殼寡糖對花椒干腐病菌的抑菌活性研究

高雨萌，費(fèi)昭雪，史健飛，阮釗，李培琴

(西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，西部森林生物災(zāi)害治理國家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100)

花椒Zanthoxylum bungeanum是蕓香科Rutaceae花椒屬落葉小喬木或灌木，原產(chǎn)于中國，為世界范圍內(nèi)主要的經(jīng)濟(jì)栽培植物。它以耐干旱、耐瘠薄、適應(yīng)性強(qiáng)、壽命長、分布廣、管理方便等優(yōu)勢，成為干旱、半干旱及丘陵地區(qū)發(fā)展農(nóng)村商品經(jīng)濟(jì)的重要經(jīng)濟(jì)樹種?；ń樊a(chǎn)業(yè)投資小、見效快、效益高，已成為農(nóng)民增收的重要途徑[1－2]。但是，花椒病害的發(fā)生嚴(yán)重制約了我國花椒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，尤其是花椒干腐病，該病又稱流膠病。早在20世紀(jì)80年代就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，花椒干腐病能引起中國北方多個花椒品種的樹干和枝條腐爛壞死，病害嚴(yán)重發(fā)生時，可造成整株花椒樹的死亡[3－4]。曹支敏 等[3]采用形態(tài)學(xué)方法將花椒干腐病菌鑒定為Fusarium sambucinum。周雪等通過對我國花椒主要栽培區(qū)的干腐病進(jìn)行系統(tǒng)的調(diào)查，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定了2種新病原菌Fusarium zanthoxyli和Fusarium continuum，且發(fā)現(xiàn)F.zanthoxyli是引起我國陜甘等花椒主產(chǎn)區(qū)干腐病的主要病原菌[5]。目前，對花椒干腐病的防治主要采用化學(xué)防治[6]。盡管化學(xué)農(nóng)藥在植物病害防治方面表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢，但是由于不合理使用帶來的環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留、有害生物抗藥性等問題也日益嚴(yán)重。近年來，隨著經(jīng)濟(jì)文化水平的不斷提高，為了保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和人畜安全，保護(hù)農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)及生態(tài)環(huán)境，開發(fā)綠色環(huán)保的生物農(nóng)藥顯得日趨重要。

殼寡糖(oligochitosan)是由β－1，4－糖苷鍵連接的2－氨基葡萄糖組成的聚合度為2～20的寡糖，也被稱為氨基寡糖素或幾丁寡糖，由殼聚糖降解而形成，是天然糖類物質(zhì)中唯一大量存在的堿性氨基多糖，水溶性好，易吸收[7]。近年來，殼寡糖作為生物農(nóng)藥在防病和抗病方面倍受重視。殼寡糖對不同植物病原真菌的抑菌活性已被廣泛研究，如抑制植物病原真菌的生長、降低其產(chǎn)孢能力、抑制其孢子萌發(fā)和減小孢子萌發(fā)形成的芽管長度，從而降低植物病害的病情指數(shù)[8－10]。此外，殼寡糖還能作為誘導(dǎo)劑，激發(fā)植物的防御反應(yīng)，如誘導(dǎo)植物抗病相關(guān)酶活性的增強(qiáng)，或提高植物體內(nèi)抗病相關(guān)物質(zhì)如酚類化合物的合成[11－12]。如趙小明 等[13]發(fā)現(xiàn)2%的氨基寡糖的300倍液對蘋果花葉病的田間防治效果可達(dá)93.85%；沈奕等[14]發(fā)現(xiàn)殼寡糖對煙草黑脛病的盆栽防治效果可達(dá)57.81%；蔡明[15]報道了3%的氨基寡糖素對冰葡萄霜霉病具有顯著的防治作用，防效可高達(dá)80%。李培琴等[16]研究殼寡糖對花椒干腐病菌F.sambucinum的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)殼寡糖對F.sambucinum的生長具有較強(qiáng)的體外抑制活性。目前尚不清楚殼寡糖對干腐病的主要病原菌F.zanthoxyli是否具有抑菌活性，對我國花椒主產(chǎn)區(qū)干腐病是否具有防治效果。因此，筆者測試殼寡糖對干腐病菌F.zanthoxyli的菌落生長和孢子萌發(fā)的影響，基于溫室盆栽和人工接種系統(tǒng)研究殼寡糖對花椒干腐病的盆栽防治效果，以期為殼寡糖在花椒干腐病防治中的開發(fā)利用及花椒病害的無公害防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 花椒干腐病菌Fusarium zanthoxyli由西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院森林病理實(shí)驗(yàn)室周雪博士提供，已進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定[5]，保存在－80℃超低溫冰箱中。取出后，接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基上進(jìn)行活化培養(yǎng)5～7 d，培養(yǎng)條件為(25±2)℃，暗培養(yǎng)；活化培養(yǎng)2～3次后的菌種作為供試病原菌。

