個階段，為期5 d，試驗(yàn)期間不喂食。

行為學(xué)適應(yīng)期在實(shí)驗(yàn)開始的31 d 上午9 點(diǎn)開始進(jìn)行。將整組斑馬魚輕緩地放入T 迷宮中適應(yīng)2 h，并保證這段時間內(nèi)右臂一直有食物存在，以給予斑馬魚獎賞刺激，形成記憶。適應(yīng)期未有數(shù)據(jù)。

行為學(xué)測試期從實(shí)驗(yàn)開始的32 d 上午9 點(diǎn)開始進(jìn)行。每組斑馬魚20 尾，逐尾進(jìn)行測試。在轉(zhuǎn)移斑馬魚的過程中，實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)盡量動作溫柔輕緩，以免對行為學(xué)結(jié)果產(chǎn)生影響。并且每尾待測魚在測試前需在安靜無干擾環(huán)境放置5 min 作預(yù)處理。在測試期間，斑馬魚在迷宮中的運(yùn)動由帶有紅外檢測功能的攝像機(jī)監(jiān)控，攝像機(jī)位于迷宮正上方1.5 m處，并連接在一臺計算機(jī)上，便于實(shí)驗(yàn)人員觀察斑馬魚的運(yùn)動。

測試時，將準(zhǔn)備好的斑馬魚放入垂直輔道起點(diǎn)處，并開始5 min 計時。當(dāng)斑馬魚進(jìn)入右臂，并且持續(xù)時間大于或等于30 s 時，即認(rèn)為這尾斑馬魚成功進(jìn)入食物放置區(qū)，此時在右臂對斑馬魚進(jìn)行食物獎賞，斑馬魚從放入起點(diǎn)到進(jìn)入右臂的時間為潛伏期；若斑馬魚未成功進(jìn)入右臂，計時結(jié)束后引導(dǎo)其進(jìn)入右臂投喂食物，停留3 min，使斑馬魚將右臂與食物獎勵形成聯(lián)系，其潛伏期計為300 s。每條魚測試結(jié)束后，系統(tǒng)自動導(dǎo)出斑馬魚運(yùn)動軌跡，可用于計算右臂游動路程占比。

測試結(jié)束后，將斑馬魚放到提前備好的魚缸中，進(jìn)行下一條魚的測試。當(dāng)整組魚測試結(jié)束后，一起放回原來的水箱。

行為學(xué)測試每天一次，持續(xù)4 d。在剔除不游動的斑馬魚后，統(tǒng)計斑馬魚進(jìn)入食物放置區(qū)（右臂）的成功率、潛伏時間、右臂游動路程占比。

1.3.7腦組織樣本的制備 將完成行為學(xué)試驗(yàn)的斑馬魚于次日上午在冰水混合物中低溫麻醉后稱重，按順序放置于冰面上，用眼科鑷打開被固定斑馬魚的頭蓋后，完整將全腦取出，將魚腦分析天平稱重并記錄，盛裝于預(yù)先備好的離心管，為保證樣品量3 個斑馬魚腦組織作為一個樣品（n=6，其余兩個魚腦組織用作試劑盒濃度預(yù)實(shí)驗(yàn)），在液氮中急凍后，放于-80 ℃冰箱，用于后續(xù)指標(biāo)測定。

將凍存的魚腦解凍后，按照質(zhì)量體積比1∶9加入磷酸鹽緩沖液（pH=7.4）后，進(jìn)行組織勻漿，勻漿液在3 000 r·min-1，4 ℃條件下離心10 min，取上清，轉(zhuǎn)移至新離心管后，凍存于-80 ℃冰箱，備后續(xù)生物化學(xué)指標(biāo)測定。

1.3.8斑馬魚腦組織炎癥因子及神經(jīng)營養(yǎng)因子測定 采用斑馬魚IL-1β、TNF-α、IL-10、BDNF 試劑盒測定魚腦組織中IL-1β、TNF-α、IL-10、BDNF含量，具體操作嚴(yán)格參照說明書。采用BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒測定實(shí)驗(yàn)樣品蛋白含量，具體操作嚴(yán)格參照說明書。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)除行為學(xué)結(jié)果外均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，行為學(xué)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行組間差異顯著性分析，行為學(xué)成功率采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行比較。顯著水平α=0.05。采用JMP Pro 13 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Origin Pro 9.0 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 EPP 基本營養(yǎng)組成分析

EPP 基本營養(yǎng)組成見表1，EPP 粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)78.28%，粗脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.96%，總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.88%，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.87%，灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)11.59%。同水解牡蠣(Crassostrea rivularis)粉（粗蛋白52.40%、粗脂肪1.09%、總糖12.00%、水分14.20%、灰分17.20%）[16]相比，具有高蛋白特點(diǎn)。

