真菌鑒別和檢測(cè)的SERS光譜技術(shù)研究進(jìn)展

李 玲， 何薪宇， 李世芳， 葛 闖， 徐 溢,4*

1. 重慶大學(xué)新型微納米器件與系統(tǒng)技術(shù)重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室&光電技術(shù)與系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 重慶 400044 2. 重慶大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院， 重慶 400030 3. 重慶大學(xué)腫瘤醫(yī)院， 癌癥轉(zhuǎn)移和個(gè)體化治療轉(zhuǎn)化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 重慶 400030 4. 重慶大學(xué)光電工程學(xué)院， 重慶 400044

引 言

真菌(fungus; eumycetes)是具有細(xì)胞核和細(xì)胞壁的異養(yǎng)生物， 是生物界中很大的類群， 通常分為酵母菌、 霉菌和蕈菌(大型真菌)三大類， 世界上已被描述的真菌屬達(dá)1萬(wàn)以上， 種超過(guò)10萬(wàn)個(gè)。 在多數(shù)真菌的細(xì)胞壁中最具特征性的是甲殼質(zhì)(chitin)， 其次是纖維素。 常見(jiàn)的真菌細(xì)胞器有： 線粒體， 微體， 核糖體， 液泡， 溶酶體， 泡囊， 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)， 微管， 鞭毛等， 常見(jiàn)的內(nèi)含物還有肝糖， 晶體， 脂體等。 近年來(lái)， 隨著廣譜抗生素、 糖皮質(zhì)激素、 免疫抑制劑的廣泛使用， 以及各種介入性醫(yī)療技術(shù)的使用， 臨床上真菌感染的數(shù)量及種類逐年增加， 已成為醫(yī)院內(nèi)感染的主要原因之一。 例如， 臨床分析發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)醫(yī)院臨床真菌感染的源頭是念珠菌， 其中白色念珠菌占全部感染的60%左右， 導(dǎo)致死亡率接近40%[1]， 這種感染甚至能引起器官移植患者、 癌癥患者和艾滋病患者的死亡。 因此， 高效辨識(shí)和監(jiān)測(cè)真菌的方法和技術(shù)備受關(guān)注。

傳統(tǒng)的真菌檢測(cè)方法是培養(yǎng)與鏡檢， 培養(yǎng)是真菌學(xué)檢查的“金標(biāo)準(zhǔn)”， 但其具有耗時(shí)長(zhǎng)、 易污染、 靈敏度低、 無(wú)法區(qū)分定植菌及感染菌等缺點(diǎn)[2]； 直接鏡檢更簡(jiǎn)便、 快速， 但其準(zhǔn)確率普遍不高， 難以為真菌早期診斷提供準(zhǔn)確判斷。 近年來(lái)， 分子生物學(xué)檢測(cè)法是目前國(guó)內(nèi)外研究發(fā)展熱點(diǎn)， 具有特異性強(qiáng)、 靈敏度高的特點(diǎn)[3]， 具體包括： 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法、 G試驗(yàn)法和GM試驗(yàn)法(galactomannan, GM test)等, 但這類方法成本較高， 操作復(fù)雜且未標(biāo)準(zhǔn)化， 臨床上易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。 隨著現(xiàn)代儀器科學(xué)與技術(shù)的發(fā)展， 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)[4]和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification, LAM)等技術(shù)開(kāi)始應(yīng)用于真菌鑒定和檢測(cè)， 但其對(duì)于檢驗(yàn)人員要求較高， 涉及的實(shí)驗(yàn)儀器也比較昂貴， 在臨床快速診斷中的應(yīng)用受到限制。 因此， 研發(fā)并建立真菌快速、 高效的檢測(cè)方法、 技術(shù)和系統(tǒng)具有重要的研究意義和迫切的應(yīng)用需求。 基于前期研究和調(diào)研， 我們發(fā)現(xiàn)拉曼(Raman)光譜尤其是表面增強(qiáng)拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering, SERS)光譜分析技術(shù)在真菌鑒別和檢測(cè)領(lǐng)域大有可為。