1.1.2 供試植物 花椒品種為‘鳳縣大紅袍’，來源于國家林業(yè)和草原局花椒工程研究中心(鳳縣花椒試驗(yàn)示范站)，以營養(yǎng)土和蛭石(約5∶1)為基質(zhì)進(jìn)行盆栽種植。花椒植株均為2 a生盆栽苗，置于(25±1)℃，每天光照12 h的學(xué)校溫室內(nèi)培養(yǎng)。

1.1.3 供試試劑 殼寡糖(平均分子量3 000 Da，脫乙酰度為90%)，購買自青島博智匯力公司；PDA培養(yǎng)基干粉，購買自北京索萊寶科技有限公司；臺盼藍(lán)，購買自江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 殼寡糖對花椒干腐病菌菌落生長的影響采用菌落生長抑制法測定殼寡糖對花椒干腐病菌F.zanthoxyli生長的影響[17]。 用濾膜(0.45 μm孔徑)過濾除菌的方法配制1.0 mg/mL無菌的殼寡糖母液，然后用移液器吸取一定體積的殼寡糖母液加入約50℃尚未凝固的PDA培養(yǎng)基中，配制殼寡糖終質(zhì)量濃度分別為 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/mL的培養(yǎng)基，混勻，倒平板，待其凝固后備用。用無菌打孔器在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d的F.zanthoxyli菌落邊緣打孔，制備直徑5 mm菌餅，接種到含有不同質(zhì)量濃度殼寡糖的PDA培養(yǎng)基平板中央，每皿接種1個菌餅，以無菌水為對照，每個質(zhì)量濃度重復(fù)3次。25℃恒溫箱內(nèi)暗培養(yǎng)，分別于接種后4，8，12，16 d采用十字交叉法測量各處理菌落直徑，計算抑菌率。

抑菌率(%)＝(對照組菌落直徑－處理組菌落直徑)/(對照組菌落直徑－菌餅直徑)×100

1.2.2 殼寡糖對花椒干腐病菌孢子的致死作用分析

1.2.2.1 準(zhǔn)備病菌孢子懸浮液 用無菌打孔器在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的花椒干腐病病原菌菌落靠近邊緣打孔制備菌餅，用無菌牙簽將菌餅轉(zhuǎn)移至新制備的PDA培養(yǎng)基平板上，置于25℃恒溫箱內(nèi)暗培養(yǎng)7 d后，添加5 mL無菌水溶液，用無菌棉簽輕輕擦拭菌落表面制備孢子懸浮液。用移液器將孢子懸浮液轉(zhuǎn)移至無菌離心管內(nèi)，采用血球計數(shù)器在顯微鏡下檢測孢子懸浮液的濃度，調(diào)整孢子懸浮液的中濃度為105個/mL左右，備用。

1.2.2.2 殼寡糖與病菌孢子的共培養(yǎng) 準(zhǔn)備若干無菌離心管，分別加入500 μL濃度為105個/mL的孢子懸浮液，再向孢子懸浮液中加入10 μL系列質(zhì)量濃度梯度的殼寡糖溶液，分別配制終質(zhì)量濃度為0.1， 0.2， 0.3， 0.4， 0.5， 0.6， 0.7， 0.8， 0.9，1.0 mg/mL的殼寡糖溶液，以無菌水作為對照，每個處理3個重復(fù)。蓋上離心管蓋子，用封口膜再將離心管蓋子包裹，在25℃，250 r/min條件下共培養(yǎng)。

1.2.2.3 檢測病菌孢子存活情況 采用臺盼藍(lán)染色法分析經(jīng)殼寡糖處理后的花椒干腐病菌孢子的活力[18]。死亡孢子被臺盼藍(lán)染色為藍(lán)色，存活孢子不被臺盼藍(lán)染色。分別檢測共培養(yǎng)24 h和48 h的孢子致死率。取90 μL經(jīng)殼寡糖處理的孢子懸浮液于1.5 mL離心管中，加入4%臺盼藍(lán)染液10 μL，混勻，室溫下染色5～10 min，取孢子懸浮液制臨時玻片在顯微鏡下觀察，每個處理計數(shù)500個孢子，記錄其中被染為藍(lán)色的孢子數(shù)，每個處理重復(fù)5次。

