HPLC梯度洗脫法同時(shí)測(cè)定慢肝解郁膠囊中8種成分的含量△

沈曉慶，韋杏

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 附屬醫(yī)院 藥學(xué)管理部，遼寧 沈陽 110032；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001

慢肝解郁膠囊收載于《中華人民共和國藥典》2015年版一部，由柴胡、丹參、延胡索等13味中藥加工而成，主要用于肝區(qū)脹痛、胸悶不舒、食欲不振、腹脹便溏所屬肝郁脾虛癥、遷延性肝炎或慢性肝炎等病癥的治療[1]1685。臨床研究表明，慢肝解郁膠囊對(duì)慢性肝炎治療效果顯著[2]，其聯(lián)合復(fù)方鱉甲軟肝片能明顯減輕代償期肝硬化患者的臨床癥狀，改善肝纖維化程度，提高患者生存質(zhì)量，提高臨床療效[3-4]。長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐證明，中藥及其制劑具有顯著的臨床療效，中藥不是單一的有效成分，其發(fā)揮療效的作用機(jī)制和單一化藥不同，具有多靶點(diǎn)、多成分、協(xié)同作用的特點(diǎn)，慢肝解郁膠囊現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1]1684和文獻(xiàn)報(bào)道[5-6]中僅對(duì)其所含單成分芍藥苷、丹酚酸B分別進(jìn)行測(cè)定，暫未檢索到對(duì)該制劑君藥柴胡及其他藥味所含多個(gè)指標(biāo)成分進(jìn)行同時(shí)控制的文獻(xiàn)報(bào)道，難以實(shí)現(xiàn)對(duì)慢肝解郁膠囊產(chǎn)品進(jìn)行全面質(zhì)量控制。本研究參考中藥質(zhì)量標(biāo)志物優(yōu)選原則，首次采用高效液相色譜法(HPLC)梯度洗脫法對(duì)慢肝解郁膠囊所含柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿含量進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，為更加全面地評(píng)價(jià)慢肝解郁膠囊的整體質(zhì)量，指導(dǎo)藥品生產(chǎn)企業(yè)不斷優(yōu)化生產(chǎn)工藝控制參數(shù)，確定原藥材產(chǎn)地來源、采收季節(jié)等提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；MS205DM型電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]。

1.2 試藥

對(duì)照品柴胡皂苷a(批號(hào)：110777-201912，純度：94.8%)、柴胡皂苷d(批號(hào)：110778-201912，純度：96.3%)、隱丹參酮(批號(hào)：110852-201807，純度：99.0%)、丹參酮ⅡA(批號(hào)：110766-201721，純度：99.5%)、延胡索乙素(批號(hào)：110726-201819，純度：99.8%)均購自中國食品藥品檢定研究院；對(duì)照品丹參酮Ⅰ(批號(hào)：17051706，純度：99.9%)、紫堇堿(批號(hào)：17110821，純度：99.6%)均購自上海同田生物技術(shù)股份有限公司；對(duì)照品去氫紫堇堿(批號(hào)：CFS201901，純度：98.0%)購自武漢天植生物技術(shù)有限公司；乙腈為色譜純；其他試劑為分析純。

慢肝解郁膠囊(規(guī)格：0.25 g/粒；批號(hào)分別為1904001、1905002、1907001)均來源于吉林敖東延邊藥業(yè)股份有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1對(duì)照品儲(chǔ)備液和混合對(duì)照品溶液制備 取柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿對(duì)照品適量，精密稱定，用70%乙醇制成質(zhì)量濃度分別為0.682、0.516、0.198、0.154、0.396、0.634、0.578、0.362 mg·mL-1的單組分對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密吸取上述溶液各2.5 mL，用70%乙醇定容至50 mL，制成含柴胡皂苷a 34.1 μg·mL-1、柴胡皂苷d 25.8 μg·mL-1、隱丹參酮9.9 μg·mL-1、丹參酮Ⅰ 7.7 μg·mL-1、丹參酮ⅡA19.8 μg·mL-1、延胡索乙素31.7 μg·mL-1、去氫紫堇堿28.9 μg·mL-1、紫堇堿18.1 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.1.2供試品溶液和陰性樣品溶液制備 取慢肝解郁膠囊內(nèi)容物，取研細(xì)后細(xì)粉2.0 g，精密稱定，精密加入70%乙醇25 mL，稱質(zhì)量，加熱回流提取30 min，放冷后用70%乙醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，濾過，制成慢肝解郁膠囊供試品溶液；按慢肝解郁膠囊處方和制法分別制備缺柴胡、缺丹參和缺延胡索的陰性樣品，再按上述方法制成陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件及專屬性試驗(yàn)