據(jù)此， 本文以臨床診斷和環(huán)境空間中真菌為檢測(cè)對(duì)象， 重點(diǎn)對(duì)Raman/SERS在真菌鑒別和檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行探討， 尤其針對(duì)納米SERS增強(qiáng)介質(zhì)材料、 SERS標(biāo)簽(SERS tag)信號(hào)放大效應(yīng)以及集成SERS的微流控芯片分析方法等研究新進(jìn)展進(jìn)行綜述， 分析探討Raman /SERS應(yīng)用于真菌檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)及其發(fā)展趨勢(shì)。

1 Raman/SERS光譜分析及其真菌檢測(cè)可行性分析

Raman光譜分析技術(shù)因其具有能提供分子基團(tuán)結(jié)構(gòu)信息、 無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行前處理、 無(wú)水分干擾、 易于實(shí)現(xiàn)原位實(shí)時(shí)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)， 特別適用于生物樣本及生化體系的檢測(cè)。 早在1995年， Edwards等[5]報(bào)道了利用拉曼光譜技術(shù)對(duì)三種不同屬的真菌樣本進(jìn)行檢測(cè)， 并對(duì)拉曼譜峰進(jìn)行了歸屬指認(rèn)。 10年后， Gussem等[6]確認(rèn)收集到的拉曼信號(hào)主要來(lái)源于真菌細(xì)胞壁上的多糖、 幾丁質(zhì)和支鏈淀粉以及細(xì)胞膜上的脂質(zhì)和磷脂。 但是， 由于Raman光譜是基于散射光信號(hào)建立的光譜分析技術(shù)， 散射信號(hào)強(qiáng)度弱且重現(xiàn)性較差， 大大限制了其在復(fù)雜生命體中的應(yīng)用。

隨著材料學(xué)、 光學(xué)、 儀器科學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域的迅猛發(fā)展， 通過(guò)引入納米技術(shù)而建立的SERS光譜分析技術(shù)， 利用粗糙的金屬表面等離子體， 在納米級(jí)間隙(通常是1 nm)的區(qū)域內(nèi)產(chǎn)生熱點(diǎn)， 極大地增強(qiáng)待測(cè)物分子的Raman信號(hào)， 可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的更高效檢測(cè)。 基于SERS光譜分析理論研究的不斷深入， 人們發(fā)現(xiàn)其除具備Raman光譜分析所具有的基本特性外， 更在檢測(cè)靈敏度、 抗光漂白、 易于實(shí)現(xiàn)原位無(wú)損檢測(cè)等方面顯示出強(qiáng)大優(yōu)勢(shì)。 據(jù)此， SERS光譜分析技術(shù)被廣泛用于多種生化樣本的檢測(cè)， 如： 磷脂、 葡萄糖、 谷胱甘肽、 凝血酶等[7]， 近年來(lái)更是被拓展到了細(xì)菌和細(xì)胞等生命體中[8]， 也使得真菌的高效SERS檢測(cè)和臨床診斷成為可能。 本課題組前期已開(kāi)展了將SERS光譜技術(shù)應(yīng)用于生物分子、 細(xì)菌和細(xì)胞及其相關(guān)生化過(guò)程研究[9-11]。 Gussem[6]等應(yīng)用Raman光譜分析乳桿菌(Lactarius)的真菌孢子， 解析其組成成分， 將得到的真菌光譜與已知存在于大型真菌中的參考物質(zhì)的拉曼光譜進(jìn)行比較， 包括糖類， 脂質(zhì)和一些可用作特異性生物標(biāo)記物(腺嘌呤， 麥角甾醇和甘氨酸)的次要化合物。

與傳統(tǒng)生化小分子Raman/SERS檢測(cè)大量的文獻(xiàn)報(bào)道相比， 以真菌為樣本的SERS檢測(cè)研究報(bào)道相對(duì)較少。 這是由于對(duì)于真菌這種真核細(xì)胞生命體， 其成分復(fù)雜且本身具有一定的不均一性， 檢測(cè)特性與細(xì)菌和細(xì)胞的檢測(cè)有一定的相似性， 面臨檢測(cè)靈敏度低、 信號(hào)復(fù)雜、 選擇性和特異性差以及信號(hào)重現(xiàn)性和穩(wěn)定性不佳等難題。 盡管如此， 當(dāng)針對(duì)真菌SERS檢測(cè)中的這些難點(diǎn)有所突破時(shí)， 就有理由相信SERS對(duì)真菌的檢測(cè)和相關(guān)研究是可行的， 并具有極大地發(fā)展?jié)摿Α?/p>

