UPLC同時測定通迪膠囊中8個活性成分的含量△

薛堯，展冠軍，馬靜

南京市大廠醫(yī)院，江蘇 南京 210048

通迪膠囊由三七、紫金蓮、延胡索、七葉蓮、雞矢藤、細辛6味中藥制成，具有活血行氣、散瘀止痛之功效，臨床常用于頭痛、痛經(jīng)、肩頸痹痛、脘疼痛、胃痛、跌打疼痛、術后疼痛及癌癥疼痛等[1]。方中君藥三七為五加科植物三七Panaxnotoginseng(Burk.) F.H.Chen的干燥根和根莖，具有散瘀止血、消腫定痛之功效，主要含有皂苷類成分和多糖化合物，其中活性成分主要為三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1[2-3]；紫金蓮所含主要活性成分白花丹醌，其顯著的抗菌、抗病毒、抗凝血、抗生育、降血壓及祛痰等作用，對痤瘡和細菌感染引起的癤也有很好的治愈作用[4-5]；延胡索具有活血散瘀、理氣止痛之功效，其活性成分主要為生物堿類，典型代表化合物有去氫延胡索甲素、延胡索乙素等，是延胡索發(fā)揮鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜解痙主要藥理活性成分[6-7]；雞矢藤是一種常用民族民間藥，具有消食健胃、化痰止咳、清熱解毒及止痛的功效，環(huán)烯醚萜苷類成分雞矢藤苷甲酯是其主要生物活性成分，是其抗炎鎮(zhèn)痛作用的主要藥理活性成分[8-10]。通迪膠囊現(xiàn)行標準中對三七中人參皂苷Rb1等成分做了定量檢測規(guī)定，相關文獻也有采用高效液相色譜法(HPLC)檢測通迪膠囊中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、細辛脂素、白花丹醌等成分，但未見采用超高效液相色譜法(UPLC)測定通迪膠囊中多種活性成分的報道[11-14]。

本研究采用UPLC同時測定通迪膠囊中三七皂苷R1、白花丹醌、去氫延胡索甲素、人參皂苷 Rg1、人參皂苷Re、延胡索乙素、雞矢藤苷甲酯和人參皂苷 Rb18個活性成分含量，方法簡單實用、科學準確，能為系統(tǒng)客觀評價通迪膠囊質(zhì)量提供參考。

1 材料

ACQUITY UPLC M-Class型超高效液相色譜儀(美國Waters公司)；AE 224 型觸摸式彩屏電子分析天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)；HU 6150D型恒奧數(shù)控超聲波清洗器 (天津市恒奧科技發(fā)展有限公司)；LabTower EDI型超純水儀(美國賽默飛世爾公司)。

