非洲豬瘟病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征

謝春芳 于瑞嵩 董世娟 陳冰清

摘? 要：非洲豬瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV）自發(fā)現(xiàn)以來，從非洲大陸傳播到歐洲、亞洲，中間短暫消失但不久又卷土重來，一直頑固地存在著，這是否與ASFV獨特的形態(tài)結(jié)構(gòu)有關(guān)系，值得我們進(jìn)一步探索研究。ASFV的結(jié)構(gòu)蛋白有50多個，其核心大DNA基因組由核殼、內(nèi)膜、衣殼和外包膜層層包裹，可以抵御外界環(huán)境的侵襲和傷害。了解ASFV的結(jié)構(gòu)形態(tài)及組裝機(jī)制，有助于深入解析ASFV的降解切入點，從而控制ASFV的復(fù)制，瓦解成熟的病毒粒子，讓ASFV徹底從豬群、傳播媒介中消失。

關(guān)鍵詞：非洲豬瘟病毒;大DNA病毒;形態(tài)結(jié)構(gòu)

中圖分類號：S855 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：C 文章編號：1001-0769（2021）02-0037-05

非洲豬瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV）是一種雙鏈大DNA病毒，目前是非洲豬瘟病毒科（Asfarviridae）唯一的成員。非洲豬瘟病毒粒子直徑為250 nm～? ?300 nm，基因組長度為170 kb～194 kb;細(xì)胞內(nèi)ASFV粒子直徑約200 nm，病毒基因組與核蛋白聚集成病毒核心，核心外包裹有蛋白核殼，核殼外包裹著脂質(zhì)內(nèi)膜，脂質(zhì)內(nèi)膜外是二十面體蛋白衣殼，最后通過出胞獲得病毒外膜，成為一個成熟完整的ASFV粒子[1-5]（圖1）。

ASFV在環(huán)境中非常穩(wěn)定，在4 ℃血液中可保存一年以上，在肉制品中可保存數(shù)周。ASFV可在蜱類和豬中高效復(fù)制，并在兩者之間循環(huán)傳播[6]。

ASFV通過脫殼侵入細(xì)胞，病毒脫殼需要酸性環(huán)境破壞病毒的外膜和蛋白衣殼。在細(xì)胞的內(nèi)泡小體內(nèi)，病毒的外膜和二十面體蛋白衣殼被破壞，暴露出病毒內(nèi)膜，病毒內(nèi)膜與細(xì)胞膜融合，病毒核質(zhì)得以進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，感染宿主細(xì)胞。ASFV感染細(xì)胞后，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)附近的“病毒工廠（Viral Factories，VFs）”中進(jìn)行復(fù)制[7]。

在早期核內(nèi)復(fù)制階段，ASFV會導(dǎo)致細(xì)胞核膜破裂并募集細(xì)胞S期特異性翻譯因子——真核翻譯起始因子4E/4G（eukaryotic translation Initiation Factor 4E/4G，eIF4E/4G）和真核翻譯起始因子4E-結(jié)合蛋白1（eukaryotic translation initiation factor 4E-Binding Protein 1，4E-BP1）到病毒工廠，以增強(qiáng)病毒復(fù)制能力，然后在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)進(jìn)行病毒DNA復(fù)制和包裝[8-10]。

1? 病毒核心

ASFV粒子基因組和核蛋白形成病毒核心部分，ASFV pA104R是組蛋白樣蛋白，屬于核蛋白，對染色體的扭曲、彎曲、折疊等拓?fù)湫揎棸l(fā)揮重要的結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)功能，以增加核穩(wěn)定性。在ASFV復(fù)制周期，pA104R與DNA的相互作用并結(jié)合非常重要。二苯乙烯衍生物（Stilbene Derivatives，SD）1和SD4能破壞pA104R與DNA的結(jié)合;pA104R的β鏈DNA結(jié)合區(qū)（DNA Binding Region，DBR）的堿基突變也會消除pA104R與DNA的結(jié)合，pA104R未與DNA結(jié)合的ASFV不會進(jìn)行病毒基因組的復(fù)制[11-16]。