表1 馬氏珠母貝酶解蛋白粉的基本營養(yǎng)組成Table 1 Contents of basic component in EPP %

2.2 EPP 氨基酸組成分析

對EPP 氨基酸進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示EPP 氨基酸種類齊全，含量豐富。尤其是天冬氨酸、谷氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)（以蛋白粉為基礎(chǔ)）很高，分別達(dá)到8.87、13.00%，兩者占總氨基酸比例28.21%，均高于牡蠣酶解產(chǎn)物含量[17]。EPP 的主要氨基酸是谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、亮氨酸、精氨酸。EPP的疏水性氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28.39%，疏水性氨基酸占總氨基酸比例為36.62%，高于牡蠣酶解產(chǎn)物組分（31.04%）[18]。

表2 馬氏珠母貝酶解蛋白粉的氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of EPP %

2.3 EPP 金屬元素含量分析

EPP 金屬含量測定結(jié)果見表3，所測定的金屬元素（以蛋白粉為基礎(chǔ)）中Ca 質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，達(dá)725.54 mg/kg，占全部測定元素的86.32%。EPP 除Ca 含量很高外，還含有較高的Fe 和Zn 元素，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為55.80、48.71 mg/kg，以上3 種元素占全部測定元素的98.75%。另外EPP 還含有較低量的錳、銅、硒元素，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5.16、3.14、2.19 mg/kg。

表3 馬氏珠母貝酶解蛋白粉的金屬元素含量Table 3 Metal element content of EPP mg/kg

2.4 EPP 對斑馬魚體質(zhì)量的影響

在實(shí)驗(yàn)動物生長發(fā)育期，體質(zhì)量的增長情況是反映動物健康狀況最基本的指標(biāo)之一[19]。因此可通過測量比較實(shí)驗(yàn)后斑馬魚的質(zhì)量對EPP 進(jìn)行初步食用安全性評價。

各組斑馬魚體質(zhì)量見圖1，經(jīng)比較，各組斑馬魚體質(zhì)量無顯著差異（P＞0.05）。各組斑馬魚體質(zhì)量分別為：對照組（0.52±0.09）g、模型組（0.54±0.13）g、實(shí)驗(yàn)組（0.59±0.12）g。這初步表明，EPP 對斑馬魚的正常生長無影響，是一種安全的海洋食品原料。

圖1 馬氏珠母貝酶解蛋白粉對斑馬魚體質(zhì)量的影響Fig.1 Effect of EPP on the body weight in zebrafish

2.5 EPP 對斑馬魚行為學(xué)的影響

T 迷宮試驗(yàn)結(jié)果見圖2。總體而言，從行為學(xué)測試開始，對照組、模型組、實(shí)驗(yàn)組斑馬魚的覓食成功率、潛伏期、右臂游動路程占比在3、4 d 均趨于穩(wěn)定和一致，這可能是因?yàn)樾袨閷W(xué)測試過程中對斑馬魚記憶的鞏固強(qiáng)化所致，因此在接下來分析中中僅描述和討論1～ 2 d 的行為學(xué)結(jié)果。與對照組相比，模型組1～ 2 d 成功率未有顯著差異（P＞0.05）；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組1、2 d 成功率均顯著升高（P＜0.05）（圖a）。與對照組相比，模型組潛伏期1、2 d 略高（P＞0.05）；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組潛伏期明顯降低（P＞0.05）（圖b）。與對照組相比，模型組右臂游動路程占比1、2 d 未有顯著差異（P＞0.05）；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組占比1、2 d 均顯著升高（P＜0.05）（圖c）。行為學(xué)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組斑馬魚學(xué)習(xí)記憶能力強(qiáng)于模型組。綜上所述，EPP可以有效改善自然衰老斑馬魚的學(xué)習(xí)記憶能力。

圖2 馬氏珠母貝酶解蛋白粉對斑馬魚行為學(xué)的影響Fig.2 The effects of EPP on zebrafish behavioristics

2.6 EPP 對斑馬魚腦組織炎癥因子含量的影響

EPP 對斑馬魚腦組織炎癥因子含量的影響見表4，與對照組相比，模型組斑馬魚腦組織IL-1β、TNF-α 含量顯著上升（P＜0.05），表明衰老導(dǎo)致了斑馬魚腦部炎癥反應(yīng)的增強(qiáng)；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組斑馬魚腦組織IL-1β、TNF-α 含量顯著下降（P＜0.05），說明EPP 能夠抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，具有顯著的體內(nèi)抗炎作用，表明EPP 對衰老斑馬魚學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用可能與其抑制神經(jīng)炎癥有關(guān)。另外，各組斑馬魚腦組織中IL-10 含量均無顯著差異（P＞0.05），但可見模型組斑馬魚腦組織IL-10 含量較高。