通迪膠囊市售，規(guī)格：0.45 g/粒，貴州景誠制藥有限公司生產(chǎn)，批號分別為180301、180510、180601、180605、180903、181012、181015、190305、190401、190402；去氫延胡索甲素對照品(批號：131220，純度：98.0%)購自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司；雞矢藤苷甲酯對照品(批號：27530-67-2，純度：98.0%)購自上海源葉生物科技有限公司；白花丹醌對照品(批號：P0640，純度：95.0%)購自上海純優(yōu)生物科技有限公司；白花丹醌對照品(批號：SLBG3436V，純度：98.0%)購自美國Sigma公司；對照品三七皂苷R1(批號：110745-201619，純度：5.0%)、人參皂苷Re(批號：110754-201827，純度：93.4%)、人參皂苷Rg1(批號：110703-201731，純度：93.6%)、人參皂苷Rb1(批號：110704-201726，純度：91.1%)、延胡索乙素(批號：110726-201718，純度：99.6%)均來源于中國食品藥品檢定研究院；甲醇和乙腈均為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18(150 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相為乙腈(A)-0.03%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(0～5 min，2%～10%A；5～8 min，10%～13%A；8～15 min，13%～16%A；15～20 min，16%～45%A；20～26 min，45%～50%A；26～33 min，50%～65%A；33～35 min，65%～2%A)；檢測波長：203 nm(0～6、13～18、26～35 min，檢測三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re及人參皂苷Rb1)、270 nm(6～13 min，檢測白花丹醌及去氫延胡索甲素)、280 nm(18～20 min，檢測延胡索乙素)、347 nm(20～26 min，檢測雞矢藤苷甲酯)；流速：0.3 mL·min-1；進樣量：2 μL；柱溫：30 ℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1混合對照品溶液 精密稱取三七皂苷R1、白花丹醌、去氫延胡索甲素、人參皂苷 Rg1、人參皂苷Re、延胡索乙素、雞矢藤苷甲酯和人參皂苷 Rb1對照品各適量，加85%甲醇制成三七皂苷R11.531 mg·mL-1、白花丹醌0.552 mg·mL-1、去氫延胡索甲素0.802 mg·mL-1、人參皂苷Rg11.006 mg·mL-1、人參皂苷Re 0.525 mg·mL-1、延胡索乙素1.036 mg·mL-1、雞矢藤苷甲酯0.248 mg·mL-1和人參皂苷Rb10.569 mg·mL-1的混合對照品儲備溶液。精密量取上清液1 mL，置10 mL量瓶中，加85%甲醇稀釋至刻度，混勻，濾過(0.22 μm)，取續(xù)濾液，即得混合對照品溶液。

2.2.2供試品溶液 取通迪膠囊內(nèi)容物適量，混合均勻，取細粉約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入85%甲醇35 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流2 h，放冷置室溫，再稱定質(zhì)量，用85%甲醇補足減失質(zhì)量，搖勻，濾過(0.22 μm)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

取混合對照品溶液和供試品溶液，按2.1項下色譜條件，精密吸取2 μL注入UPLC儀，記錄色譜圖，結果見圖1。結果，各目標化合物與前后雜質(zhì)峰分離完全(>1.5)，色譜峰對稱性良好(0.92～1.16)，理論塔板數(shù)均大于5500，表明該色譜系統(tǒng)適應本方法。

注：A.混合對照品溶液；B.供試品溶液；1.三七皂苷R1；2.白花丹醌；3.去氫延胡索甲素；4.人參皂苷Rg1；5.人參皂苷Re；6.延胡索乙素；7.雞矢藤苷甲酯；8.人參皂苷Rb1。圖1 對照品及通迪膠囊UPLC圖

2.4 線性關系考察

取2.2.1項下混合對照品儲備溶液，精密吸取0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0 mL，分別置于25 mL量瓶中，加85%甲醇稀釋至刻度，搖勻，得不同質(zhì)量濃度對照品混合溶液。按2.1項下色譜條件分別進行測定，記錄色譜圖，以質(zhì)量濃度(X)為橫坐標，各成分峰面積(Y)為縱坐標進行線性回歸，繪制標準曲線，求算回歸方程及r，結果見表1。取2.2.1項下混合對照品溶液，按成倍稀釋法，記錄當信噪比(S/N)=3及S/N=10時各成分質(zhì)量濃度，分別標記為該成分檢測限和定量限，結果見表1。

表1 通迪膠囊線性關系、檢測限及定量限考察結果

2.5 精密度試驗

取2.2.1項下混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件連續(xù)進樣6針，記錄色譜圖峰。結果三七皂苷R1、白花丹醌、去氫延胡索甲素、人參皂苷 Rg1、人參皂苷Re、延胡索乙素、雞矢藤苷甲酯和人參皂苷 Rb1峰面積的RSD分別0.3%、0.5%、0.4%、0.2%、0.3%、0.4%、0.6%、0.3% (n=6)，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一批通迪膠囊供試品(批號：180301)溶液，按2.1項下色譜條件，分別于配制后0、3、6、9、12、24、36、48 h進樣，結果三七皂苷R1、白花丹醌、去氫延胡索甲素、人參皂苷 Rg1、人參皂苷Re、延胡索乙素、雞矢藤苷甲酯、人參皂苷 Rb1峰面積的RSD分別為0.5%、0.8%、0.7%、0.4%、0.8%、1.1%、1.0%、0.6% (n=8)，表明48 h內(nèi)供試品溶液的穩(wěn)定性良好。

