水解單寧對(duì)副溶血弧菌感染凡納濱對(duì)蝦血液及血細(xì)胞免疫指標(biāo)的影響

朱旭楓，鄧秋霞，郭 慧，李廣麗,2,3，朱春華,2,3,4

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院// 2.廣東省名特優(yōu)魚類生殖調(diào)控與繁育工程技術(shù)研究中心// 3.廣東省海水養(yǎng)殖生物育種工程實(shí)驗(yàn)室//4.廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088）

凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）具有生長(zhǎng)速度快、抗病力強(qiáng)、出肉率高、肉質(zhì)可口和蛋白含量高等特點(diǎn)[1]，是我國(guó)重要養(yǎng)殖蝦種，2019 年其養(yǎng)殖產(chǎn)量占全國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量的85%[2]。由于消費(fèi)者需求日益擴(kuò)大，凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖模式從粗放型轉(zhuǎn)向集約型，但高密度的養(yǎng)殖模式導(dǎo)致弧菌病頻發(fā)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，限制了凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖的發(fā)展[3-4]。副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是弧菌科的革蘭陰性菌，常寄生于魚、蝦、蟹、貝類和海藻等海產(chǎn)品，是造成對(duì)蝦早期死亡綜合征、對(duì)蝦急性肝胰腺壞死綜合征的病原體[5-6]。近年來(lái)，研究人員不斷地尋找病害解決方案，降低疾病造成的損失[7]。

對(duì)蝦養(yǎng)殖中防治病害常見(jiàn)的做法是使用抗生素，但長(zhǎng)期添加抗生素不僅會(huì)通過(guò)食物鏈富集，危害人類的健康，也破壞水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中的微生物結(jié)構(gòu)，甚至使病原體產(chǎn)生耐藥性[8]。因此我國(guó)正不斷限制抗生素在畜牧業(yè)中的使用，尋找有效的抗生素替代物防治病害[9]。有研究報(bào)道，水解單寧（Hydrolyzable Tannins，HTs）在替代抗生素方面有巨大的潛力[10]。

水解單寧在多種植物中存在，分子質(zhì)量500～3000 u，具有較強(qiáng)收斂、抗菌、抗氧化、抗炎等生物活性，在皮革、醫(yī)藥、食品、日用化學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[10]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)在如雞、豬和兔等畜禽動(dòng)物的飼料中添加低濃度的水解單寧可以提高動(dòng)物的生長(zhǎng)性能和保護(hù)腸道健康[11-14]。然而，目前水解單寧在水產(chǎn)動(dòng)物中的研究較少。

本研究通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定感染副溶血弧菌24 h 后對(duì)蝦血細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率、活性氧（Reactive oxygen species，ROS）含量、一氧化氮（Nitric oxide，NO）含量和酯酶活力，并且測(cè)定免疫相關(guān)的酶活性和基因表達(dá)水平，綜合分析飼料中添加水解單寧對(duì)凡納濱對(duì)蝦感染副溶血弧菌后血液及血細(xì)胞的影響，為今后水解單寧在對(duì)蝦養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 飼料制備

本實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)飼料根據(jù)凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)需求制備，飼料成分和營(yíng)養(yǎng)水平參照Prabu 等[15]。在飼料中按質(zhì)量分?jǐn)?shù)0%（對(duì)照組，CK）、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%等5 個(gè)濃度梯度添加水解單寧（斯洛文尼亞Tanin 公司提供）。實(shí)驗(yàn)所用飼料按照要求制備完成后晾干，用塑料袋封裝后放入4 ℃的冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 飼養(yǎng)管理