2 基于多種納米微結(jié)構(gòu)SERS基底的真菌鑒別

SERS的增強(qiáng)模式主要有電磁場(chǎng)增強(qiáng)以及化學(xué)增強(qiáng)[12]， 其是依托金屬、 半導(dǎo)體及多種復(fù)合納米微結(jié)構(gòu)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 這些活性納米基底的結(jié)構(gòu)和效能對(duì)于提高SERS檢測(cè)靈敏度、 重復(fù)性尤為重要。 最常應(yīng)用于SERS檢測(cè)的是金納米粒子(Au NPs)和銀納米粒子(Ag NPs)， 通過(guò)更改金屬納米粒子的形貌， 制備成納米棒[13]、 納米簇[14]、 納米星[15]等， 可形成熱點(diǎn)效應(yīng)， 顯著增強(qiáng)待測(cè)物Raman信號(hào)。 采用單一金屬納米材料其增強(qiáng)效能往往也不能達(dá)到測(cè)試的需求， 于是， 過(guò)渡金屬、 TiO2、 CuO、 ZnO等半導(dǎo)體材料以及復(fù)合納米材料進(jìn)入人們視線[16]， 目前， 多種復(fù)合納米結(jié)構(gòu)更是顯示出優(yōu)異的SERS效能， 如殼核納米顆粒結(jié)構(gòu)、 二維Au納米傘結(jié)構(gòu)、 多面體Ag顆粒和原子層沉積納米顆粒等， 更有金屬納米顆粒與磁性半導(dǎo)體材料、 有機(jī)聚合物等多種納米材料復(fù)合[17]， 這些新型的納米微結(jié)構(gòu)具有更好的生物兼容性、 更強(qiáng)的吸附能力和更強(qiáng)的增強(qiáng)效果， 可實(shí)現(xiàn)更高效的SERS檢測(cè)[18]。 近年來(lái)， 隨著納米材料及其制備技術(shù)的迅猛發(fā)展， 結(jié)構(gòu)有序可控的SERS基底納米微結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)與制備日趨成熟， 許多合成制備技術(shù)， 微機(jī)電系統(tǒng)(MEMS, Micro-Electro-Mechanical System)加工工藝等能夠用于制備具有良好重復(fù)性能的SERS基底[19]， 如化學(xué)還原法、 磁控濺射、 電子束光刻技術(shù)和自組裝等。

基于多種類型的納米微結(jié)構(gòu)SERS基底的發(fā)展和應(yīng)用， 近年來(lái)人們開(kāi)始將SERS光譜技術(shù)應(yīng)用于病毒、 真菌、 細(xì)菌和細(xì)胞及其相關(guān)生化過(guò)程的監(jiān)測(cè)和研究。 Sivanesan等[20]在粗糙化的納米銀基板上通過(guò)恒電位電沉積薄金層， 獲得銀-金雙金屬?gòu)?fù)合SERS基底， 涂覆抗生素后， 從血液樣本中選擇性鑒定出大腸桿菌、 腸炎鏈球菌和表皮葡萄球菌。 Luo等[21]通過(guò)疏水相互作用將油溶性Ag NPs與多孔碳膜自組裝獲得SERS基底， 結(jié)合主成分分析(principal component analysis, PCA)， 有效區(qū)分了豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、 豬細(xì)小病毒(PPV)和豬偽狂犬病病毒(PRV)。 Witkowska等[22]以納米Ag作為SERS增強(qiáng)基底， 測(cè)得這三種不同屬真菌： 毛癬菌， 小孢子菌和表皮癬菌的SERS光譜， 利用主成分分析， 實(shí)現(xiàn)了對(duì)常見(jiàn)皮膚真菌毛癬菌不同亞種的有效鑒別， 使同屬不同亞種真菌的鑒別成為可能。 Dina等[23]采用化學(xué)還原法合成Ag NPs， 輔以主成分分析法及線性判別法(principal component analysis-linear discriminant analysis, PCA-LDA)， 成功用SERS技術(shù)對(duì)煙曲霉、 隱孢曲霉和粉狀根霉三種真菌進(jìn)行了鑒別(圖1)， 整個(gè)過(guò)程耗時(shí)僅5分鐘， 大大縮短了侵襲性真菌感染的確診時(shí)間。 Prusinkiewicz等[24]通過(guò)Au NPs與構(gòu)巢曲霉共孵育后， 采用SERS光譜對(duì)真菌細(xì)胞內(nèi)外進(jìn)行檢測(cè)， 利用獲取的SERS圖譜還開(kāi)展了真菌細(xì)胞環(huán)境分析。 Tripathi等[25]通過(guò)拉曼光譜對(duì)水懸浮液中不同濃度的大腸桿菌和枯草芽孢桿菌孢子的混合物進(jìn)行研究和區(qū)分。 王科兵等[26]基于納米銀膠建立了SERS法快速判別失活白色念珠菌的方法， 白色念珠菌滅活后的SERS光譜與失活前的光譜有明顯差異。

