基于UPLC的疏風(fēng)解毒膠囊指紋圖譜及多成分含量測(cè)定

金蕾，張貴萍，王溫才

1.青島市市立醫(yī)院 藥劑科中心藥房，山東 青島 266000；2.青島市市立醫(yī)院 藥物臨床試驗(yàn)研究科，山東 青島 266000

疏風(fēng)解毒膠囊由虎杖、連翹、板藍(lán)根、柴胡、敗醬草、馬鞭草、蘆根、甘草8味中藥制成，具有疏風(fēng)清熱、解毒利咽的功效，用于急性上呼吸道感染屬風(fēng)熱證，癥見(jiàn)發(fā)熱、惡風(fēng)、咽痛、頭痛、鼻塞、流濁涕、咳嗽等[1]1784?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，疏風(fēng)解毒膠囊對(duì)細(xì)菌、病毒、真菌等具有廣泛的抑制作用[2]，臨床廣泛用于治療社區(qū)獲得性肺炎、手足口病、帶狀皰疹、慢性支氣管炎、上呼吸道感染、流感等各類疾病，且治療效果較為明顯[3]。方中虎杖利濕退黃、清熱解毒、散瘀止痛、止咳化痰，《中華人民共和國(guó)藥典》(以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》)2020年版含量測(cè)定指標(biāo)成分為大黃素和虎杖苷[1]217；連翹清熱解毒、消腫散結(jié)、疏散風(fēng)熱[4]，《中國(guó)藥典》2020年版含量測(cè)定指標(biāo)成分為連翹苷和連翹酯苷A[1]177；板藍(lán)根性寒，清熱解毒、涼血利咽[5]，《中國(guó)藥典》2020年版含量測(cè)定指標(biāo)成分為(R，S)-告依春[1]214；柴胡疏散退熱、疏肝解郁、升舉陽(yáng)氣，《中國(guó)藥典》2020年版含量測(cè)定指標(biāo)成分為柴胡皂苷a、柴胡皂苷d[1]293；馬鞭草活血散瘀、解毒、利水、退黃、截瘧，《中國(guó)藥典》2020年版含量測(cè)定指標(biāo)成分為熊果酸、齊墩果酸[1]53。疏風(fēng)解毒膠囊現(xiàn)收載于《中國(guó)藥典》2020年版，標(biāo)準(zhǔn)以連翹中連翹苷和虎杖中虎杖苷為質(zhì)量控制指標(biāo)成分[1]1784，目前，僅有對(duì)其單個(gè)或多成分含量測(cè)定的文獻(xiàn)報(bào)道[6-8]，未見(jiàn)其指紋圖譜的文獻(xiàn)報(bào)道。為了能全面反映疏風(fēng)解毒膠囊的質(zhì)量特性，本研究建立疏風(fēng)解毒膠囊超高效液相色譜法(UPLC)指紋圖譜，并同時(shí)測(cè)定 9個(gè)指標(biāo)成分的含量。

1 材料

1290型超高效液相色譜儀、二極管陣列檢測(cè)器(安捷倫科技有限公司)；DHG-9246A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；XS205DU型電子天平(d=0.01 mg，瑞士梅特勒公司)；FRQ-1006HTD型超聲波清洗機(jī)(杭州法蘭特超聲波科技有限公司)；Option-Q型純水機(jī)(ELGA公司)。

