法洛四聯(lián)癥與NOTCH1和JAG1基因3′非編碼區(qū)變異的相關(guān)性研究*

楊小芳，崔芬芬，李元敏，周文君，黨國(guó)琴，胡 源，路 寧

(蘭州大學(xué)第一醫(yī)院心血管外科，蘭州 730000)

法洛四聯(lián)癥(TOF) 是一種由于胚胎期心臟流出道發(fā)育異常所導(dǎo)致的一類典型的先天性心臟病(CHD)，是最常見的紫紺型CHD，人群中發(fā)病率占CHD的7%～10%。TOF 形成的主要因素是在胚胎時(shí)期心球與動(dòng)脈干分割不均勻?qū)е碌挠倚氖伊鞒龅廓M窄，若未行外科手術(shù)糾正，90%的患者會(huì)在幼年時(shí)期死亡[1]。有研究表明，TOF是一類由多基因控制的遺傳疾病，具有家族遺傳的傾向，其發(fā)病是遺傳和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果[2-3]。

NOTCH信號(hào)通路是CHD發(fā)病相關(guān)基因的研究重點(diǎn)，參與調(diào)控心臟發(fā)育的許多關(guān)鍵點(diǎn)，如調(diào)節(jié)心臟嵴細(xì)胞分化和遷移[4]，可導(dǎo)致CHD表現(xiàn)為流出道發(fā)育異常，而其分子機(jī)制和NOTCH信號(hào)通路相關(guān)基因突變有關(guān)。該通路中兩個(gè)重要基因NOTCH1和其配體家族的JAG1被發(fā)現(xiàn)在胚胎的右心室流出道表達(dá)，并且NOTCH1和JAG1基因表達(dá)異?？梢鹦氖伊鞒龅赖陌l(fā)育異常[5-6]。NOTCH1和JAG1 基因突變不僅與Alagille綜合征和Adams-Oliver綜合征的CHD相關(guān)，還與非綜合征型的CHD相關(guān)，此類患者通常存在心臟流出道及右心室病變[7-11]。所以，NOTCH1和JAG1基因功能突變和CHD有非常密切的關(guān)聯(lián)，兩個(gè)基因的表達(dá)調(diào)控，也被認(rèn)為可以用于臨床診斷和遺傳分析。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)NOTCH信號(hào)通路在心臟發(fā)育方面的研究主要集中其相關(guān)基因的編碼區(qū)，對(duì)于3′非編碼區(qū)(3′UTR)是否影響CHD的發(fā)生研究較少。本研究將進(jìn)一步探索NOTCH信號(hào)通路中NOTCH1 和JAG1 基因3′UTR 存在的變異，探索該區(qū)域變異在漢族與回族之間的分布，以及與TOF 發(fā)生的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年9月至2019年6月就診于本院的TOF患者，分別選取20 例漢族TOF患者及14例回族TOF患者為漢族與回族病例組。其中，漢族病例組：男11例，女9例，年齡1個(gè)月至14歲，平均(7.15±3.53)歲。回族病例組：男9例，女5例；年齡1個(gè)月至14歲，平均(7.14±4.87)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)征得倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和患者及其監(jiān)護(hù)人同意。(2)經(jīng)影像學(xué)手段(心臟超聲心動(dòng)圖檢查、心導(dǎo)管造影術(shù))確診為TOF。(3)無(wú)其他器官或系統(tǒng)畸形。另外分別選取本院的健康體檢者漢族、回族各20名作為漢族與回族對(duì)照組，其中，漢族對(duì)照組：男11例，女9例；年齡1～15歲，平均(7.85±4.23)歲?；刈鍖?duì)照組：男13例，女7例；年齡1～15歲，平均(7.00±3.84)歲。針對(duì)檢測(cè)出的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，χ2檢驗(yàn)分析得出其在對(duì)照兒童中的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡。

1.2 方法

1.2.1基因組DNA 提取

每位研究對(duì)象采集外周靜脈血3～5 mL，采用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，于-80 ℃冰箱保存?；蚪MDNA采用血液基因組抽提試劑盒(北京天根公司)，提取外周靜脈血中淋巴細(xì)胞的DNA，樣品經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)、測(cè)定水平后置于-20 ℃冰箱保存，用于下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2目的DNA片段PCR擴(kuò)增和測(cè)序

