HPLC法測定福建金線蓮中水仙苷的含量

張嘉嘉，陳 濤，鮑 文，許 文，徐 偉，林 羽，張 勛

（福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州350122）

金線蓮為蘭科開唇蘭屬植物花葉開唇蘭［Anoectochilus roburghii（Wal1.）Lindl］的干燥 全草，主要分布在我國的福建、浙江、廣西、云南等地區(qū)，主要用于治療高血壓、糖尿病、心臟病、肺炎、急慢性肝炎、腎炎等疾?。?-2］。金線蓮主要成分為黃酮、金線蓮苷、多糖、核苷，其中黃酮類被認為是金線蓮的重要有效成分，具有抗癌、保肝、抗菌、降血糖、抗氧化等多種功效［3-5］?！陡＝ㄊ≈兴幉臉藴?006年版》［6］《福建省中藥飲片炮制規(guī)范2012年版》［7］和《安徽省中藥飲片炮制規(guī)范2005年版》［8］收載藥用金線蓮藥材及飲片，檢查項目包括水分、灰分、顯微鑒別和薄層鑒別，無含量測定項。已有文獻報道金線蓮中含有蘆丁、水仙苷、槲皮素、山柰酚、異鼠李素和異槲皮苷等6種黃酮［9］，其中水仙苷的含量最高，因此，本文以水仙苷為指標，建立高效液相色譜法（HPLC）測定福建金線蓮水仙苷的含量，考察方法耐用性和可靠性，以期為金線蓮質(zhì)量標準提升提供科學依據(jù)。

1 材 料

1.1 儀器 Agilent 1290高效液相色譜儀、G4212A 1290 DAD檢測器（美國安捷倫公司）；DF-15臺式連續(xù)投料粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）；AR-224CN電子天平、EX225DZH電子天平（奧豪斯儀器有限公司）；KQ-500DE型醫(yī)院數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；MILLI-Q Direct16一體化超純水機（美國Millipore公司）。

1.2 試藥 水仙苷（中國食品藥品檢定研究院，批號：111997-201501）；色譜乙腈（默克化工技術(shù)有限公司）；色譜甲酸（上海麥克林生化科技有限公司）；色譜甲醇（國藥集團化學試劑有限公司）；實驗用水皆為實驗室自制二次蒸餾水；金線蓮藥材30批（經(jīng)福建中醫(yī)藥大學藥學院黃澤豪副教授鑒別，均為金線蓮），詳細信息見表1。

表1 金線蓮樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應性 色譜柱：Uitimate?HPLC AQ-C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：乙腈-0.1%甲酸（20∶80）；流速：1.0mL／min；檢測波長：360 nm；柱溫：30℃；進樣量10μL。各峰與鄰峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按水仙苷計算應不低于6000。空白溶劑、對照品及樣品的色譜圖見圖1。

2.2 對照品溶液的制備 取水仙苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL中含水仙苷0.1 mg溶液，搖勻，置4℃冰箱中備用。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取本品粉末（過4號篩）0.5g，精密加入80%甲醇25mL，稱定重量，超聲提取20 min（功率為350W，頻率50 Hz），放冷，稱重，用80%甲醇補足減失重量，搖勻，靜置，濾過，即得。

圖1 空白溶劑、對照品及樣品色譜圖

2.4 線性關系 取對照品儲備液，逐級稀釋為7.494、10.71、15.29、21.85、31.21、44.59μg／mL的對照品溶液，進樣10μL，測定峰面積。以水仙苷的濃度（μg／mL）為橫坐標（X），以水仙苷色譜峰峰面積積分值（mAU）為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得水仙苷線性回歸方程：Y＝9.1401X－20.554，相關系數(shù)r＝0.9995，表明水仙苷在7.494～44.59μg／mL濃度范圍內(nèi)其濃度與峰面積呈良好的線性關系。