疏風(fēng)解毒膠囊均為同一生產(chǎn)廠家(市售)，12批樣品批號(hào)分別為1852144、1912411、1906521、1903624、1812142、2002141、2003512、1906321、0911225、2001423、2003214、2004711，編號(hào)分別為S1～S12，規(guī)格為0.52 g/粒。對(duì)照品(R，S)-告依春(批號(hào)：111753-201706，純度：100.0%)、連翹苷(批號(hào)：110821-201816，純度：95.1%)、連翹酯苷A(批號(hào)：11810-201707，純度：97.2%)、柴胡皂苷a(批號(hào)：110777-201711，純度：91.1%)、柴胡皂苷d(批號(hào)：110778-201711，純度：93.2%)、虎杖苷(批號(hào)：111575-201603，純度：87.3%)、大黃素(批號(hào)：110756-201913，純度：96.0%)、熊果酸(批號(hào)：110742-201823，純度：99.9%)、齊墩果酸(批號(hào)：110709-201808，純度：91.1%)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈(德國(guó)Merck公司，色譜純)；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent XDB-C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.05%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(0～5 min，10%A；5～15 min，10%～25%A；15～22 min，25%～30%A；22～33 min，30%～50%A；33～35 min，50%～10%A)；流速：0.3 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：0～8 min，220 nm[(R，S)-告依春]、8～13 min，310 nm(虎杖苷、連翹酯苷A)、13～35 min，220 nm(柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、連翹苷、大黃素、齊墩果酸、熊果酸)；柱溫：30.0 ℃；進(jìn)樣量：1.00 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1混合對(duì)照品溶液 分別取(R，S)-告依春、虎杖苷、連翹酯苷A、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、齊墩果酸、熊果酸、連翹苷、大黃素對(duì)照品各適量，精密稱定后加甲醇適量，超聲使溶解(功率：300 W，頻率：40 kHz)，配制成含(R，S)-告依春146.9 μg·mL-1、虎杖苷2 285.0 μg·mL-1、連翹酯苷A 684.0 μg·mL-1、柴胡皂苷a 667.0 μg·mL-1、柴胡皂苷d 660.3 μg·mL-1、連翹苷429.7 μg·mL-1、大黃素1 066.0 μg·mL-1、齊墩果酸298.1 μg·mL-1、熊果酸415.0 μg·mL-1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，置25 mL棕色量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即為混合對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液 取本品10粒內(nèi)容物混勻，研細(xì)，精密稱定2.0 g，置于具塞燒瓶中，加入75%甲醇50 mL，精密稱定后加熱回流 1 h，取出，放冷，用75%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.3 高效液相色譜法(HPLC)指紋圖譜的建立及方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1精密度試驗(yàn) 取樣品(S1)的供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜峰，10號(hào)峰為參照峰(柴胡皂苷a)，以各共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間的RSD為考察指標(biāo)，結(jié)果均小于2.0%。

2.3.2穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液(S1)，按2.1項(xiàng)下色譜條件，分別在 0、4、8、12、24、36 h進(jìn)樣，記錄色譜圖，以10號(hào)峰為參照峰(柴胡皂苷a)，以各共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間的RSD為考察指標(biāo)，結(jié)果均小于2.0%。

2.3.3重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品(S1)6份，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖中各待測(cè)組分的峰面積和保留時(shí)間，以10號(hào)峰為參照峰(柴胡皂苷a)，以各共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間的RSD為考察指標(biāo)，結(jié)果均小于2.0%。

2.3.4指紋圖譜的建立及相似度分析 取樣品(S1～S10)，依照2.2.2項(xiàng)下方法分別制備12批供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜數(shù)據(jù)，將12批樣品的色譜數(shù)據(jù)的DCF文件導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2012年版)，對(duì)12批樣品的 UPLC 圖譜進(jìn)行分析，生成疏風(fēng)解毒膠囊指紋圖譜，見(jiàn)圖1(A、B)。12批樣品與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度分別為0.987、0.979、0.965、0.959、0.976、0.981、0.990、0.953、0.978、0.989、0.964、0.971，其相似度均大于0.95，疏風(fēng)解毒膠囊同一廠家各批次間相似度良好，質(zhì)量相對(duì)一致。

注：A.指紋圖譜；B.對(duì)照指紋圖譜；C.混合對(duì)照品色譜圖；D.樣品色譜圖；4.(R，S)-告依春；5.虎杖苷；7.連翹酯苷A；10.柴胡皂苷a；13.柴胡皂苷d；17.連翹苷；19.大黃素；21.齊墩果酸；22.熊果酸。圖1 12批疏風(fēng)解毒膠囊UPLC圖