病豬組織細(xì)胞中存在無病毒核心的ASFV粒子，說明ASFV粒子先完成病毒內(nèi)膜、衣殼的裝配，然后形成病毒核心基因組與核蛋白完成裝配[17-18]。

2? 核殼

核殼位于含DNA的核仁和內(nèi)膜之間，是一個類似基質(zhì)的結(jié)構(gòu)域，包裹著核心。ASFV核殼是一層30 nm厚的蛋白層，主要由多聚蛋白pp220和pp62的加工產(chǎn)物構(gòu)成。pp220和pp62的加工都依賴于主要衣殼蛋白p72的表達(dá)，pp62的加工還需要pp220前體的表達(dá)，pp220和pp62能夠相互作用形成核殼狀結(jié)構(gòu)，這幾乎占病毒總質(zhì)量的三分之一。多聚蛋白加工是一個成熟的過程，伴隨著核心組裝，多聚蛋白pp220和pp62被S273R基因編碼的半胱氨酸蛋白酶催化，通過共有基序Gly-Gly-X有序水解成蛋白，pp220水解產(chǎn)生p150、p37、p34和p14，pp62的主要水解產(chǎn)物是p35和p15。p150、p37、p34、p14、p35和p15形成ASFV粒子的幾個主要成分，構(gòu)成病毒核殼[19-23]。

3? 內(nèi)膜

ASFV內(nèi)膜從細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜衍生而來，依賴病毒p54，細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜是病毒內(nèi)膜的前體，內(nèi)膜凸面上逐漸形成二十面體衣殼，內(nèi)膜凹面上同時形成核殼[7]。

pE248R是ASFV內(nèi)膜上的跨膜肽，在病毒外膜和蛋白衣殼破壞后，pE248R與細(xì)胞膜融合，病毒核質(zhì)得以進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，感染宿主細(xì)胞[2]。

在幾種病毒感染中，脂質(zhì)是形成VFs的基礎(chǔ)，病毒利用膜接觸位點（Membrane Contact Sites，MCSs）確保脂質(zhì)轉(zhuǎn)移到VFs，MCSs具有提供能量轉(zhuǎn)移其他脂類的功能，如磷脂酰肌醇-4-磷酸（Phosphatidylinostol-4-Phosphate，PI4P）。PI4P在哺乳動物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（Endoplasmic Reticulum，ER）-高爾基體MCSs中由磷脂酰肌醇-4-磷酸-激酶Ⅳβ與一些同功酶如磷脂酰肌醇-4-激酶β（Phosphatidylinostol-4-Kinasesβ，PI4Kβ）或磷脂酰肌醇-4-激酶Ⅱβ（Phosphatidylinostol-4-KinasesⅡβ，PI4KⅡβ）局部產(chǎn)生。PI4P負(fù)責(zé)脂質(zhì)結(jié)合/轉(zhuǎn)移蛋白氧化淄醇蛋白（Oxysterol Binding Protein，OSBP）與高爾基體對接。MCSs中的駐留分子允許細(xì)胞器之間的非囊泡脂質(zhì)和離子交換，OSBP將膽固醇從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運到高爾基體，在高爾基體中聚集，然后再轉(zhuǎn)運PI4P。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中PI4P的水解為這一過程提供能量。一些研究表明，MCSs機(jī)制和PI4P依賴的固醇穿梭蛋白參與了病毒復(fù)制。病毒會招募一個宿主PI4P激酶在其復(fù)制細(xì)胞器中富集PI4P。在所有的情況下，PI4P脂質(zhì)都會促使OSBP進(jìn)入VFs，導(dǎo)致ER和VFs之間形成MCSs，在該MCSs中，膽固醇/PI4P交換驅(qū)動膽固醇在復(fù)制位點的積聚[24-26]。

ASFV pE199L是一種富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)多肽，定位于病毒的內(nèi)膜，具有細(xì)胞溶質(zhì)分子內(nèi)二硫鍵。pE248R是ASFV內(nèi)膜上的另一個跨膜肽，pE248R和pE199LR與細(xì)胞膜融合，病毒核質(zhì)得以進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，形成ASFV進(jìn)入細(xì)胞的一種融合機(jī)制，感染宿主細(xì)胞[7，27]。

p17是由三個連續(xù)α螺旋組成的蛇形結(jié)構(gòu)，p17與外衣殼蛋白p72結(jié)合，緊密連接ASFV病毒內(nèi)膜與外衣殼，穩(wěn)定病毒的外衣殼結(jié)構(gòu)與形成[28]。