色譜柱：Waters SunFire C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%冰醋酸溶液(B)，梯度洗脫(0～10 min，25%A；10～18 min，25%～42%A；18～32 min，42%～65%A；32～47 min，65%～78%A；47～55 min，78%～25%A)，流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)分別為210 nm[7](0～18.0 min檢測(cè)柴胡皂苷a和柴胡皂苷d)和280 nm[8-11](18.0～55.0 min檢測(cè)隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿)；進(jìn)樣量：10 μL。精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各10 μL，進(jìn)樣測(cè)定并記錄色譜圖。結(jié)果慢肝解郁膠囊中8種成分峰形對(duì)稱，理論塔板數(shù)按各成分峰計(jì)均≥4500，分離度均大于1.5，在與對(duì)照品相應(yīng)的保留時(shí)間處，柴胡陰性樣品溶液色譜圖中未見柴胡皂苷a和柴胡皂苷d色譜峰，丹參陰性樣品溶液色譜圖中未見隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA色譜峰，延胡索陰性樣品溶液色譜圖中未見延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿色譜峰，表明陰性樣品對(duì)慢肝解郁膠囊中8種成分的同時(shí)測(cè)定無干擾，見圖1。

注：A.混合對(duì)照品；B.慢肝解郁膠囊；C.柴胡陰性樣品(批號(hào)：1904001)；D.丹參陰性樣品；E.延胡索陰性樣品；1.柴胡皂苷a；2.柴胡皂苷d；3.隱丹參酮；4.丹參酮Ⅰ；5.丹參酮ⅡA；6.延胡索乙素；7.去氫紫堇堿；8.紫堇堿。圖1 慢肝解郁膠囊混合對(duì)照品、樣品及陰性樣品HPLC圖

2.3 線性關(guān)系考察

精密吸取2.1.1項(xiàng)下單組分對(duì)照品儲(chǔ)備液各0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，用70%乙醇定容至20 mL，制成6個(gè)質(zhì)量濃度梯度的線性考察混合對(duì)照品溶液Ⅰ～Ⅵ(柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿質(zhì)量濃度見表1)，依法進(jìn)樣測(cè)定，以待測(cè)成分柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1。

表1 慢肝解郁膠囊中8種成分的線性考察混合對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度及線性關(guān)系考察結(jié)果

2.4 精密度考察

取混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、延胡索乙素、去氫紫堇堿、紫堇堿峰面積的RSD分別為0.56%、0.83%、1.12%、1.25%、1.01%、0.66%、0.71%和0.98%。

2.5 重復(fù)性考察

取同一批次慢肝解郁膠囊(批號(hào)：1904001)6份制備供試品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、延胡索乙素、去氫紫堇堿、紫堇堿的峰面積，計(jì)算得8種成分含量的RSD分別為1.21%、1.44%、1.75%、0.87%、1.52%、1.36%、0.29%和1.60%。