2.3.5共有峰指認(rèn) 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012年版)”對(duì)12批樣品的UPLC圖譜進(jìn)行分析，12批樣品共有22個(gè)共有峰，在22個(gè)共有峰中，通過(guò)與各對(duì)照品峰的紫外吸收光譜圖和保留時(shí)間比對(duì)，指認(rèn)出4號(hào)峰為(R，S)-告依春、5號(hào)峰為虎杖苷、7號(hào)峰為連翹酯苷A、10號(hào)峰為柴胡皂苷a、13號(hào)峰為柴胡皂苷d、17號(hào)峰為連翹苷、19號(hào)峰為大黃素、21號(hào)峰為齊墩果酸、22號(hào)峰為熊果酸。

2.4 多指標(biāo)成分的含量測(cè)定

2.4.1系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 按2.1項(xiàng)下色譜條件，分別精密吸取2.2項(xiàng)下溶液各1.00 μL進(jìn)樣，結(jié)果各待測(cè)成分色譜峰與其相鄰色譜峰分離度均符合要求(>1.5)，對(duì)稱因子為0.97～1.32，理論塔板數(shù)以(R，S)-告依春、虎杖苷、連翹酯苷A、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、連翹苷、大黃素、齊墩果酸、熊果酸峰計(jì)均在8900以上。色譜圖見(jiàn)圖1(C、D)。

2.4.2線性關(guān)系考察 分別精密吸取2.2.1項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，制備系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件，精密吸取上述系列混合對(duì)照品溶液各1.00 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 疏風(fēng)解毒膠囊各成分線性關(guān)系考察結(jié)果

2.4.3精密度試驗(yàn) 精密吸取2.2.1項(xiàng)下溶液1.00 μL，按2.1色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果表明，(R，S)-告依春、虎杖苷、連翹酯苷A、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、連翹苷、大黃素、齊墩果酸、熊果酸峰面積的RSD分別0.68%、0.93%、0.58%、1.0%、0.69%、0.32%、0.61%、0.78%、0.93%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.4.4穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品(S1)，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于制備后0、4、8、12、24、36 h按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。(R，S)-告依春、虎杖苷、連翹酯苷A、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、連翹苷、大黃素、齊墩果酸、熊果酸峰面積的RSD分別為1.2%、0.96%、1.0%、0.86%、1.1%、1.3%、0.92%、0.87%、0.95%(n=6)，表明在36 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性較好。

2.4.5重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品(S1)6份，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖中各待測(cè)組分的峰面積，計(jì)算得(R，S)-告依春、虎杖苷、連翹酯苷A、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、連翹苷、大黃素、齊墩果酸、熊果酸的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.442、6.891、2.023、2.114、1.970、1.310、3.258、1.604、1.987 mg·g-1，RSD分別0.95%、0.49%、0.87%、1.00%、1.10%、0.69%、0.93%、1.30%、0.97%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.6加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定已知含量的疏風(fēng)解毒膠囊(S1)細(xì)粉6份，每份約1.0 g，分別精密加入混合對(duì)照品儲(chǔ)備液3.0 mL，按2.2.2項(xiàng)下方法制備，按2.1項(xiàng)下色譜條件分析，記錄色譜圖中各待測(cè)組分的峰面積，計(jì)算各成分平均回收率及其RSD。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 疏風(fēng)解毒膠囊9個(gè)成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表2

2.4.7樣品測(cè)定 取疏風(fēng)解毒膠囊12批，按照2.2.2項(xiàng)下方法，平行制備3份，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄(R，S)-告依春、虎杖苷、連翹酯苷A、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、連翹苷、大黃素、齊墩果酸、熊果酸的峰面積，計(jì)算上述9個(gè)成分含量。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 疏風(fēng)解毒膠囊中9個(gè)成分含量測(cè)定結(jié)果(n=3) mg·g-1