致死率(%)＝(被染為藍(lán)色的孢子個數(shù)/500)×100

1.2.3 殼寡糖對F.zanthoxyli孢子萌發(fā)的影響殼寡糖培養(yǎng)基平板的配制同1.2.1。病菌孢子懸浮液的制備同1.2.2.1。取250 μL孢子懸浮液置于殼寡糖培養(yǎng)基平板表面，用無菌玻璃鏟均勻涂抹，封口，置于25℃暗培養(yǎng)。以無菌水為對照，處理和對照各設(shè)3個重復(fù)。培養(yǎng)24 h和48 h后，光學(xué)顯微鏡下觀察孢子和芽管的形態(tài)，統(tǒng)計孢子萌發(fā)率。每個培養(yǎng)皿隨機(jī)取5個視野，每視野萌發(fā)孢子占觀察總孢子的比例為萌發(fā)率。孢子初生芽管長度超過孢子體一半即視為萌發(fā)[19]。

1.2.4 殼寡糖對盆栽花椒苗干腐病的防治試驗(yàn)采用針刺接種法[5]。用無菌打孔器在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d的花椒干腐病病原菌菌落上制備直徑5 mm菌餅，作為接種菌源。選用2 a生健康花椒盆栽苗，在花椒莖稈上中下部位選取直徑約為5 mm的圓形接種位點(diǎn)3個，用無菌尖口鑷子在每個接種位點(diǎn)上制造8～10個微傷口，接種病菌菌餅，用5 cm×3 cm無菌脫脂棉塊包裹，用移液器滴加2 mL過濾除菌后的殼寡糖溶液在脫脂棉塊上。根據(jù)1.2.1、1.2.2和1.2.3的試驗(yàn)結(jié)果，殼寡糖溶液的質(zhì)量濃度設(shè)置為0.25 mg/mL和0.50 mg/mL，分別標(biāo)記為Ocs-0.25＋Fz和Ocs-0.50＋Fz；以滴加相同體積的無菌水處理為陰性對照，標(biāo)記為Fz；以刺傷不接種干腐病菌和無菌水處理作為空白對照，標(biāo)記為CK。進(jìn)一步用保鮮膜包裹纏繞脫脂棉以便保持傷口濕度，每處理10株花椒苗。接種花椒苗放置于25℃，每天光照12 h的植物溫室中培養(yǎng)，14 d后撕去保鮮膜和脫脂棉，分析各處理的干腐病病斑大小。病斑大小按橢圓計算病斑面積，通過病斑面積計算各處理對花椒干腐病的防治效果。

防治效果(%)＝(對照組病斑面積－處理組平均病斑面積)/對照組病斑面積×100

1.3 數(shù)據(jù)分析 采用SAS 8.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用最小顯著差異法(LSD)檢驗(yàn)各試驗(yàn)數(shù)據(jù)之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼寡糖對花椒干腐病菌菌落生長的影響 殼寡糖對花椒干腐病菌菌落的生長具有一定的抑制作用(圖1)。隨著殼寡糖質(zhì)量濃度的增加抑菌率增加，隨著培養(yǎng)時間的延長抑菌率呈現(xiàn)先增后降的趨勢(表1)。不同培養(yǎng)時間(除第4天)，質(zhì)量濃度為0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL 的殼寡糖溶液處理間抑菌率差異不顯著，均顯著高于0.2 mg/mL殼寡糖溶液處理(P<0.05)；可見殼寡糖使用的最適質(zhì)量濃度為0.4～0.6 mg/mL。5個質(zhì)量濃度的殼寡糖處理對病菌菌落的抑制率均在第8天達(dá)到最大；除0.2 mg/mL殼寡糖溶液處理外，其它處理的抑菌率均顯著高于其它3個時間點(diǎn)的抑菌率(P<0.05)，且在第12天時抑制率仍可達(dá)44%～50%，說明殼寡糖具有較長的持效時間。

圖1 花椒干腐病菌在殼寡糖處理第8天時的菌落Fig.1 Colony of Fusarium zanthoxyli on the 8 th day treated by oligochitosan

表1 殼寡糖對花椒干腐病菌菌落生長的抑制率Tab.1 Inhibitory rate of oligochitosan against the colony growth of Fusarium zanthoxyli

