弓形蟲病診斷技術(shù)在基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用

歐陽(yáng)志良 黃添祥 溫 蕾

廣東省東莞市厚街鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心 廣東 東莞 523960

弓形蟲是一種細(xì)胞內(nèi)寄生蟲,主要生活在細(xì)胞內(nèi),并能隨著血液流動(dòng)向全身各處,所以可能威脅到全身各個(gè)器官系統(tǒng)。其生長(zhǎng)階段要求兩個(gè)宿主,中間宿主有魚、鳥、昆蟲等,十分廣泛,終宿主則是貓科動(dòng)物。因?yàn)檫@一點(diǎn),其可以在世界范圍內(nèi)流行,引發(fā)人獸共患病。如果感染的是孕婦,基本有一半的幾率可以垂直感染給胎兒,其余可能出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎、畸形等。如果是感染的寵物,可能導(dǎo)致懷孕寵物流產(chǎn)、死亡。在畜牧方面,本病也會(huì)帶來(lái)繁殖困難、大量死亡等情況。近年來(lái),伴隨著寵物飼養(yǎng)的流行,人類通過(guò)接觸寵物感染弓形蟲病的比例日益增加。因此,各相關(guān)實(shí)驗(yàn)室積極選擇快速有效的方法對(duì)本病進(jìn)行檢測(cè),并隨著感染頻率的增加,要求推廣更加靈敏高效的檢測(cè)手段。目前對(duì)本病的診斷方法有如下幾種：

1 染色試驗(yàn)(DT)

該方法曾專門用于本病病原檢測(cè),特異性、靈敏度和可重復(fù)性都比較強(qiáng)。但缺陷在于該方法必須使用活的、可感染的速殖子進(jìn)行檢測(cè),而這帶來(lái)極大的危險(xiǎn),所以只能在生物安全水平高的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。目前,這一技術(shù)得到改良,將弓形蟲蟲體用甲醛固定在玻片上作為抗原,孵育待測(cè)血清,之后使用特殊的添加物,可以在蟲體周圍展示出淡黃色,列為陽(yáng)性。這樣一來(lái)操作簡(jiǎn)單,快速,而且特異性強(qiáng),所以適用于進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)篩查。

2 凝集試驗(yàn)

該方法有直接凝集(DAT)、間接凝集(IHA)和間接熒光抗體試驗(yàn)(IFAT)三種。就該方法而言,操作簡(jiǎn)單、結(jié)果出的快,敏感性、特異性和重復(fù)性也都良好。以三種不同方式對(duì)比來(lái)講,陽(yáng)性反應(yīng)出現(xiàn)時(shí)間DAT比IHA快,所以更容易檢測(cè)出早期感染的IgG抗體。而IFAT在靈敏度和特異性方面更具優(yōu)勢(shì),但也有更高的成本,同時(shí)不適合存在類風(fēng)濕因子干擾的個(gè)體檢測(cè)。

3 免疫膠體金技術(shù)

該技術(shù)利用抗原抗體相結(jié)合的原理,用膠體金探針標(biāo)記相應(yīng)的抗原或抗體,進(jìn)而放大信號(hào),然后借助光鏡、目測(cè)、顯影等方法給出診斷結(jié)果。大體分為免疫金銀染色法、快速斑點(diǎn)免疫金滲濾法和膠體金免疫層析法(GICA)。其中GICA是近年來(lái)應(yīng)用普遍且發(fā)展迅速的新技術(shù)之一,將蛋白抗體、新型材料、層析技術(shù)和膠體金等相結(jié)合,表現(xiàn)出成本低,操作簡(jiǎn)單,試劑盒種類繁多,檢測(cè)對(duì)象范圍廣等優(yōu)勢(shì),所以多用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室開展現(xiàn)場(chǎng)篩查。

4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)

ELISA也是當(dāng)前應(yīng)用很廣泛的技術(shù),操作相對(duì)簡(jiǎn)便,結(jié)果準(zhǔn)確,僅次于PCR技術(shù)。對(duì)于本病的檢測(cè),有常規(guī)和間接ELISA法、葡萄球菌A蛋白ELISA(SPA-ELISA)、更高特異性的DOT(斑點(diǎn))-ELISA、親和素-生物素-ELISA和PCR-ELISA。其中PCR-ELISA的敏感性、特異性都較強(qiáng),也比較穩(wěn)定。其PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)標(biāo)記后與特異性探針雜交,再通過(guò)相關(guān)酶顯色反應(yīng),可通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值,判斷感染情況。該方法的檢測(cè)閾值是20fg左右的弓形蟲DNA,靈敏度很高,不易發(fā)生交叉反應(yīng),重復(fù)性好[1]。隨著分子生物學(xué)發(fā)展、熒光PCR技術(shù)的應(yīng)用推廣,對(duì)于本病的診斷在基層動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室有了更好的選擇。

5 熒光定量PCR技術(shù)

常規(guī)的PCR技術(shù),操作中容易造成污染、而且對(duì)弓形蟲感染者不同時(shí)期感染程度的量值變化情況無(wú)法掌握。該方法增加了熒光探針雜交,實(shí)現(xiàn)了DNA實(shí)時(shí)定量；在封閉狀態(tài)下進(jìn)行檢測(cè),它的特異性和準(zhǔn)確性都優(yōu)于其它技術(shù),不容易交叉污染,因此成為了當(dāng)今實(shí)驗(yàn)室弓形蟲診斷和研究非常重要的手段之一。2019年,李雙星等[2]基于新一代Taqman-MGB探針技術(shù),從該方法進(jìn)行延伸,給出可以實(shí)時(shí)檢測(cè)的技術(shù)形式,特異性和敏感性更強(qiáng),為本病的臨床病原檢測(cè)等方面提供技術(shù)支撐,為未來(lái)犬弓形蟲亞單位疫苗的效果評(píng)價(jià)也提供了理論基礎(chǔ)。由于分子生物學(xué)檢測(cè)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室要求高,且診斷試劑價(jià)格較貴,不適用于在基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室和動(dòng)物醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室推廣。

展望

近幾年通過(guò)大量的試驗(yàn)研究,在弓形蟲病診斷方面取得很大的進(jìn)展,這有助于本病防控工作的開展,良好控制了本病的擴(kuò)散。但對(duì)本病的診斷仍然存在以下問(wèn)題：現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的商品化試劑盒不多；單一診斷不準(zhǔn)或成本高；診斷的抗原或抗體純度不夠高、制備難、成本高；大多數(shù)精確的診斷技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)室要求高,用于實(shí)驗(yàn)室研究更合適,基層應(yīng)用仍然不廣?；趯?duì)解決這些問(wèn)題的考慮,在醫(yī)學(xué)技術(shù)和檢測(cè)技術(shù)逐步發(fā)展的背景下,積極建立綜合檢測(cè)系統(tǒng),用以彌補(bǔ)單一診斷方法的不足、更多的用于基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室和動(dòng)物醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室的推廣,是接下來(lái)值得探討的問(wèn)題。對(duì)此需要相關(guān)工作人員加強(qiáng)對(duì)本病免疫學(xué)診斷方法的研究和總結(jié),立足于當(dāng)前方法的缺陷和限制,進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化,提出更有效的檢測(cè)技術(shù)。