凡納濱對(duì)蝦由廣東海洋大學(xué)東海島海洋生物研究基地提供。進(jìn)行為期60 d 的養(yǎng)殖后從5 個(gè)組中分別挑選規(guī)格大小統(tǒng)一均勻、活潑、附肢完整、無(wú)明顯損傷或病害、無(wú)附著生物的健康個(gè)體，每組10尾對(duì)蝦，設(shè)3 個(gè)重復(fù)，將對(duì)蝦運(yùn)送到廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)樓實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)2 周。暫養(yǎng)期間仍然用不同濃度的水解單寧飼料進(jìn)行投喂，每天投喂2 次（分別于8:00、18:00 進(jìn)行投喂），投喂后0.5～ 1 h 觀察攝食剩料情況，根據(jù)凡納濱對(duì)蝦的攝食和生長(zhǎng)情況調(diào)整飼料的投喂量。每天進(jìn)行一次水質(zhì)檢測(cè)，定期進(jìn)行排換水，檢測(cè)并記錄水中的溶氧、水溫、pH 的變化，每天采取換水操作。暫養(yǎng)期間不斷充氧，溶氧≥ 6 mg/L，水溫為27～ 29 ℃，pH 為8.0 ± 0.2，自然光照?？崭?4 h 后注射副溶血弧菌進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)。

1.3 弧菌的制備

本實(shí)驗(yàn)所用副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）由廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。首先配制100 mL 的大豆蛋白胨培養(yǎng)基（TSB，質(zhì)量分?jǐn)?shù)2% NaCl），經(jīng)121 ℃滅菌后冷卻至室溫，接種-20 ℃保存的副溶血弧菌，于28 ℃、120 r/min 條件下震蕩培養(yǎng)22 h，進(jìn)行第一次活化；第二次用250 mL 的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，方法同第一次。接著4 ℃、7 000 r/min 離心10 min，棄上清液，加磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸細(xì)菌細(xì)胞。預(yù)實(shí)驗(yàn)利用細(xì)菌平板計(jì)數(shù)法獲得合適的濃度。參考Kiran 等[16]的實(shí)驗(yàn)，攻毒時(shí)間為24 h。攻毒用菌濃度為2.5×108CFU·mL-1，注射量為0.2 mL，注射部位為凡納濱對(duì)蝦第三腹節(jié)。

1.4 樣品采集

注射副溶血弧菌24 h 后，使用一次性無(wú)菌注射器（1 mL），內(nèi)含預(yù)冷的抗凝劑（葡萄糖20.5 g·L-1，檸檬酸鈉8 g·L-1，氯化鈉4.2 g·L-1，pH 7.5），與血淋巴體積比為1∶1。在圍心腔處抽取其血淋巴部分于4 ℃放置，用于流式細(xì)胞儀FAC Verse（Becton Dickinson，USA）檢測(cè)，通過(guò)Cell Quest（Becton Dickinson Immunocytometry Systems，San Jose，CA）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)獲取和分析；另一部分提取RNA 用于TLR 和HSP70 基因表達(dá)的測(cè)定。余下的血淋巴放至高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)）進(jìn)行4 ℃離心（3 500 r/min）10 min，取上清液于1.5 mL 的離心管中，保存在-80 ℃超低溫冰箱，用于非特異性免疫、抗氧化相關(guān)酶活性的測(cè)定。

1.5 非特異性免疫酶和抗氧化相關(guān)酶活性的測(cè)定

血清的堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AKP）、酸性磷酸酶（Acid phosphatase，ACP）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、總抗氧化能力（Total antioxidant capacity，T-AOC）和溶菌酶（Lysozyme，LZM）活性檢測(cè)均使用商業(yè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）。AKP 和ACP 活性采用微量酶標(biāo)法測(cè)定，SOD 活性采用WST-1 法測(cè)定，T-AOC 采用FRAP 法測(cè)定，LZM 活性采用比濁法測(cè)定。測(cè)定操作過(guò)程嚴(yán)格遵守試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，確保測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.6 總RNA 的提取及cDNA 的合成和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Q-PCR）

