蔬菜體內(nèi)多環(huán)芳烴(PAHs)的調(diào)控機制研究

巫桂芬，龍明華，喬雙雨

（1廣西大學農(nóng)學院，南寧 530004；2廣西民族師范學院，廣西崇左 532200）

0 引言

多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)主要是煤、石油、木材、煙草、有機高分子化合物等有機物不完全燃燒時產(chǎn)生的揮發(fā)性碳氫化合物[1]。迄今已發(fā)現(xiàn)有200多種PAHs，歐美32個國家在歐洲環(huán)境會議上正式將其中危害較大的16種PAHs化合物列入優(yōu)控的名單中（基本信息見表1）[1-2]，其中有相當部分具有致癌性，如苯并α芘、苯并α蒽等[3]。植物可以從土壤和空氣中吸收外源的PAHs，也可以體內(nèi)合成少量的PAHs，并在體內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移或者轉(zhuǎn)化作用[4]。在PAHs脅迫下，蔬菜的生長、元素的吸收及其品質(zhì)指標都發(fā)生較大的改變[5]。研究表明，PAHs能促進部分植物的根對土壤中N、P、K和S的吸收同化，并加速其向莖葉的轉(zhuǎn)移[6]。而上述這些元素在植物的生存生長中發(fā)揮了極其重要的作用，能直接影響植物的新陳代謝以及物質(zhì)的轉(zhuǎn)移。蔡順香等[7]研究表明，芘對莖葉粗蛋白含量、粗纖維和可溶性糖含量有影響。以上研究結(jié)果表明，PAHs與蔬菜體內(nèi)營養(yǎng)成分間存在一定的關(guān)聯(lián)性。而關(guān)于蔬菜體內(nèi)PAHs調(diào)控機制還少見相關(guān)報道。本研究以6種具有一定代表性的蔬菜品種為材料，研究其體內(nèi)PAHs與蛋白質(zhì)、脂肪、VA、VB1、VC、VE、Ca2+、Fe2+、Na+和K+等物質(zhì)的互作關(guān)系，以期揭示PAHs在蔬菜體內(nèi)的調(diào)控機制，為降低蔬菜體內(nèi)多環(huán)芳烴的含量提供理論指導。

表1 16種優(yōu)控PAHs相關(guān)信息

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 以玻璃生菜(Lactucasativavar.capitata)、包心芥菜(Brassicajuncea)、日本冬瓜(Benincasahispida)、金韓密本南瓜(Cucurbitamoschata)、‘桂豐3號’四棱豆(Psophocarpustetragonolobus‘GuifengⅢ’)、‘桂豇2號’豇豆(Vignaunguiculata‘Guijiang Ⅱ’)為供試材料。

1.1.2 試劑與儀器 16種PAHs混合標樣，2000 μg/mL（美國AccuStandard公司）；乙腈、二氯甲烷、正己烷均為色譜純；無水硫酸鈉為分析純；高效液相色譜儀（美國Waters 2695，含2998紫外檢測器），色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美國色譜科公司）。弗羅里硅土SPE柱（1000 mg/6 mL，德國SimonAldrich公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計 生菜、芥菜、冬瓜、南瓜、四棱豆和豇豆等蔬菜樣品均栽培于廣西大學農(nóng)學院基地。主要采用以上蔬菜生長期為60天的食用部位作為檢測樣品。每種蔬菜隨機抽取15株植株的樣品混樣。采回樣品用自來水沖洗2～3次再用蒸餾水洗2次，濾紙吸干表面水分后將每種蔬菜樣品分成2份，一份用于蛋白質(zhì)(PR)、脂肪(fat)、VA、VB1、VC、VE、Ca2+、Fe2+、Na+和K+等成分的測定，另一份用于PAHs測定。PAHs測定的樣品晾干約20%水分后置于烘箱中烘干（烘箱溫度設(shè)為恒溫55℃）。烘干的樣品用研缽研磨成粉末，保存于4℃冰箱，待用。試驗中涉及的含量測定均設(shè)3次生物學重復。

1.2.2 試驗方法

（1）PAHs提取與凈化。稱取2.00 g粉末樣品于離心管中，加入10.00 g的無水硫酸鈉，再加入30 mL二氯甲烷于超聲波中萃取30 min（萃取重復2次），萃取液經(jīng)5000 r/min離心，取上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)至干，用30 mL正己烷溶解。

（2）磺化。加入3 mL 60%濃硫酸，震蕩5 min，待出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，加入30 mL2%無水硫酸鈉溶液破乳，靜置分層后棄去下層水相，用超純水洗滌有機相至中性后過無水硫酸鈉柱，濃縮至3 mL，進行固相萃取凈化。