2.2 殼寡糖對花椒干腐病菌孢子的致死作用 殼寡糖處理花椒干腐病菌孢子24 h后經(jīng)顯微觀察發(fā)現(xiàn)，殼寡糖對花椒干腐病菌的孢子具有一定的致死作用，而且隨著殼寡糖質(zhì)量濃度的增加，致死作用增強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.8 mg/mL及以上，花椒干腐病孢子幾乎全被殺死(圖2)。

圖2 臺盼藍(lán)染色法顯微觀察殼寡糖處理24 h后的花椒干腐病菌孢子Fig.2 Microscopic observation of spores of F.zanthoxyli treated by oligochitosan for 24 hours using trypan blue staining

不同質(zhì)量濃度的殼寡糖溶液與花椒干腐病菌孢子共培養(yǎng)24 h和48 h的致死率見圖3。殼寡糖對花椒干腐病菌孢子的致死率隨殼寡糖質(zhì)量濃度的升高而增加。在24 h處理下，當(dāng)殼寡糖質(zhì)量濃度達(dá)到0.7 mg/mL時孢子死亡率達(dá)到100%；在48 h處理下，殼寡糖質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL時孢子死亡率就幾乎達(dá)到100%。

圖3 殼寡糖對花椒干腐病菌孢子的致死率Fig.3 Lethality rate of oligochitosan to spores of Fusarium zanthoxyli

2.3 殼寡糖對花椒干腐病菌孢子萌發(fā)的影響 花椒干腐病菌孢子在殼寡糖處理12 h后的萌發(fā)狀態(tài)見圖4。隨著殼寡糖質(zhì)量濃度的增加，干腐病菌孢子萌發(fā)數(shù)量減少，芽管變短。當(dāng)殼寡糖質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，F(xiàn).zanthoxyli的孢子幾乎不萌發(fā)；而CK處理的孢子幾乎全部萌發(fā)，且芽管很長。

圖4 殼寡糖處理后12 h花椒干腐病菌孢子萌發(fā)情況Fig.4 Spore germination of Fusarium zanthoxyli treated by oligochitosan for 12 h

F.zanthoxyli孢子在殼寡糖終質(zhì)量濃度分別為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/mL 的培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)12 h和24 h時，孢子萌發(fā)率隨殼寡糖質(zhì)量濃度的升高而降低，芽管生長長度顯著縮短(表2)。盡管質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的殼寡糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 h和24 h時，孢子萌發(fā)率均與對照差異不顯著(P>0.05)，但是其芽管的生長長度顯著低于對照(P<0.05)；隨著殼寡糖質(zhì)量濃度升高，花椒干腐病菌孢子萌發(fā)的芽管長度縮短更加顯著(表2)。

表2 殼寡糖對花椒干腐病菌孢子萌發(fā)的影響Tab.2 Effect of oligochitosan on spore germination of Fusarium zanthoxyli

2.4 殼寡糖對花椒盆栽苗干腐病的防治效果 刺傷不接種F.zanthoxyli(CK組)的花椒枝干上，只留有針刺留下的微傷口；刺傷接種F.zanthoxyli(Fz組)的花椒枝干上形成大型腐爛病斑，并伴隨著大量的流膠；刺傷接種F.zanthoxyli且經(jīng)殼寡糖處理(Ocs＋Fz組)的花椒枝干雖然也有病斑形成，但是病斑顯著小于Fz組，病斑下陷，稍有腐爛，稍有或沒有流膠(圖5)。Ocs-0.25＋Fz組和Ocs-0.50＋Fz組的病斑平均面積均顯著小于Fz組的病斑面積(表3)。分析殼寡糖對花椒干腐病的盆栽防治效果發(fā)現(xiàn)，0.25 mg/mL殼寡糖的防治效果顯著低于0.5 mg/mL殼寡糖的防治效果(P<0.05)。

圖5 不同處理下花椒干腐病的癥狀Fig.5 Symptoms of stem canker of Zanthoxylum bungeanum under different treatments

表3 殼寡糖對花椒盆栽苗干腐病的防治作用Tab.3 Control effect of oligochitosan on stem canker of Zanthoxylum bungeanum potted seedlings