圖1 煙曲霉、 隱孢曲霉和粉狀根霉三種真菌的SERS光譜及主成分分析中PC1和PC2得分[23]

可以看到， 融合納米技術(shù)的SERS光譜檢測(cè)技術(shù)在真菌類菌種的鑒別以及臨床疾病的快速診斷方面顯示出非常好的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景。 但目前SERS在真菌檢測(cè)中的研究和應(yīng)用相對(duì)較少， 其面臨檢測(cè)靈敏度不高、 信號(hào)穩(wěn)定性不佳、 信號(hào)識(shí)別有難度等局限和不足。 研發(fā)更為高效的納米SERS基底和納米微結(jié)構(gòu)， 改進(jìn)檢測(cè)模式， 可以使SERS在真菌檢測(cè)中發(fā)揮更大的優(yōu)勢(shì)。

3 基于SERS tag信號(hào)放大機(jī)制的真菌高效定量檢測(cè)

將SERS技術(shù)應(yīng)用于真菌檢測(cè)時(shí)， 面臨的核心問(wèn)題就是靈敏度、 重現(xiàn)性和特異性。 真菌樣本自身的特性， 制約了SERS光譜對(duì)其進(jìn)行高效定量測(cè)試。 為了解決這個(gè)問(wèn)題， 人們提出采用SERS標(biāo)簽(SERS tag)的檢測(cè)策略和方法。 SERS tag的設(shè)計(jì)思想主要包括： SERS活性金屬納米粒子制備， SERS報(bào)告分子連接， 表面修飾， 探針?lè)肿?抗體、 適配體等)結(jié)合， 由此實(shí)現(xiàn)目標(biāo)組分的信號(hào)放大和高效檢測(cè)(圖2)[27]。 SERS tag由金屬納米基底材料與能夠提供特征性SERS指紋圖譜的信號(hào)分子組成， 目前常用的信號(hào)分子包括： 4-巰基苯甲酸(MBA)、 苯-4,4’-二硫醇(DBDT)、 內(nèi)消旋-四(4-羧基苯基)卟啉(TCPP)、 Ru(bpy)(三(2,2’-聯(lián)吡啶基)氯化釕(Ⅱ))、 羅丹明6G(R6G)、 孔雀石綠異硫氰酸酯(MGITC)等[28]。 近年來(lái)， 多種新型SERS tag被設(shè)計(jì)和制備出來(lái)， 成功應(yīng)用于生物分子、 病原菌、 細(xì)胞等的特異性檢測(cè)， 甚至被用于體內(nèi)組織或者器官的活體成像， 其在提高SERS檢測(cè)靈敏度的同時(shí)， 更是對(duì)特定樣本實(shí)現(xiàn)了高選擇性甚至是特異性檢測(cè)。

圖2 SERS tag用于生化檢測(cè)的設(shè)計(jì)思路[27]

Zhao等[29]制備了一種由AgNPs和5，5’-二硫雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)報(bào)告分子組成的SERS tag， 與磁性納米顆粒通過(guò)抗體抗原反應(yīng)進(jìn)行偶聯(lián)后， 用于未經(jīng)處理的全血樣本中基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的免疫檢測(cè)， 檢測(cè)限為1 pg·mL-1[圖3(A)]。 Bamrungsap等[30]采用層層組裝的方法在金銀納米棒(Au-Ag NRs)表面組裝了拉曼報(bào)告分子4-氨基硫酚和熒光標(biāo)記的適配子， 以此合成雙功能SERS tag， 可實(shí)現(xiàn)宮頸癌細(xì)胞上表達(dá)的人蛋白酪氨酸激酶-7(PTK-7)的特異性靶向與熒光成像。 Madiyar等[31]利用氧化鐵-金(IO-Au)核殼納米卵形顆粒(NOV)包被QSY21拉曼報(bào)告分子制成SERS tag， 并通過(guò)特異性免疫化學(xué)連接到大腸桿菌菌株DHα5上， SERS tag的拉曼信號(hào)增強(qiáng)效果與介電泳富集效果相結(jié)合， 捕獲時(shí)間僅為50 s， 檢測(cè)下限可達(dá)210 cfu·mL-1[圖3(B)]。