（3）凈化。樣品過容量為5 mL正己烷活化的弗羅里硅土小柱，采用12 mL洗脫液（V正己烷:V二氯甲烷=2:8）洗脫，收集液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，再加入1.5 mL乙腈充分溶解，并過0.22 μm有機濾膜后用于HPLC/UV檢測。

（4）樣品PAHs檢測。樣品進樣量為30 μL，檢測波長254 nm，柱溫為30℃，流動相為水和乙腈。為了有利于16種PAHs有效分離以及減少分析所用時間，試驗采用梯度洗脫方式（表2），采用外標法進行PAHs定量。

表2 流動相梯度洗脫程序

1.3 質(zhì)量控制與數(shù)據(jù)分析

質(zhì)量保證與質(zhì)量控制按照文獻[8]進行。通過空白加標（用等量的石英砂代替分析的樣品，加入PAHs混合標樣）和基質(zhì)加標（PAHs混合標樣加入實際空白樣品）進行回收率測定分析，加標水平為1000 μg/kg，平行測定5次。

蔬菜體內(nèi)蛋白質(zhì)含量測定參照文獻[9]，脂肪測定方法參照文獻[10]進行，VA、VB1、VC、VE、Ca2+、Fe2+、Na+和K+等物質(zhì)含量由廣西質(zhì)檢院代測。

研究過程所涉及的物質(zhì)含量、平均值、求和等運算采用Excel 2013，涉及的顯著性和相關(guān)性分析采用SPSS 18.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)量控制與方法回收率

16種PAHs各組分在50～5000 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限范圍為0.5～6.0 μg/kg（表3）?？瞻自囼炛懈髂繕嘶衔锏陀跈z出限；5次空白加標和基質(zhì)加標16種PAHs的平均回收率為61.74%～100.00%和69.01%～149.26%；最后結(jié)果經(jīng)過空白扣除。本試驗設(shè)計進行的方法回收率試驗為樣品檢測的準確性和可靠性提供了基本的保障。

表3 16種PAHs相關(guān)系數(shù)及其檢出限

2.2 蔬菜體內(nèi)16種PAHs單體含量分布

結(jié)果表明，生菜、芥菜、冬瓜、南瓜、四棱豆和豇豆體內(nèi)及其栽培土壤中PAHs的種類和含量不同（圖1）。土壤中僅檢測出5種PAHs。蔬菜中葉類菜含有12～14種，瓜類含有11種，豆類含有5～7種。蔬菜體內(nèi)PAHs以2～4環(huán)為主，5、6環(huán)的PAHs則表現(xiàn)為選擇性的存在部分蔬菜體內(nèi)。16種優(yōu)控的PAHs中，NAP和ANY在生菜、芥菜、冬瓜、南瓜、四棱豆和豇豆中都能檢測到，其含量在10.35～77.75 μg/kg之間，說明蔬菜較容易吸收或合成這2種物質(zhì)。

圖1 蔬菜體內(nèi)PAHs的含量分布

2.3 不同蔬菜體內(nèi)∑PAHs含量分布及差異分析

不同類別蔬菜∑PAHs含量（∑PAHs指16種優(yōu)控PAHs的含量之和）不同。芥菜體內(nèi)的∑PAHs含量最高，為958.59 μg/kg；其次是南瓜，含量為765.36 μg/kg；最低的是生菜，含量為212.37 μg/kg。芥菜中∑PAHs含量分別是生菜中的4.5倍和四棱豆的3倍。四棱豆和豇豆體內(nèi)的∑PAHs含量分別為316.81和325.32 μg/kg，兩者間差異未達到顯著性(P＜0.05)。此外，其余蔬菜間∑PAHs含量均達到顯著性差異。

2.4 蔬菜體內(nèi)營養(yǎng)成分含量及其差異分析

不同蔬菜其體內(nèi)成分不同，因而吸收和運輸PAHs的能力不同。6種蔬菜中蛋白質(zhì)、VA、Ca2+和K+的含量都相對較高，VB1含量最低。Na+和K+的含量表現(xiàn)出明顯的品種差異，且達到顯著性差異(P＜0.05)。蛋白質(zhì)的含量最高的為豆類，含量最低的為瓜類。芥菜中VA和Ca2+的含量比其余5種的高；四棱豆中的脂肪含量最高，是南瓜的11倍。蔬菜體內(nèi)脂肪含量高有利于脂溶性物質(zhì)的吸收與運輸。蔬菜體內(nèi)Na+、VB1、VC、VE、Fe2+的含量比蛋白質(zhì)、脂肪、VA、K+、Ca2+的低，且范圍在幾倍到幾十萬倍之間（圖3）?？梢?，不同蔬菜體內(nèi)成分含量不同，同一種蔬菜不同成分含量也表現(xiàn)出明顯的差異性，這與蔬菜自身的生長需要有關(guān)。