提取上述并定量檢測(cè)的DNA，稀釋至50 ng/μL，分別用NOTCH1和JAG1特異性引物(表1)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序分別為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 變性50 s、退火(NOTCH1 為55 ℃、JAG1為50 ℃)50 s、72 ℃ 延伸90 s，共 37個(gè)循環(huán)，再72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后，送由北京六合華大基因有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。應(yīng)用Chromas 2.21 軟件分析DNA測(cè)序結(jié)果的峰圖，并運(yùn)用NCBI Blast 軟件將測(cè)序結(jié)果與GenBank 中人NOTCH1和JAG1基因序列進(jìn)行比對(duì)，驗(yàn)證是否存在核苷酸變異。

表1 驗(yàn)證NOTCH1 和JAG1 基因3′UTR 區(qū)變異位點(diǎn)的引物

1.2.33′UTR功能預(yù)測(cè)

采用Targetscan、microRNA.org 和PicTar等3個(gè)在線軟件，預(yù)測(cè)NOTCH1或JAG1基因3′UTR區(qū)變異位點(diǎn)結(jié)合的可能miRNA。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 NOTCH1和JAG1基因3′UTR存在SNP位點(diǎn)

測(cè)序結(jié)果顯示，在病例組與對(duì)照組中，NOTCH1基因3′UTR存在3個(gè)SNP 位點(diǎn)：126A/G(rs3124591)、410C/T(rs187411222)與753C/G(rs148391832)。JAG1基因3′UTR存在6個(gè)SNP位點(diǎn)：402A/G(rs542746042)、486delT(rs3842434)、1132T/G(rs7828)、856-857insT(rs3840074)、1511-1512insT(rs571057258)與1020T/C(rs8708)，見圖1。

A、B：NOTCH1 3′UTR 區(qū)雜合突變c.*126 A/G 與c.*410 T/C；C：JAG1 3′UTR 區(qū)突變c.*486delT；D：JAG1 3′UTR區(qū)雜合突變c.*1020 T/C。

2.2 SNP位點(diǎn)在4組間等位基因和基因型的分布

NOTCH1 和JAG1 基因3′UTR 各SNP 位點(diǎn)基因型及等位基因在4 組間的分布，見表2、3。NOTCH1 基因3′UTR 區(qū)的3個(gè)SNP 位點(diǎn)rs3124591、rs187411222 和rs148391832，三者的等位基因頻數(shù)在4組對(duì)象之間有差異，但由于樣本量的問題，經(jīng)χ2檢驗(yàn)計(jì)算，三者的不同基因型及等位基因在4組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。JAG1 基因3′UTR 區(qū)的6個(gè)SNP 位點(diǎn)中存在同樣現(xiàn)象，6個(gè)SNP位點(diǎn)基因型頻數(shù)在組間存在明顯的不同，如rs8708位點(diǎn)，只有回族病例組中存在GG型，而其余3組中均未出現(xiàn)該基因型。經(jīng)χ2檢驗(yàn)計(jì)算有5個(gè)位點(diǎn)的不同基因型及等位基因在4組對(duì)象之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。位點(diǎn)rs542746042的基因型在4組對(duì)象間分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而其不同的等位基因在漢族對(duì)照組與漢族病例組之間分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 NOTCH1基因3′UTR區(qū)各SNP 位點(diǎn)基因型及等位基因在4組間的分布[n(%)]

續(xù)表2 NOTCH1基因3′UTR 區(qū)各SNP 位點(diǎn)基因型及等位基因在4組間的分布[n(%)]

2.3 JAG1基因3′UTR 區(qū)有意義的變異位點(diǎn)結(jié)合的miRNA

用TargetScan,PicTar和microRNA.org 軟件能預(yù)測(cè)與上文所述漢族對(duì)照組與漢族病例組組間分布有差異的SNP 位點(diǎn)(JAG1486del T)結(jié)合的miRNA。與該位點(diǎn)結(jié)合的miRNA有10種(hsa-miRNA-4753-3p、hsa-miRNA-130b-5p、hsa-miRNA-6818-3p;hsa-miRNA-6895-3p、hsa-miRNA-593-3p、hsa-miRNA-5699-3、hsa-miRNA-4421、hsa-miRNA-6514-3p、hsa-miRNA-6811-3p、hsa-miRNA-214-5p)，除能與變異位點(diǎn)直接結(jié)合的miRNA之外，還有一些miRNA能與變異位點(diǎn)周圍10 bp以內(nèi)的序列結(jié)合。這些miRNA與靶基因mRNA結(jié)合復(fù)合物的穩(wěn)定性可能會(huì)受到變異位點(diǎn)的影響，導(dǎo)致靶基因異常表達(dá)。