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

本試驗(yàn)對(duì)不同廠家色譜柱、流動(dòng)相體系、檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行考察，選擇Agilent XDB-C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)、AQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)、LunaOmega C18色譜柱(50 mm×2.1mm，1.6 μm)對(duì)樣品進(jìn)行色譜分析，發(fā)現(xiàn)使用Agilent XDB-C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)分離色譜圖較好；考察甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸溶液等流動(dòng)相的色譜分離效果，結(jié)果以乙腈-0.05%為流動(dòng)相，色譜峰峰形尖銳，分離效果最佳，基線平穩(wěn)，保留時(shí)間適中；將(R，S)-告依春、虎杖苷、連翹酯苷A、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、連翹苷、大黃素、齊墩果酸、熊果酸的對(duì)照品溶液分別注入液相色譜儀，在200～400 nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果最大吸收波長(zhǎng)分別為 245 nm[(R，S)-告依春]、306 nm(虎杖苷)、330 nm(連翹酯苷A)、210 nm(柴胡皂苷a、柴胡皂苷d)、277 nm(連翹苷)、254 nm(大黃素)、210 nm(齊墩果酸、熊果酸)。根據(jù)各檢測(cè)成分紫外吸收的吸收峰特征，選擇不同時(shí)段220、310 nm 2波長(zhǎng)切換法進(jìn)行測(cè)定，峰形相對(duì)較好，包含色譜信息較多，因此，確定檢測(cè)波長(zhǎng)為220、310 nm。

3.2 提取方式的優(yōu)化

預(yù)實(shí)驗(yàn)比較了不同提取溶劑的提取效果，以不同體積分?jǐn)?shù)乙醇(100%、75%、30%)和水為提取溶劑時(shí)，色譜峰基線出現(xiàn)漂移現(xiàn)象，基線不平穩(wěn)；以甲醇(100%、75%、30%)為提取溶劑時(shí)，75%甲醇對(duì)各組分的提取效率較高。提取方法的考察，預(yù)實(shí)驗(yàn)比較了超聲提取法和加熱回流法對(duì)各組分提取效果的差異，結(jié)果加熱回流提取法對(duì)各組分的提取較充分，特別是虎杖苷、大黃素、齊墩果酸、熊果酸4個(gè)成分含量差別較明顯，為了使提取完全，故最終采用加熱回流作為提取法。

3.3 樣品測(cè)定結(jié)果分析

中成藥化學(xué)成分較復(fù)雜，其療效不是多個(gè)化學(xué)成分藥用作用的簡(jiǎn)單相加，指紋圖譜技術(shù)可對(duì)中藥制劑進(jìn)行整體性評(píng)價(jià)，對(duì)制劑質(zhì)量控制有針對(duì)性和合理性[9-12]。本研究采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2012年版)建立了該制劑指紋圖譜，12批樣品相似度均大于0.95，表明疏風(fēng)解毒膠囊的批間差異較小、質(zhì)量較穩(wěn)定。所生成指紋圖譜的共有模式有22個(gè)共有峰，其中指認(rèn)了(R，S)-告依春、虎杖苷、連翹酯苷A、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、齊墩果酸、熊果酸、連翹苷、大黃素9個(gè)共有峰。9個(gè)成分含量測(cè)定結(jié)果顯示，虎杖苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.314～6.058 mg·g-1，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定不得少于3.0 mg/粒(5.769 mg·g-1)，均符合規(guī)定；連翹苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.314～0.856 mg·g-1，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定不得少于0.20 mg/粒(0.384 mg·g-1)，均符合規(guī)定；(R，S)告依春質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.642～0.427 mg·g-1，柴胡皂苷a質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.424～1.857 mg·g-1，柴胡皂苷d質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.364～1.699 mg·g-1，連翹酯苷A質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.562～1.897 mg·g-1，大黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.629～2.965 mg·g-1，齊墩果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.047～1.179 mg·g-1，熊果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.689～1.286 mg·g-1，不同批次間各組分含量存在一定差異，考慮與不同生產(chǎn)時(shí)間各批次間原藥材質(zhì)量差異有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)建立了疏風(fēng)解毒膠囊UPLC指紋圖譜，并同時(shí)測(cè)定9個(gè)成分的含量，方法穩(wěn)定簡(jiǎn)單，能系統(tǒng)快速地評(píng)價(jià)疏風(fēng)解毒膠囊的藥品質(zhì)量，對(duì)全面控制疏風(fēng)解毒膠囊的質(zhì)量具有指導(dǎo)意義。