圖2 蔬菜體內(nèi)的∑PAHs含量分布及差異性分析

圖3 6種蔬菜營養(yǎng)成分含量分布

2.5 蔬菜體內(nèi)PAHs與其營養(yǎng)成分相關(guān)性分析

通過對每種蔬菜體內(nèi)蛋白質(zhì)、脂肪、VA、VB1、VC、VE、Ca2+、Fe2+、Na+和K+等10種營養(yǎng)成分與16種PAHs單體進行兩兩相關(guān)性分析，表明16種PAHs中有9種與部分營養(yǎng)成分相關(guān)性達到顯著水平。其中表現(xiàn)為正相關(guān)類型多于負相關(guān)。蛋白質(zhì)、VE、VB1、Fe2+與BaP有顯著相關(guān)性；VA、Ca2+、Na+與ANY、ACE、PHE、FLU、CHR、BKF、PYR、BPE等有顯著的相關(guān)性，其相關(guān)系數(shù)分布情況如圖4。

圖4 蔬菜體內(nèi)營養(yǎng)成分與PAHs相關(guān)性

3 結(jié)論

（1）蔬菜體內(nèi)PAHs以2～4環(huán)為主，5、6環(huán)的PAHs則表現(xiàn)為選擇性的存在某些蔬菜體內(nèi)。在蔬菜生長時間及生長環(huán)境相同的情況下，其體內(nèi)PAHs種類及含量由多到少表現(xiàn)為葉類菜＞瓜類＞豆類。

（2）蔬菜體內(nèi)的營養(yǎng)成分不僅為人類提供營養(yǎng)，而且對PAHs有積極的調(diào)節(jié)作用。蛋白質(zhì)、VE、VB1、Fe2+對BaP具有協(xié)同的抑制作用，VA、Ca2+對ANY、ACE、PHE、FLU、CHR、BKF、PYR、BPE等有直接或間接的抑制作用，而Na+促進了BKF、FLU和BPE在蔬菜體內(nèi)的積累。

4 討論

4.1 蔬菜體內(nèi)PAHs含量分布特征

本研究通過對6種不同蔬菜體內(nèi)PAHs檢測分析，得出葉類菜PAHs種類比瓜類和豆類多。該結(jié)果與喬雙雨等[12]研究結(jié)果一致。蔬菜的葉面積大小和氣孔數(shù)量直接影響了空氣中PAHs吸收和積累[8,11]。因此葉類菜的PAHs不僅含量高種類也多。而16種優(yōu)控PAHs中，低環(huán)PAHs主要存在于大氣中，這些PAHs更容易與植物葉片接觸。單位質(zhì)量下，瓜類和豆類的果實與大氣的接觸面積相對較小，直接吸收PAHs的量比葉片少。其二，不同的器官或組織對PAHs的積累或轉(zhuǎn)化有差別[13]。四棱豆中PAHs種類比其他蔬菜少，且∑PAHs也相對較低，這可能是四棱豆中某些物質(zhì)具有分解PAHs或抑制PAHs生成的作用。同是葉類菜，芥菜中∑PAHs的含量是生菜的4.5倍。這可能跟物種間結(jié)構(gòu)和成分及生長發(fā)育階段不同有關(guān)。蔬菜體內(nèi)PAHs的含量不僅與檢測部位有關(guān)，還與蔬菜自身的形態(tài)和生理的差異有關(guān)[14]。因此不同類別蔬菜或不同組織器官對于PAHs吸收、運輸和積累等具有一定的選擇和調(diào)控作用。

蔬菜不同器官結(jié)構(gòu)和功能不同，體內(nèi)成分不同，其對PAHs的吸收、合成、積累或轉(zhuǎn)化的能力不同。有研究表明PAHs可通過根、莖、葉等器官進入蔬菜體內(nèi)，并在不同器官中發(fā)生轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)化[13-14]。孔祥勝[15]的研究表明南寧市大氣中∑PAHs濃度范圍在174.59～581.06 ng/(m2·d)。按以上研究結(jié)果，空氣中的PAHs全部被吸收到蔬菜體內(nèi)，那么蔬菜生長期間（60天）單位面積(1 m2)能接收到的PAHs含量范圍為10.48～34.86 μg。而檢測蔬菜樣品接觸空氣的面積遠小于1 m2。以最大值計算，土壤和空氣中∑PAHs含量之和小于南瓜器官中的含量。說明蔬菜體內(nèi)具有一定的合成或轉(zhuǎn)化功能，同時該過程受到體內(nèi)成分的調(diào)節(jié)作用。