2.7 重復性試驗

取同一批通迪膠囊供試品(批號：180301)內(nèi)容物適量，混合均勻，按2.2.2項下方法，平行制備6份供試品溶液，按2.1項下色譜條件進行測定分析，記錄色譜圖峰面積，計算各成分含量RSD。結果三七皂苷R1、白花丹醌、去氫延胡索甲素、人參皂苷 Rg1、人參皂苷Re、延胡索乙素、雞矢藤苷甲酯、人參皂苷 Rb1含量RSD分別為0.4%、0.6%、0.4%、0.4%、0.7%、1.0%、0.8%、0.5%(n=6)，表明方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的通迪膠囊樣品(批號：180301)內(nèi)容物適量，平行6份，每份1.0 g，精密稱定，分別加入混合對照品儲備溶液1.7 mL，按2.2.2項下方法制備，按2.1項下色譜條件進行測定分析，記錄色譜峰，計算各成分的加樣回收率及RSD，結果見表2。

表2 通迪膠囊8個成分的加樣回收率試驗結果

2.9 樣品測定

取12批通迪膠囊樣品，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件測定，記錄色譜圖，按外標法求算三七皂苷R1、白花丹醌、去氫延胡索甲素、人參皂苷 Rg1、人參皂苷Re、延胡索乙素、雞矢藤苷甲酯、人參皂苷 Rb1的質(zhì)量分數(shù)，結果見表3。

表3 通迪膠囊中8個成分含量的結果(n=3) mg·g-1

3 討論

3.1 提取條件的優(yōu)化

本研究分別考察了不同提取介質(zhì)(80%乙醇、30%乙醇、30%甲醇、85%甲醇及甲醇)、不同提取方式(浸漬、超聲、加熱回流)、不同提取時間(30、60、120 min)對通迪膠囊中8個成分提取效果的影響，結果顯示，以85%甲醇為溶出介質(zhì)時，加熱回流2 h提取效果最佳。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

在波長選取時，筆者通過查閱相關文獻資料，在200～400 nm波長對各考察成分進行光譜掃描，發(fā)現(xiàn)各成分最大吸收峰位置存在差異，以單一波長很難實現(xiàn)8成分同時測定，最終實驗采用分段波長自動切換法開展，即203 nm(0～6、13～18、30～35 min，檢測三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re及人參皂苷Rb1)、270 nm(6～13 min，檢測白花丹醌及去氫延胡索甲素)、280 nm(18～20 min，檢測延胡索乙素)，347 nm(20～26 min，檢測雞矢藤苷甲酯)[14-16]。流動相選取時，分別考察甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液及乙腈-0.1%醋冰酸水溶液等流動相系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%磷酸水溶液系統(tǒng)最佳，在此條件下8個成分均有較好信號強度，且與前后雜質(zhì)峰分離度較好，為減少高濃度磷酸溶液損傷儀器，最終流動相定為乙腈-0.03%磷酸水溶液進行梯度洗脫。

本研究建立UPLC同時測定通迪膠囊中8個活性成分含量，通過對準確性及精密度等指標的考察，發(fā)現(xiàn)方法準確度高、重復性好、簡單實用，可用于通迪膠囊中三七皂苷R1、白花丹醌、去氫延胡索甲素、人參皂苷 Rg1、人參皂苷Re、延胡索乙素、雞矢藤苷甲酯、人參皂苷 Rb1含量的同時測定，為通迪膠囊質(zhì)量評價提供參考。