圖3 不同SERS tag的生化檢測(cè)策略示例[29, 31]

Mabbott等[32]以單鏈硫代DNA修飾的銀羥胺納米粒子作為SERS tag， 結(jié)合主成分分析法， 成功對(duì)白色念珠菌、 光滑念珠菌、 克魯斯念珠菌和煙曲霉進(jìn)行鑒別和歸類(圖4)。 Yuan等[33]利用抗菌肽(AMP)功能化磁性納米顆粒作為細(xì)菌分離探針， 4-巰基苯基硼酸(4-MPBA)修飾的鍍金銀氧化石墨烯(Au@Ag-GO)納米復(fù)合材料作為SERS tag， 分離并檢測(cè)了大腸桿菌、 金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌， 每種細(xì)菌的最低檢測(cè)濃度僅為10 cfu·mL-1。 Zhang等[34]利用萬(wàn)古霉素修飾Fe3O4@Au磁性納米顆粒， 開(kāi)展細(xì)菌的廣譜識(shí)別和高效富集， 使用適配體功能化的SERS tag， 對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的檢測(cè)限分別達(dá)到20和50 cells·mL-1。 Pang等[35]采用適配體-Fe3O4@Au磁性納米顆粒作為磁性底物和SERS激活底物， 基于金殼的雙SERS增強(qiáng)和適配體/萬(wàn)古霉素的雙重識(shí)別能力， 用于目標(biāo)細(xì)菌的富集和定量檢測(cè)， 可以在沒(méi)有其他非靶標(biāo)細(xì)菌干擾的情況下， 在50 min內(nèi)對(duì)金黃色葡萄球菌的檢測(cè)達(dá)到3 cells·mL-1的檢測(cè)限。 這些研究顯示， SERS tag所帶來(lái)的高特異性和高靈敏度在臨床應(yīng)用方面極具前景。

圖4 肉眼難以分辨的不同SERS tag與不同真菌結(jié)合后的SERS光譜(a)及利用PCA對(duì)不同的SERS譜圖進(jìn)行識(shí)別(b)[32]

為了進(jìn)一步提高SERS tag在檢測(cè)中的穩(wěn)定性， 人們發(fā)展并研制出核-殼納米粒子結(jié)構(gòu)的SERS tag。 He等[36]將拉曼信號(hào)分子3，3’-二乙基噻三碳菁碘(DTTC)嵌入共軛金銀納米殼， 對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)檢測(cè)靈敏度可降至300 cfu·mL-1。 Ye等[37]采用種子介導(dǎo)法和分步納米加工法， 制備了雙金屬雙殼體(Au@BDT@Au@BDT@Ag)， 極大提高了納米粒子的SERS性能， 并建立了新的表面增強(qiáng)拉曼散射的側(cè)向流動(dòng)免疫分析方法， 對(duì)人絨毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotrophin, hCG)的檢測(cè)限低至0.7 mIU·mL-1(0.077 ng·mL-1)。

另外， SERS tag在拉曼成像方面也顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。 Aberasturi等[38]設(shè)計(jì)并制備了不同的十二胺改性的聚異丁烯-α-馬來(lái)酸酐(PMA)包覆金納米星的SERS tag， 分別以不同的小分子芳香族硫醇作為報(bào)告分子， 來(lái)自五個(gè)不同細(xì)胞系的單個(gè)乳腺癌細(xì)胞可以在共同培養(yǎng)中被檢測(cè)、 區(qū)分和成像， 且細(xì)胞培養(yǎng)的SERS信號(hào)和圖像在24 h以上保持穩(wěn)定。 Bohndiek等[39]設(shè)計(jì)制備了4種修飾了不同報(bào)告分子的SERS tag， 經(jīng)裸鼠皮下注射后， 利用開(kāi)發(fā)的小動(dòng)物拉曼成像(small animal Raman imaging, SARI)儀， 可實(shí)現(xiàn)在較大區(qū)域(>6 cm2)上以高空間分辨率的快速成像， 如圖5所示， 觀測(cè)到SERS tag在裸鼠肝臟的蓄積， 實(shí)現(xiàn)了活體內(nèi)的器官成像。