4.2 蔬菜體內(nèi)營養(yǎng)成分與PAHs的調(diào)控機制

不同種類蔬菜體內(nèi)成分及含量不同。同一機體內(nèi)，物質(zhì)間既分工又合作，它們共同承擔機體的正常運行。研究表明，植物體內(nèi)的PAHs吸收或合成受到體內(nèi)成分的調(diào)控[16]。根據(jù)相關(guān)性分析得出2個關(guān)聯(lián)類群（圖5）。類群1由蛋白質(zhì)、VB1、VE、Fe2+共同抑制蔬菜體內(nèi)BaP的含量變化，BaP受到VE的直接抑制作用，同時受到蛋白質(zhì)、VB1、Fe2+的間接調(diào)控。類群2表明VA、Ca2+對蔬菜體內(nèi) ANY、ACE、PHE、FLU、CHR、BKF、PYR、BPE等有抑制的作用，而Na+能促進蔬菜體內(nèi)BKF、FLU和BPE吸收與積累。

圖5 蔬菜體內(nèi)部分PAHs的調(diào)控路徑

蔬菜生理結(jié)構(gòu)及成分差異使其在外界不良入侵時，表現(xiàn)出了不同的反應(yīng)。類群1中蛋白質(zhì)作為其中心調(diào)節(jié)元，具有免疫、調(diào)節(jié)機體的生命活動和運輸載體的功能，是組成細胞或組織的重要成分。機體所有活動幾乎都需要蛋白質(zhì)的參與[17]，蛋白質(zhì)通過直接影響VB1、Fe2+和VE來調(diào)控具有強致癌性的BaP。由于活體蔬菜中富含VB1和VE，所以在活體蔬菜中難以檢測到BaP，而在燒烤的食物中卻容易檢測出較高的含量。VB1主要作用是協(xié)調(diào)碳水化合物的新陳代謝和能量的產(chǎn)生[18]，VB1含量高有利于植物的代謝活動，為蛋白質(zhì)的合成提供能量[19]。Fe2+是多種蛋白酶的重要組成成分，蛋白質(zhì)的含量增加對Fe2+的要求也隨之增加。而Fe2+的還原性及VA和VC的活性在VE的作用下得以保持相對平衡的水平[20]。VE除了具有抗氧化的作用，還具有清除自由基的能力，對BaP自由基的清除起到了積極的作用[21]。

類群2中，VA具有很強對抗自由基的作用，可有效去除機體內(nèi)PAHs自由基，它能促進蔬菜體內(nèi)Ca2+的吸收[22]，并抑制PAHs的相互轉(zhuǎn)化。Ca2+是植物細胞壁和胞間層的組成成分，其對碳水化合物和蛋白質(zhì)的合成以及植物體內(nèi)生理活動的平衡等起著重要作用[23]。Ca2+能促進原生質(zhì)膠體凝聚，降低水合度，使原生質(zhì)粘性增大，減少植株體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)外滲[24]。因此蔬菜可通過Ca2+含量調(diào)節(jié)其體內(nèi)水合度和粘性，并影響PAHs的吸收、轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)化[25]。Na+和K+的含量一定程度上影響了蔬菜的氣孔開閉[26-27]，從而直接或間接地影響了蔬菜體內(nèi)PAHs的分布情況。在蔬菜體內(nèi)PAHs，除CHR對BkF、FLU和PHE有抑制的作用外，ANY與CHR存在相互促進作用，同時BPE與ACE、PYR及BkF與PHE、FLU也表現(xiàn)為促進的作用。說明在植物體內(nèi)的PAHs除了自身合成和體外吸收外，部分PAHs間還可以發(fā)生相互轉(zhuǎn)化。

4.3 展望

本研究從6種常見蔬菜營養(yǎng)成分在代謝過程中起的作用及蔬菜體內(nèi)營養(yǎng)成分含量與PAHs含量變化關(guān)系，探討蔬菜體內(nèi)PAHs調(diào)控機制。這為降低蔬菜體內(nèi)PAHs含量提供了一種新的方法。本研究涉及的成分較多，而結(jié)果中未對相關(guān)性較弱的物質(zhì)進行進一步分析，因此可能漏掉一些非關(guān)鍵的輔助成分，這些物質(zhì)也會影響蔬菜體內(nèi)PAHs含量變化。所以在后續(xù)的研究中應(yīng)考慮弱相關(guān)物質(zhì)對PAHs的影響，從而建立起更完善的調(diào)控路線。