表3 JAG1基因3′UTR區(qū)各SNP位點(diǎn)基因型及等位基因在4組間的分布

3 討 論

NOTCH信號(hào)通路是一種在進(jìn)化上高度保守的信號(hào)通路，與心肌細(xì)胞分化、心室腔發(fā)育、房室間隔形成、瓣膜發(fā)育、流出道重塑及動(dòng)靜脈分化等過(guò)程的調(diào)控密切相關(guān)[12-15]。該通路共由4種受體(NOTCH 1～4)和5 種配體(JAG1 和JAG2、DLL1、DLL2、DLL3)組成[16]，其受體及配體編碼基因的表達(dá)異常，可能對(duì)CHD、風(fēng)濕性心臟病及冠心病的發(fā)生、發(fā)展具有重要影響[17-20]。該通路中的兩個(gè)重要基因，NOTCH1和JAG1通常被用于CHD的臨床檢測(cè)和遺傳規(guī)律分析。miRNA 是一類非編碼小RNA，目前發(fā)現(xiàn)約有30% 基因受miRNA的調(diào)控，其中包括與心臟發(fā)育密切相關(guān)的基因。近年來(lái)，3′UTR作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的位點(diǎn)也引起了人們的關(guān)注，其可作為調(diào)控基因表達(dá)的靶點(diǎn)[21]?；虻腢TR具有調(diào)控序列，miRNA通過(guò)與3′UTR結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用，因此，這一區(qū)域堿基突變有可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生[22-24]。所以本研究選取了位于NOTCH1和JAG1 基因3′UTR作為研究對(duì)象，試圖探索TOF患者在該兩個(gè)基因的3′UTR是否存在差異。

徐麗娟等[10]研究發(fā)現(xiàn)，NOTCH1基因3′UTR的1個(gè)新發(fā)突變、JAG1基因3′UTR的3個(gè)新發(fā)突變和2個(gè)SNP 位點(diǎn)，人群中的這些變異，提高了其所在區(qū)域和一些miRNA序列結(jié)合的可能性，最終導(dǎo)致靶基因的表達(dá)下調(diào)，可能與圓錐動(dòng)脈干畸形等疾病的發(fā)生相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，TOF患者NOTCH1基因3′UTR存在3個(gè)SNP位點(diǎn)的雜合突變，JAG1基因3′UTR存在6個(gè)SNP位點(diǎn)的雜合突變，雖然這些位點(diǎn)與TOF的關(guān)聯(lián)不明顯，但不能排除這些位點(diǎn)在TOF中發(fā)揮了一定的作用。但是由于地域限制本研究樣本量較少，僅篩查到JAG1基因 3′UTR 的rs542746042位點(diǎn)與TOF具有相關(guān)性，該位點(diǎn)突變尚未見相關(guān)報(bào)道。由此可見，靶基因上游UTR序列的突變，尤其是和種子序列互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)的變異，都會(huì)影響miRNA和UTR序列的結(jié)合，進(jìn)而影響靶基因的表達(dá)。因此，本研究發(fā)現(xiàn)的NOTCH1和JAG1 基因3′UTR突變可能和TOF的發(fā)生相關(guān)。

3′UTR的SNP位點(diǎn)突變可通過(guò)改變mRNA和miRNA之間的親和力，而達(dá)到導(dǎo)致某種疾病易感性增高的作用。應(yīng)用在線軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)分析后發(fā)現(xiàn)有10個(gè)可與JAG1基因 3′UTR rs542746042結(jié)合的miRNA。目前已發(fā)現(xiàn)且在人體中證明可影響心臟發(fā)育的miRNA有miRNA-10a、miRNA-19b、miRNA-22、miRNA-155、miRNA-487b、miRNA-2223p等[25]。因此，JAG1可通過(guò)與其相關(guān)的miRNA結(jié)合對(duì)心臟的發(fā)育產(chǎn)生不良影響，導(dǎo)致TOF的發(fā)生。截至目前，仍有大量的miRNA的功能未明確，雖然本研究發(fā)現(xiàn)的miRNA尚未有文獻(xiàn)證實(shí)其作用，但在未來(lái)的研究中可行進(jìn)一步的驗(yàn)證研究。

綜上所述，本研究對(duì)NOTCH1和JAG1基因3′UTR的變異位點(diǎn)與TOF的相關(guān)性進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)JAG1基因3′UTR 的一個(gè)突變位點(diǎn)與TOF的發(fā)生或患病易感性相關(guān)。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)了NOTCH1和JAG1基因3′UTR的多個(gè)變異位點(diǎn)，雖然尚未發(fā)現(xiàn)和TOF的相關(guān)性，但仍需進(jìn)一步的驗(yàn)證和論證，以為TOF的產(chǎn)前遺傳學(xué)咨詢、個(gè)體化診斷，以及治療提供遺傳基礎(chǔ)。