圖5 活體SERS成像： 注射四種SERS tag (S420， S421， S440， S470)后小鼠肝臟的SERS成像圖[39]

1 hour after injection (left) and 2 hours after injection (right)

可以看到， 基于SERS tag設(shè)計(jì)與制備技術(shù)的快速發(fā)展， 新型SERS tag在滿足特異性檢測(cè)目標(biāo)分析物的同時(shí)， 可進(jìn)一步提高了檢測(cè)的靈敏度與重現(xiàn)性。 SERS tag在細(xì)胞和細(xì)菌檢測(cè)中顯示出成效， 也有少量針對(duì)真菌的研究， 而將SERS tag用于真菌的高效定量檢測(cè)必將受到關(guān)注和發(fā)展。

4 基于集成SERS的微流控芯片真菌高效檢測(cè)

微流控芯片分析技術(shù)不僅可將樣品預(yù)處理、 分離、 檢測(cè)等多個(gè)基本操作單元集成， 而且可與多種檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行結(jié)合， 實(shí)現(xiàn)生化樣本的高通量及高內(nèi)涵檢測(cè)， 在細(xì)菌、 真菌和細(xì)胞等研究中展現(xiàn)出突出的優(yōu)勢(shì)和潛力。 在微流控芯片上集成SERS分析模塊， 可將含真菌的生化樣本引入到微流控芯片的設(shè)定集成納米微結(jié)構(gòu)SERS檢測(cè)微區(qū)， 直接進(jìn)行原位檢測(cè)并獲取其生化信息， 為生化體系的高效檢測(cè)提供了新機(jī)遇和新途徑。

眾所周知， 細(xì)菌、 真菌和細(xì)胞類生化樣本在檢測(cè)中通常存在基底復(fù)雜、 背景信號(hào)高、 水分干擾極大、 樣本暴露于空氣而受到環(huán)境中各種因素的影響等難題， 而集成SERS 基底的微流控芯片系統(tǒng)及相應(yīng)的測(cè)試方法， 對(duì)上述難題的有效解決顯示出明顯的優(yōu)勢(shì)[40]。 首先， 由于拉曼激光斑點(diǎn)小， 能夠在微流控芯片的通道上直接聚焦測(cè)試； 微流控芯片通道內(nèi)反應(yīng)試劑較少， 符合拉曼靈敏度高的條件； 由于反應(yīng)試劑沒(méi)有直接接觸， 對(duì)反應(yīng)體系不造成干擾； 同時(shí)， 由于SERS光譜具有特征指紋性， 能夠?qū)Ψ磻?yīng)體系中的混合物進(jìn)行分析和識(shí)別。 因此， 集成SERS增強(qiáng)基底的微流控芯片(簡(jiǎn)稱： 微流控SERS芯片)可提供一個(gè)生化樣本高效測(cè)試環(huán)境空間， 有效提高檢測(cè)的靈敏度、 重復(fù)性和可靠性； 同時(shí)， 將納米技術(shù)與微流控技術(shù)融合， 將推動(dòng)微流控芯片的功能拓展， 在臨床診斷、 生物學(xué)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