表4 馬氏珠母貝酶解蛋白粉對斑馬魚腦組織炎癥因子質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Table 4 Effects of EPP on the content of inflammatory factors in zebrafish brain tissue pg/mg

2.7 EPP 對斑馬魚腦組織腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子含量的影響

EPP對斑馬魚腦組織BDNF含量的影響見圖3，與對照組相比，模型組斑馬魚腦組織中BDNF 的含量無顯著變化（P＞0.05）；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組斑馬魚腦組織中BDNF 含量顯著升高（P＜0.05）。各組斑馬魚腦組織BDNF 質(zhì)量分?jǐn)?shù)別為：對照組（389.18±37.38）、模型組（392.39±26.89）、實(shí)驗(yàn)組（447.38±48.32）pg/mg。這表明，EPP 可以提高自然衰老斑馬魚腦組織中的BDNF 含量。

圖3 馬氏珠母貝酶解蛋白粉對斑馬魚腦組織BDNF含量的影響Fig.3 Effect of EPP on the content of BDNF in zebrafish brain tissue

3 討論

學(xué)習(xí)記憶能力會受到衰老的顯著影響，是最先衰退的認(rèn)知功能之一[20]。衰老伴隨的自由基氧化會通過促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)炎癥小體的形成、誘導(dǎo)MAPK（絲裂原活化蛋白激酶）磷酸化、活化NF-κB（調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子分泌的核轉(zhuǎn)錄因子），導(dǎo)致大腦慢性炎癥，進(jìn)而損傷宿主的學(xué)習(xí)記憶能力[21-23]。本研究結(jié)果表明，EPP 中蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)78.28%，經(jīng)酶解后，含有大量的低分子肽。氨基酸測定結(jié)果表明，EPP 含有豐富的酸性氨基酸（Glu、Asp）和疏水性氨基酸，分別占總氨基酸的28.21%、36.62%。酸性氨基酸可作為氫供體中和自由基的氧化性；疏水性氨基酸可提高小分子肽在體內(nèi)水-脂界面的溶解度，提升抗氧化能力，EPP 可能通過抗氧化途徑抑制炎癥反應(yīng)、提高學(xué)習(xí)記憶能力[24]。另外，金屬元素含量測定結(jié)果表明，EPP 含有豐富的Ca、Fe、Zn 元素。金屬元素在人體中主要以酶輔基或直接參與的形式影響包括學(xué)習(xí)記憶在內(nèi)的所有生命活動，孫艷等[25]研究發(fā)現(xiàn)Zn 預(yù)處理可以降低LPS 誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥，補(bǔ)充Zn 可能對學(xué)習(xí)記憶有改善作用。從EPP 的營養(yǎng)組成來看，其可能具有通過抗氧化途徑或直接作用改善大腦炎癥狀況，提升學(xué)習(xí)記憶能力的功效。

衰老會導(dǎo)致包括斑馬魚在內(nèi)的脊椎動物學(xué)習(xí)記憶能力下降，且衰老斑馬魚學(xué)習(xí)記憶能力的衰退可通過行為學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行評估[26-27]。T 迷宮是從嚙齒類動物向斑馬魚學(xué)習(xí)記憶研究工具轉(zhuǎn)化的經(jīng)典范例，其在簡單的設(shè)備和較少的學(xué)習(xí)成本條件下即可評估斑馬魚的學(xué)習(xí)記憶能力[28]。在迷宮試驗(yàn)中，予以斑馬魚食物獎勵刺激是常用的刺激方式之一[29]。本研究采用T 迷宮行為學(xué)方法，分析斑馬魚的覓食成功率、潛伏期、右臂游動路程占比以評估斑馬魚的學(xué)習(xí)記憶能力。結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組斑馬魚覓食成功率偏低而潛伏期偏高，呈現(xiàn)出學(xué)習(xí)記憶能力的損傷趨勢；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組斑馬魚在行為學(xué)測試期1～ 2 d 的覓食成功率（P＜0.05）、右臂游動路程占比（P＜0.05）、潛伏期表現(xiàn)全面提升，表明EPP 可以明顯改善自然衰老斑馬魚的學(xué)習(xí)記憶能力。