使用TRIzol（Invitrogen，美國(guó)）法進(jìn)行凡納濱對(duì)蝦血淋巴總RNA 的提取，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行。將總RNA 用15 mg/mL 的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳操作，之后在全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)（Tanon，上海）觀察其完整性。用Nano Drop 2000c（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）微量分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA 濃度?？俁NA 樣品保存于-80 ℃超低溫冰箱用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。使用反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（Takara，日本）對(duì)所提取的血淋巴總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，實(shí)驗(yàn)操作步驟嚴(yán)格參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄所得產(chǎn)物用超純水稀釋10 倍后用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

1.6.1引物設(shè)計(jì) 內(nèi)參基因β-actin參照文獻(xiàn)[17]，Toll 樣受體（Toll-like receptors,TLR）和熱休克蛋白70（Heat shock protein70,HSP70）基因引物參照文獻(xiàn)[18]，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 Q-PCR 所用引物序列Table 1 Primers sequences for Quantitative Real-time PCR

1.6.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)分析 按照SYBR Green qPCR Mix（with ROX）試劑盒（廣州東盛生物科技有限公司）說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，反應(yīng)體系（10 μL）：DNA 模板1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，超純水ddH2O 2 μL，2×Power Green qPCR Mix 5 μL。

實(shí)驗(yàn)儀器為L(zhǎng)ightCycler480 熒光定量PCR 儀。三種目的基因qPCR 反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性3 min；下面三步循環(huán)40 次：95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s?；蚪Y(jié)果使用2-ΔΔCt法分析計(jì)算表達(dá)水平[19]。

利用SPSS 18.0 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），若組間數(shù)據(jù)差異顯著，則采用Duncan 多重比較檢驗(yàn)，顯著性水平設(shè)為0.05。若P＜ 0.05 則認(rèn)為組內(nèi)數(shù)據(jù)差異顯著，數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean ± S.D.）來(lái)表示。使用 Excel 2016 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理與作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 血細(xì)胞流式指標(biāo)

注射副溶血弧菌24 h 后，實(shí)驗(yàn)組凡納濱對(duì)蝦的血細(xì)胞凋亡率、ROS 含量、NO 含量、酯酶活性與對(duì)照組都有顯著性差異。結(jié)果顯示，添加水解單寧的凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞凋亡率均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），其中0.10%和0.15%組的凋亡率最低，其次為0.05%組，0.20%組（圖1_A）。ROS 含量呈現(xiàn)逐級(jí)遞減趨勢(shì)，對(duì)照組含量顯著高于實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05），是0.05%組含量的兩倍，0.15%和0.20%組的含量最低（圖1_B）。實(shí)驗(yàn)組的NO 含量均顯著低于對(duì)照組（P＜ 0.05），0.10%組的NO 含量最低，其次為0.15%、0.05%和0.20%組（圖1_C）。0.10%組的酯酶活性最大，同時(shí)其他實(shí)驗(yàn)組都顯著高于對(duì)照組（P＜ 0.05）（圖1_D）。

圖1 水解單寧對(duì)凡納濱對(duì)蝦經(jīng)副溶血弧菌脅迫后血細(xì)胞凋亡率、ROS 含量、NO 含量、酯酶活性的影響Fig.1 Effects of HTs on Apoptotic cell ratio,ROS content,NO content and esterase activity of Litopenaeus vannamei challenged by Vibrio parahaemolyticus

2.2 血清非特異性免疫酶活性

圖2 為水解單寧對(duì)凡納濱對(duì)蝦經(jīng)副溶血弧菌脅迫后血清非特異性免疫酶活性的影響。AKP，ACP和LZM 活性反映機(jī)體非特異性免疫能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在注射副溶血弧菌24 h 后，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組血清的AKP、ACP 和LZM 活性顯著增高（P＜0.05）。并且0.15%組凡納濱對(duì)蝦血清的AKP（圖2_A）和ACP（圖2_B）達(dá)到最大值，在0.10%組凡納濱對(duì)蝦血清的LZM（圖2_C）達(dá)到最大值，表明水解單寧可有效提高凡納濱對(duì)蝦血清的非特異性免疫酶活力。