2.6 穩(wěn)定性考察

取同一份慢肝解郁膠囊(批號(hào)：1904001)供試品溶液，于0、2、4、8、12、18 h進(jìn)樣檢測(cè)柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、延胡索乙素、去氫紫堇堿、紫堇堿的峰面積，結(jié)果慢肝解郁膠囊供試品溶液18 h內(nèi)穩(wěn)定，8種成分峰面積的RSD分別為0.57%、0.79%、1.10%、1.19%、0.97%、0.64%、0.73%和0.95%。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取含量已知的慢肝解郁膠囊(批號(hào)：1904001)樣品適量，傾出內(nèi)容物研細(xì)，取9份，每份1.0 g，精密稱定，精密加入根據(jù)慢肝解郁膠囊各成分含量配制的混合對(duì)照品溶液(柴胡皂苷a 0.378 mg·mL-1、柴胡皂苷d 0.296 mg·mL-1、隱丹參酮0.118 mg·mL-1、丹參酮Ⅰ 0.084 mg·mL-1、丹參酮ⅡA0.236 mg·mL-1、延胡索乙素0.352 mg·mL-1、去氫紫堇堿0.324 mg·mL-1、紫堇堿0.196 mg·mL-1)0.5、1.0、1.5 mL各3份，再按2.1.2項(xiàng)下方法制成供試品溶液，依法進(jìn)樣檢測(cè)柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、延胡索乙素、去氫紫堇堿、紫堇堿的峰面積，計(jì)算各成分的加樣回收率及RSD，結(jié)果見表2。

表2 慢肝解郁膠囊中8種成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表2

2.8 樣品含量測(cè)定

取3批的慢肝解郁膠囊樣品適量，按2.1.2項(xiàng)下方法每批制備3份供試品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、延胡索乙素、去氫紫堇堿、紫堇堿的峰面積，計(jì)算各成分的含量，結(jié)果見表3。

表3 慢肝解郁膠囊樣品含量測(cè)定結(jié)果 mg·g-1

3 討論

3.1 指標(biāo)成分的選擇

慢肝解郁膠囊由柴胡、延胡索、當(dāng)歸、香櫞、白芍、川楝子、丹參、白術(shù)、茯苓、甘草、三棱、麥芽、薄荷13味中藥配伍而來，方中柴胡疏肝解郁、升舉陽氣，為君藥；延胡索、香櫞、川楝子理氣疏肝、活血止痛，當(dāng)歸、白芍養(yǎng)血和血、柔肝疏肝，合為臣藥；丹參、三棱活血行氣、消積止痛，白術(shù)、茯苓健脾祛濕、益氣和中，薄荷疏肝行氣，麥芽健脾和胃，合為佐藥；甘草調(diào)和諸藥，為使藥。諸藥合奏，以達(dá)疏肝解郁、健脾養(yǎng)血之功。本研究參考中藥質(zhì)量標(biāo)志物確認(rèn)原則，選取慢肝解郁膠囊君藥柴胡代表性成分柴胡皂苷a和柴胡皂苷d，臣藥延胡索活性成分延胡索乙素、去氫紫堇堿和紫堇堿，佐藥丹參[12]特征成分隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA為檢測(cè)指標(biāo)成分，以期更加全面地評(píng)價(jià)慢肝解郁膠囊的內(nèi)在質(zhì)量。

3.2 供試品提取方式的確定

考慮到慢肝解郁膠囊方中柴胡、丹參、延胡索、當(dāng)歸、薄荷、三棱、茯苓均細(xì)粉直接入藥，超聲提取難以使待測(cè)成分提取完全，故采用加熱回流的提取方式對(duì)樣品進(jìn)行處理。參考相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)比考察了不同提取溶劑(70%乙醇[10，13]、水[7]、75%甲醇[8-9]、甲醇[11，14-16])對(duì)待測(cè)成分柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、延胡索乙素、去氫紫堇堿、紫堇堿綜合提取率的影響，結(jié)果70%乙醇為提取溶劑時(shí)，所測(cè)成分綜合提取率最佳。對(duì)提取時(shí)間不斷摸索，最終按照2.1.2項(xiàng)下方法對(duì)慢肝解郁膠囊進(jìn)行供試品溶液的制備。

本研究采用HPLC同時(shí)測(cè)定慢肝解郁膠囊中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、延胡索乙素、去氫紫堇堿、紫堇堿的含量，方法專屬性強(qiáng)、操作便捷、結(jié)果準(zhǔn)確，為更加全面地評(píng)價(jià)慢肝解郁膠囊內(nèi)在產(chǎn)品質(zhì)量提供了數(shù)據(jù)支持。