3 結(jié)論與討論

殼寡糖對植物病害的防治作用機(jī)制之一是殼寡糖能直接抑制病原菌的生長。殼寡糖的抑菌功能已經(jīng)在多種植物病原菌中取得了深入的研究進(jìn)展，如Botrytis cinerea[10]、Phytophthora capsici[20]、Alternaria kikuchian[21]和Rhizopus stolonifer[22]等。植物病原真菌菌落生長速度能反映該病菌的繁殖擴(kuò)展能力，通過研究殼寡糖對花椒干腐病菌F.zanthoxyli在人工培養(yǎng)基上菌落生長的影響，發(fā)現(xiàn)殼寡糖能顯著地抑制花椒干腐病菌F.zanthoxyli菌落的生長，且隨著殼寡糖質(zhì)量濃度的增加抑菌活性增強(qiáng)，當(dāng)殼寡糖質(zhì)量濃度在0.4～1.0 mg/mL之間處理干腐病菌8 d，抑菌率可達(dá)66%～74%。植物病原真菌孢子在植物病害循環(huán)中是病害侵染的重要來源，開發(fā)能殺死植物病原真菌孢子的生物農(nóng)藥對控制植物病害具有重要的意義。本研究中，使用0.7 mg/mL的殼寡糖溶液與F.zanthoxyli孢子共培養(yǎng)24 h后，孢子死亡率可達(dá)100%，當(dāng)殼寡糖質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL，共培養(yǎng)48 h后孢子死亡率幾乎100%，殼寡糖對F.zanthoxyli孢子具有致死作用。植物病原真菌孢子萌發(fā)是病原侵染植物的重要環(huán)節(jié)，如果真菌孢子不能萌發(fā)，則會大大的降低植物病害的發(fā)生[23]。本試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)殼寡糖能顯著地降低F.zanthoxyli孢子的活力，抑制孢子的萌發(fā)及芽管的伸長。殼聚糖也具有一定的抑菌活性，但是由于其分子量較大、黏度高、不溶于水等特性，導(dǎo)致其生物活性低于殼寡糖[24]。殼寡糖分子量小、水溶性好、易降解，并能進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行調(diào)節(jié)，殼寡糖在植物病害防治中研究和應(yīng)用更為廣泛，用來防治植物病害是較好的選擇[25]。不同分子量的殼寡糖產(chǎn)生的抑菌作用會有差異，賈盼盼 等[17]發(fā)現(xiàn)分子量為3 000 Da的殼寡糖對杏采收后果實(shí)病原菌比分子量1 000 Da和5 000 Da的殼寡糖具有更強(qiáng)的抑菌作用。比較兩種不同分子量的殼寡糖對花椒干腐病菌F.sambucinum的抑菌活性發(fā)現(xiàn)，分子量3 000 Da的殼寡糖的生物活性較強(qiáng)[16]。本試驗(yàn)中，研究殼寡糖對花椒干腐病的主要病原菌F.zanthoxyli的抑菌活性及防病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)分子量為3 000 Da殼寡糖對花椒干腐病具有較好的防控效果。因此，在研發(fā)殼寡糖生物農(nóng)藥時，有必要篩選具有不同分子量的殼寡糖原材料。

殼寡糖分子鏈中存在羥基、氨基和少量N－乙酰氨基以及其他活性基團(tuán)，對金屬具有很好的配位作用。若選取特定分子量的殼寡糖與金屬離子絡(luò)合，制備的殼寡糖金屬復(fù)合物的抗菌活性功能會明顯增強(qiáng)，如殼寡糖－Ag＋納米粒子能顯著地抑制3種疫霉屬Phytophtora病原菌的生長和繁殖[26]；殼寡糖銅懸浮劑能有效地防治黃瓜細(xì)菌性角斑病[27]。這為深入研發(fā)防治花椒干腐病的殼寡糖生物制劑提供了很好的思路。

為了明確殼寡糖對花椒干腐病盆栽苗的防治效果，該研究基于人工接種系統(tǒng)以控制對照和處理的試驗(yàn)條件完全一致。殼寡糖的施用方式為將含有無菌殼寡糖溶液的脫脂棉包裹于接種位點(diǎn)，這種處理方式能增強(qiáng)殼寡糖對花椒干腐病菌的作用強(qiáng)度。若是開展田間試驗(yàn)防治花椒干腐病，由于干腐病發(fā)生在花椒的枝干上，常規(guī)的藥劑噴霧難以有效接觸病原菌，可以采用涂抹的施藥方式，相比常規(guī)的噴霧方式，這有助于藥劑更直接有效地接觸病原物，作用靶標(biāo)更精準(zhǔn)，更有利于抑制病原物的生長和侵入，從而控制病斑的擴(kuò)展[28]。使用純凈的殼寡糖更能有效研究殼寡糖在植物病害防治中的構(gòu)效關(guān)系，但是純品殼寡糖價格昂貴。雖然本研究中使用的殼寡糖為混合物，但是其對花椒干腐病的防治效果顯著，且價格低廉，這使田間大規(guī)模使用殼寡糖生物制劑防治花椒干腐病成為可能。