圖2 水解單寧對(duì)凡納濱對(duì)蝦經(jīng)副溶血弧菌脅迫后血清非特異性免疫酶活性的影響Fig.2 Effects of HTs on non-specific immunity enzymatic activities in the serum of Litopenaeus vannamei challenged by Vibrio parahaemolyticus

2.3 血清抗氧化相關(guān)酶活性

圖3 為水解單寧對(duì)凡納濱對(duì)蝦經(jīng)副溶血弧菌脅迫后血清抗氧化酶活性的影響。SOD 和T-AOC 是重要的抗氧化酶。在注射副溶血弧菌24 h 后的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組血清的SOD 和T-AOC活性顯著增高（P＜ 0.05）。并且在0.15%組，凡納濱對(duì)蝦血清的SOD（圖3_A）達(dá)到最大值，實(shí)驗(yàn)組各組之間的T-AOC 活性無(wú)顯著差異（P＞ 0.05）（圖3_B），均顯著高于對(duì)照組（P＜ 0.05）。結(jié)果表明，水解單寧可有效提高凡納濱對(duì)蝦血清的抗氧化酶活力，增強(qiáng)凡納濱對(duì)蝦對(duì)弧菌的抗性。

圖3 水解單寧對(duì)凡納濱對(duì)蝦經(jīng)副溶血弧菌脅迫后血清抗氧化酶活性的影響Fig.3 Effects of HTs on antioxidant capacity enzymatic activities in the serum of Litopenaeus vannamei challenged by Vibrio parahaemolyticus

2.4 TLR 和HSP70 的基因表達(dá)

圖4 為TLR 和HSP70 基因相對(duì)表達(dá)水平。TLR和HSP70 與機(jī)體免疫作用有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)凡納濱對(duì)蝦注射副溶血弧菌24 h 后，實(shí)驗(yàn)組TLR 和HSP70 基因相對(duì)表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P＜ 0.05），并且0.15%組的表達(dá)水平最高，分別是對(duì)照組的18 倍和9倍，說(shuō)明水解單寧可促進(jìn)TLR 和HSP70 基因的表達(dá)。

圖4 水解單寧對(duì)經(jīng)副溶血弧菌脅迫后凡納濱對(duì)蝦TLR 和HSP70 基因表達(dá)水平的影響Fig.4 Effects of HTs on relative mRNA expression levels of TLR and HSP70 genes in the hemocyte of Litopenaeus vannamei challenged by Vibrio parahaemolyticus

3 討論

副溶血弧菌會(huì)感染魚、蝦、貝等養(yǎng)殖水產(chǎn)動(dòng)物，造成嚴(yán)重疾病，給養(yǎng)殖戶帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。通過(guò)Zhu 等[20]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)凡納濱對(duì)蝦在感染副溶血弧菌16 h 后，死亡率趨于平穩(wěn)，24 h 后飼料添加0.10%～ 0.20%水解單寧的實(shí)驗(yàn)組存活率顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明水解單寧能夠提高凡納濱對(duì)蝦對(duì)副溶血弧菌的抗性。