2.5 加樣回收率 精密稱取金線蓮樣品（20171202-2）0.5g，分別按對照品：藥材含量（1∶0.5，1∶1，1∶1.5）的比例加入一定量的對照品，平行制備3份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液。按“2.1”項下測定各成分的峰面積，計算水仙苷的回收率及其RSD。結(jié)果，加樣回收率為97.62%～103.90%，RSD＜3.0%，表明該方法回收率良好。

2.6 精密度實驗

2.6.1 精密度 精密稱取同一批金線蓮樣品（批號20171202-2）1份，1 d內(nèi)連續(xù)進樣6次測定日內(nèi)精密度，連續(xù)測定3 d，每天進樣3針測定日間精密度。日內(nèi)精密度RSD為0.7597%，日間精密度RSD為0.8703%，表明儀器精密度良好。

2.6.2 穩(wěn)定性實驗 取批號為20171202-2的金線蓮樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h按“2.1”項下測定水仙苷的峰面積，計算含量均值與RSD，RSD均小于3%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.3 重復性試驗 精密稱取同一批金線蓮樣品（批號20171202-2）6份，按“2.3”項下的方法制備供試品溶液，按“2.1”項下測定水仙苷的峰面積，RSD為0.688%，結(jié)果表明方法的重復性良好。

2.7 耐用性考察

2.7.1 改變分析儀器 取同一批金線蓮樣品（批號20171202-2），按“2.3”項下方法制備供試品溶液。按“2.1”項下色譜方法，以不同品牌的色譜儀：Agilent 1260（檢測器：1260DADVL）和Waters e2695（檢測器：Waters 2998）2種高效液相色譜系統(tǒng)進行進樣測定，RSD分別為0.7597%、0.6782%，表明本方法精密度良好，本色譜條件在一定色譜儀變動情況下耐用。

2.7.2 改變色譜柱 取同一批金線蓮樣品（批號20171202-2），按“2.3”項下方法制備供試品溶液。按“2.1”項下以不同品牌的色譜柱：月旭XB-C18、Agilent SB-C18、Waters HSS T3進樣測定，RSD分別為0.193%、0.461%、0.868%，表明本色譜條件在一定色譜柱變動情況下耐用。

2.7.3 改變流動相pH 取同一批金線蓮樣品（批號20171202-2），按“2.3”項下方法制備供試品溶液。在不同流動相甲酸體積分數(shù)（純水、0.10%、0.2%）下，按“2.1”項下測定水仙苷的含量，RSD分別為1.856%、0.193%、0.875%，表明本色譜條件在一定流動相pH值變動情況下耐用。

2.7.4 改變色譜流速 取同一批金線蓮樣品（批號20171202-2），按“2.3”項下方法制備供試品溶液。按“2.1”項下色譜條件以不同流速（0.25、0.30、0.35mL／min）進樣測定。結(jié)果水仙苷含量平均值為1.780mg／mL，RSD為0.15%，表明本色譜條件在一定流速變動情況下耐用。

2.7.5 改變柱溫 取同一批金線蓮樣品（批號20171202-2），按“2.3”項下方法制備供試品溶液。按“2.1”項下色譜條件以不同柱溫（25、30、35℃）進樣測定。結(jié)果水仙苷含量平均值為1.777mg／mL，RSD為0.39%，表明本色譜條件在一定柱溫變動情況下耐用。

2.8 含量測定 按“2.3”項下方法制備供試品溶液，依法測定各批次金線蓮樣品，計算金線蓮藥材中水仙苷的含量，結(jié)果見表2。

3 討論

本實驗先后考察了不同提取溶劑（60%、70%、80%、90%、100%甲醇和60%、70%、80%、90%、100%乙醇）、不同提取時間（15、20、30 min）、不同提取溫度（常溫、30℃、40℃、50℃）、不同提取溶劑用量（20、25、30、35、40、45mL），發(fā)現(xiàn)80%甲醇25mL超聲提取20 min水仙苷提取率最高。

表2 各批次金線蓮測定結(jié)果（n＝3）

本文建立一種簡便、實用的HPLC法分析金線蓮藥材水仙苷的含量。該方法專屬性和耐用性強，簡便可靠，可以為金線蓮質(zhì)量標準的提升研究提供參考依據(jù)。