Li等[41]研制的適體-表面增強(qiáng)拉曼散射(Aptamer-SERS)傳感芯片， 可以預(yù)先完成芯片功能化、 SERS標(biāo)簽制備、 適體互補(bǔ)DNA雜交等復(fù)雜操作， 成功實(shí)現(xiàn)了真菌毒素—黃曲霉毒素B1(AFB1)的檢測(cè)， 線性范圍為1 fg·mL-1～1 ng·mL-1， 檢出限可達(dá)0.4 fg·mL-1[圖6(a)]。 Wang[42]等設(shè)計(jì)的CD式樣微流控芯片， 通過(guò)使用具有徑向微流體通道的聚二甲基硅氧烷(PDMS)聚合物板將寡核苷酸探針線陣列“印刷”在玻璃芯片上， 通過(guò)在螺旋通道內(nèi)進(jìn)行樣品雜交， 實(shí)現(xiàn)對(duì)濃度低至3 ng·mL-1的真菌PCR產(chǎn)物的檢測(cè)。 楊寧等[43]根據(jù)微尺度下孢子富集動(dòng)力學(xué)特征設(shè)計(jì)了病害孢子高效富集微流控芯片， 結(jié)合光電檢測(cè)系統(tǒng)， 進(jìn)行了水稻的稻曲病菌孢子的檢測(cè)。 Wang等[44]通過(guò)在微流控SERS芯片[圖6(b)]上同時(shí)部署針對(duì)同一病原菌不同表位的3個(gè)不同SERS探針， 實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞水平上對(duì)病原菌的不同亞種特異性檢測(cè)。 Yang等[45]研制的便攜式帶正電荷的SERS芯片， 成功用于直接從培養(yǎng)基中捕獲并鑒定大腸桿菌CFT 073、 銅綠假單胞菌PAO1和奇異變形桿菌PRM1等三種泌尿系統(tǒng)病原菌。 本課題組Su等[11]設(shè)計(jì)了集成血液分離、 試劑混合、 SERS檢測(cè)一體化的微流控芯片， 在檢測(cè)區(qū)原位集成Ag膜-納米金SERS基底[圖6(c)]， 針對(duì)水中肌酐的檢出限低至4.42×10-3μmol·mL-1， 且可在2 min內(nèi)完成血液樣本中肌酐的測(cè)試。 Wang等[46]采用自組裝-化學(xué)鍍復(fù)合方法， 在微通道內(nèi)的TiO2納米管的孔口表面和內(nèi)壁上覆蓋Au@Ag納米顆粒作為SERS基底， 對(duì)R6G的檢測(cè)限低至10-10mol·L-1， 利用Au@Ag/TiO2納米管的光催化性能， 制備了一種新型可回收微流控SERS芯片， 可用作多種生化分子的高效SERS檢測(cè)器。

圖6 基于不同微流控SERS芯片的SERS檢測(cè)示例及得到的SERS光譜圖[41, 44, 11]

顯然， 將多種納米結(jié)構(gòu)在微流控芯片上集成制備是可行的， SERS光譜采集對(duì)試劑和樣本是非接觸式的， 對(duì)生化體系和過(guò)程不會(huì)造成干擾， 拉曼激光斑點(diǎn)小能夠在微流控芯片的通道上直接聚焦， 同時(shí)SERS光譜具有的指紋性能夠獲得更多的生化信息。 據(jù)此， 我們認(rèn)為結(jié)合微流控技術(shù)， 有望解決并突破目前SERS分析技術(shù)存在檢測(cè)效率低、 信號(hào)穩(wěn)定性差、 應(yīng)用范圍窄等瓶頸問(wèn)題， 對(duì)真菌檢測(cè)提供更高精度、 更可靠測(cè)試手段。

5 結(jié)論與展望

針對(duì)近年來(lái)真菌感染帶來(lái)的對(duì)真菌高效檢測(cè)的需求， SERS光譜分析以其信息量豐富、 無(wú)標(biāo)、 無(wú)損、 原位檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)， 在真菌的高效檢測(cè)與鑒別方面展示出良好的研究意義和應(yīng)用潛力。 真菌作為一種復(fù)雜的生命體， 在其SERS檢測(cè)中涉及到許多物質(zhì)、 能量以及信號(hào)的轉(zhuǎn)換， 其Raman/SERS效應(yīng)也相對(duì)復(fù)雜， 在該領(lǐng)域仍然存在一些問(wèn)題和挑戰(zhàn)。 提高檢測(cè)靈敏度、 重現(xiàn)性和選擇性是實(shí)現(xiàn)有效鑒別和測(cè)試的關(guān)鍵， 通過(guò)設(shè)計(jì)與制備結(jié)構(gòu)可控、 增強(qiáng)效果佳的SERS活性增強(qiáng)基底， 研制特異性識(shí)別真菌的SERS tag， 在提高檢測(cè)靈敏度和選擇性的同時(shí)， 借助微流控芯片自身優(yōu)勢(shì)， 改善SERS檢測(cè)的環(huán)境， 提升檢測(cè)的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性， 有望實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜樣本中真菌的快速鑒別與檢測(cè)。