甲殼類動(dòng)物的免疫系統(tǒng)不同于脊椎動(dòng)物，主要依靠非特異性免疫識(shí)別和清除入侵異物，保護(hù)機(jī)體健康[21]。AKP、ACP 和LZM 是反映凡納濱對(duì)蝦非特異性免疫的重要指標(biāo)[22]。AKP 和ACP 是存在于甲殼動(dòng)物溶酶體酶中重要的水解酶類，它們形成的水解酶體系可殺滅帶有磷酸酯的異物[23]。AKP 和ACP 在磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用，不僅參與DNA 合成與蛋白質(zhì)分泌，還與脂的代謝有關(guān)[24]。LZM 是一種天然抗感染且具有殺菌作用的堿性酶，在甲殼動(dòng)物體內(nèi)廣泛存在。通過(guò)水解細(xì)菌的多糖，引起細(xì)胞壁破裂內(nèi)容物逸出而使細(xì)菌溶解，達(dá)到免疫預(yù)防作用[25]。本研究結(jié)果顯示，在副溶血弧菌脅迫下，實(shí)驗(yàn)組對(duì)蝦血清的AKP、ACP 和LZM 活力均顯著高于對(duì)照組，表明水解單寧有效提高對(duì)蝦非特異性免疫能力。近年來(lái)，甲殼類動(dòng)物的TLR 基因受到越來(lái)越多關(guān)注[26]。有研究顯示，TLR 通路機(jī)制在免疫中發(fā)揮重要作用[18]，可識(shí)別相關(guān)的病原相關(guān)分子模式，是參與病毒或弧菌引起對(duì)蝦免疫調(diào)控的一類重要蛋白質(zhì)分子，因此機(jī)體受到病原體等外來(lái)刺激之后，TLR 便會(huì)激活凡納濱對(duì)蝦的免疫應(yīng)答[27]。實(shí)驗(yàn)組TLR 基因表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，表明水解單寧可在一定程度上提高凡納濱對(duì)蝦非特異性免疫能力。HSP70 可增強(qiáng)應(yīng)激細(xì)胞耐受力，還在抗細(xì)胞凋亡、抗氧化和免疫等反應(yīng)中起重要作用[28]。Gullo 等[29]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)HSP70 基因表達(dá)水平升高時(shí)，氧化應(yīng)激產(chǎn)生的H2O2對(duì)細(xì)胞膜的損傷減小，這與本研究結(jié)果一致。相對(duì)于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組的HSP70 基因表達(dá)水平均顯著增高，表明水解單寧可提高凡納濱對(duì)蝦的抗性。

血細(xì)胞在甲殼動(dòng)物的細(xì)胞免疫和體液免疫中起著重要作用[30]。血細(xì)胞損傷會(huì)造成機(jī)體免疫功能下降[31]。據(jù)報(bào)道，副溶血弧菌能破壞對(duì)蝦機(jī)體免疫防御系統(tǒng)[32]。由于對(duì)蝦受到脅迫會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，影響細(xì)胞吞噬活性等，血細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率、ROS 含量、NO 含量和酯酶活性會(huì)因此發(fā)生變化[33-35]，故這些指標(biāo)的變化可作為機(jī)體免疫狀態(tài)的判斷依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率顯著低于對(duì)照組，說(shuō)明當(dāng)對(duì)蝦受到副溶血弧菌脅迫時(shí)，水解單寧能夠增強(qiáng)對(duì)蝦機(jī)體免疫能力，減少對(duì)蝦體內(nèi)血細(xì)胞損傷。ROS 是細(xì)胞吞噬過(guò)程中呼吸暴發(fā)現(xiàn)象產(chǎn)生的一種高活性化學(xué)物質(zhì)。正常情況下，ROS 是機(jī)體新陳代謝的副產(chǎn)物，具有殺滅微生物和惡性細(xì)胞的作用。雖然ROS 具有強(qiáng)大殺菌作用，但是持續(xù)不斷的外界刺激會(huì)打破機(jī)體內(nèi)ROS 平衡，ROS 水平會(huì)急劇增加，對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成損害。已經(jīng)有許多研究報(bào)道各種非生物因素脅迫會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)量ROS[36-37]。盧芷程等[38]研究發(fā)現(xiàn)，溶藻弧菌感染凡納濱對(duì)蝦會(huì)造成體內(nèi)血細(xì)胞ROS 不斷累積，說(shuō)明弧菌的感染也會(huì)影響機(jī)體內(nèi)ROS 水平。本研究結(jié)果顯示，水解單寧可有效降低在副溶血弧菌脅迫下凡納濱對(duì)蝦血清中ROS 的累積。NO 是一種重要的第二信使分子，與ROS 相似，低濃度的NO 和ROS 對(duì)機(jī)體是有益的，能夠抑制細(xì)胞的凋亡，正常情況下NO 在機(jī)體中處于平衡狀態(tài)，參與機(jī)體免疫相關(guān)的生理過(guò)程，還能通過(guò)與氧代謝產(chǎn)生的超氧自由基結(jié)合生成過(guò)氧化一氮?dú)绮≡w[39]。劉文珍等[40]研究表明，NO 系統(tǒng)可以殺滅凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)入侵的溶藻弧菌，但是在弧菌等刺激下，機(jī)體會(huì)不斷累積NO，高濃度的NO 會(huì)擾亂對(duì)蝦的抗氧化系統(tǒng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[41-42]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組NO水平相對(duì)于對(duì)照組均較低，即水解單寧可有效降低在副溶血弧菌脅迫下凡納濱對(duì)蝦血清中NO 的累積。酯酶是溶酶體酶類的一種，廣泛存在于各種細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞降解致病菌和清除外源性物質(zhì)中起著重要作用[43]，其活力的大小也反映細(xì)胞的免疫能力[44]。郭慧等[34]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的酯酶活性下降與細(xì)胞活性下降有關(guān)，且會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物環(huán)境脅迫的研究[45-46]顯示，甲殼動(dòng)物細(xì)胞的酯酶活性會(huì)顯著被抑制。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于對(duì)照組，水解單寧顯著激發(fā)凡納濱對(duì)蝦細(xì)胞內(nèi)的酯酶活性，以應(yīng)對(duì)副溶血弧菌的脅迫。