學(xué)習(xí)與記憶的基礎(chǔ)是突觸可塑性，包括新突觸的形成、神經(jīng)元重塑、新神經(jīng)元的生成[30]。突觸可塑性衰退的中心活動是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫激活，即神經(jīng)炎癥[31]。小膠質(zhì)細(xì)胞是一種存在于腦組織的主要免疫細(xì)胞，衰老條件下會發(fā)生活化，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可以極化為兩種不同的表型：M1 型和M2型[32]。M1 型極化是一種有害表型，其特征在于促炎因子（IL-1β、TNF-α 等）的高表達(dá)，反映腦組織炎癥狀況。IL-1β、TNF-α 等促炎細(xì)胞因子，可直接抑制LTP（引起突觸可塑性改變的主要形式），造成記憶能力下降[33]，對神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育和存活產(chǎn)生不利影響[34]；IL-1β、TNF-α 也可能通過降低BDNF表達(dá)量，損傷學(xué)習(xí)記憶能力[30,35]。M2 型極化是一種有益表型，其特征在于BDNF 和抑炎因子（IL-10等）的表達(dá)[32]，BDNF 是一種廣泛存在于大腦的蛋白質(zhì)，與神經(jīng)再生、空間學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)，可以通過誘發(fā)LTP、促進(jìn)神經(jīng)元發(fā)育和存活而影響記憶的形成，與神經(jīng)元的突觸可塑性呈正相關(guān)[33,36]。IL-10是一種抗炎細(xì)胞因子，可以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增殖，降低其它促炎細(xì)胞因子水平。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組斑馬魚腦組織中IL-1β、TNF-α含量均顯著上升（P＜0.05）、BDNF 含量無明顯差異；在EPP 飼喂后，與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組斑馬魚腦組織中的IL-1β、TNF-α 含量均顯著下降（P＜0.05）、BDNF 含量顯著升高（P＜0.05）。表明EPP對神經(jīng)炎癥有抑制作用，其可通過緩解神經(jīng)炎癥、提高BDNF 含量來改善衰老斑馬魚學(xué)習(xí)記憶能力。斑馬魚腦組織IL-10 含量各組之間的差異并不顯著（P＞0.05），但模型組斑馬魚腦組織中IL-10、BDNF含量的相對增加，表示斑馬魚大腦可能因衰老而觸發(fā)的適應(yīng)性機(jī)制，自身會通過適當(dāng)?shù)目寡追磻?yīng)來補(bǔ)償炎癥水平的加劇。Song 等[37]的研究也表現(xiàn)出斑馬魚在逆環(huán)境中的IL-10 和BDNF 上升。值得注意的是，雖然與對照組相比，模型組斑馬魚腦組織中的IL-1β、TNF-α 含量顯著升高，但是與對照組相比，模型組斑馬魚并未表現(xiàn)出更差的行為學(xué)結(jié)果，這可能是由于6 月齡和18 月齡斑馬魚對環(huán)境變化的不同敏感程度造成的。Remy 等[38]對環(huán)境富集條件下青年和衰老斑馬魚的行為學(xué)進(jìn)行研究，所得結(jié)果與本研究一致。

EPP 改善自然衰老斑馬魚學(xué)習(xí)記憶能力的功效可能是基于酶解產(chǎn)生的肽類物質(zhì)或者包括金屬元素在內(nèi)的其它組分，也可能是所有成分共同作用的結(jié)果。其改善學(xué)習(xí)記憶的物質(zhì)基礎(chǔ)還需進(jìn)一步探究，另外，本研究雖在參考文獻(xiàn)基礎(chǔ)上采用EPP 3.0 g/(kg·d) 的飼喂劑量，發(fā)現(xiàn)EPP 具有改善自然衰老斑馬魚學(xué)習(xí)記憶能力的功效，但是其具體的量效關(guān)系仍然未知。因此，在本研究基礎(chǔ)上，對不同劑量的EPP 分離組分改善衰老斑馬魚學(xué)習(xí)記憶能力的探討將作為下一步工作的重點(diǎn)。

4 結(jié)論

EPP 是一種高蛋白、氨基酸種類齊全，富含金屬元素的優(yōu)質(zhì)海洋食品原料。飼喂EPP 30 d 后，自然衰老斑馬魚進(jìn)入T 迷宮右臂的成功率、潛伏期及右臂游動路程占比均有明顯改善，腦組織中IL-1β、TNF-α 含量顯著降低，BDNF 含量升高。表明EPP 具有改善自然衰老斑馬魚學(xué)習(xí)記憶能力的功效，其機(jī)制可能與EPP 緩解斑馬魚腦組織炎癥狀況、提高腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子水平有關(guān)。