4 衣殼

ASFV粒子呈二十面體結(jié)構(gòu)，由50多種衣殼蛋白組裝完成，二十面體結(jié)構(gòu)在被感染的巨噬細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)接近核附近微管組織中心（microtubule organization center）的VFs區(qū)域內(nèi)組裝形成。p72是主要的結(jié)構(gòu)蛋白，屬病毒晚期表達(dá)的蛋白，完成一個病毒粒子的衣殼裝配需要8 280多個p72，此外還需p17、M1249L、p49和H240R，其均為輔助蛋白[3，28]。

p72以同源三聚體連接，每個單體呈雙膠卷形態(tài)，使p72三聚體看起來像一個六聚體，稱為“偽六聚體”（pseudo-heameric capsomers），每一個卷含有8個反向平行的β鏈結(jié)構(gòu)，并有4個暴露在外的環(huán)D1E1、D2E2、F1G1和H1I1暴露域（Exposed Regions，ERs）。這些ERs與N-端結(jié)構(gòu)域（N-terminal Domain，NTD）決定了病毒不同型之間的特異性差異，這與許多病毒衣殼蛋白相似。輔助蛋白p17是一種非常重要且非常豐富的蛋白，是內(nèi)膜蛋白也是衣殼蛋白，是病毒衣殼組裝和二十面體形成必需的蛋白。p17的胞外域與p72的殘基結(jié)構(gòu)域緊密結(jié)合，將p72帽狀體牢固地錨定在內(nèi)膜上。5個penton蛋白組成一個五聚體，骨架蛋白M1249L黏附到五聚體核心，將帽狀體連接在一起，不僅形成了一個五邊體，而且連接了兩個相鄰的五邊體形成骨架，使五聚體核心與p17可以在內(nèi)膜上移動，并與其他衣殼蛋白形成廣泛的分子間網(wǎng)絡(luò)，從而推動衣殼框架的形成。M1249L長? 100 nm，作為衣殼對稱三邊體的邊連接2個對稱的五邊體，衣殼蛋白p49（B438L）是形成衣殼頂點所必需的。p49是一種完整的膜蛋白，它不參與病毒粒子從病毒組裝點到質(zhì)膜的運輸。p72三聚體、penton五聚體在p17、p49與M1249L的作用下形成衣殼的對稱三邊體和五邊體，20個對稱三邊體和12個對稱五邊體構(gòu)成了病毒的外衣殼[3，28-33]。

H240R有240個殘基，富含β鏈，不同于p72，但與p72同源，具體結(jié)構(gòu)還不清楚;在外衣殼的內(nèi)膜面，還有許許多多未知的小衣殼蛋白[3，28，33]。

衣殼組裝依賴于衣殼蛋白p72和p49（B438L）的表達(dá)以及病毒伴侶蛋白B602L的表達(dá)。靜電力在病毒衣殼的組裝過程中起著重要的作用，引導(dǎo)著衣殼小體在合適的距離和方向上相互作用，維持穩(wěn)定的組裝。組裝外衣殼蛋白的ASFV粒子直徑約200 nm[34]。

5? 外包膜

ASFV粒子在細(xì)胞質(zhì)的VFs中沒有外包膜，只形成四層結(jié)構(gòu)，即病毒核心、核殼、內(nèi)膜和衣殼。VFs中形成的ASFV粒子在出芽時通過細(xì)胞質(zhì)膜獲得病毒外膜，從而成為一個成熟的病毒，其直徑為250 nm～300 nm。當(dāng)ASFV粒子移動到酸性環(huán)境時，病毒通過質(zhì)膜發(fā)芽獲得的外膜就消失了[2，3，35-36]。

6? 小結(jié)

非洲豬瘟從發(fā)現(xiàn)至今已有近100年的歷史，給養(yǎng)豬業(yè)及人類社會的公共環(huán)境帶來了非常嚴(yán)重的危害，對ASFV的研究越深入，根除ASF的目標(biāo)就越近，通過各種電鏡和分析技術(shù)，我們正在逐漸剝開ASFV包裹著的一層又一層膜和蛋白，相信無ASFV的這一天一定會到來。

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