抗氧化酶防御系統(tǒng)在清除或中和ROS 的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，并最終維持生物系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)[47]。SOD 和T-AOC 是生物體中反映機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)，可清除體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧，阻止由活性氧誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激[22]，其活性變化可反映對(duì)蝦健康狀況。一些研究[38,40]發(fā)現(xiàn)，弧菌會(huì)造成對(duì)蝦體內(nèi)氧自由基系統(tǒng)異常，從而造成機(jī)體氧化損傷。目前，水解單寧在水生動(dòng)物中的研究還較少，在畜禽飼料中的應(yīng)用研究較多，水解單寧提高機(jī)體抗氧化能力也得到廣泛的認(rèn)可。龐樹坤[48]研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加水解單寧能夠清除育肥豬體內(nèi)的氧自由基，提高育肥豬的抗氧化酶活性及減少體內(nèi)氧化應(yīng)激造成的損傷。Liu 等[49]實(shí)驗(yàn)表明，在飼料中添加水解單寧可提高斷奶仔豬血清和腸黏膜的抗氧化能力以及機(jī)體免疫能力。Star?evi? 等[50]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加水解單寧可提高1～ 28 日齡仔雞的抗氧化能力。陳賽娟等[51]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加0.10%、0.15%和0.20%的水解單寧能促進(jìn)生長(zhǎng)獺兔免疫器官的發(fā)育，提高機(jī)體的抗氧化能力。劉華偉[52]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加水解單寧可顯著提高肉兔血清中SOD 活性。本研究結(jié)果表明，飼料中添加水解單寧可提高凡納濱對(duì)蝦的抗氧化能力，維持機(jī)體氧化還原平衡。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加水解單寧可提高凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞的抗氧化能力，增強(qiáng)非特異性免疫能力，從而提高抗副溶血弧菌感染的能力；可有效降低血細(xì)胞ROS 和NO 的累積，提高酯酶活性，減少細(xì)胞凋亡。本研究對(duì)應(yīng)用水解單寧在對(duì)蝦養(yǎng)殖中有一定的指導(dǎo)意義，但水解單寧的作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步探索。