siRNA沉默EZH2對(duì)HL-60細(xì)胞遷移、增殖能力的影響及其機(jī)制*

朱秋花，潘學(xué)誼，曾文彬，周蘭蘭，關(guān)則兵

(廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液內(nèi)科，廣州 510080)

初診的急性髓系白血病(AML)患者中有30%～40%可伴有髓外浸潤(EMI)，EMI主要表現(xiàn)為淋巴結(jié)腫大、皮膚結(jié)節(jié)、齒齦增生、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的侵犯及肝脾腫大等[1]。急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)占成人AML的10%～15%，具有特殊的生物學(xué)和遺傳學(xué)特征。APL常起病較兇險(xiǎn)，有10%～20%的患者死于早期出血。EMI在APL中發(fā)生不少見，且研究顯示EMI與AML患者預(yù)后差相關(guān)[2]。作為多梳家族蛋白(PcG)中具有催化活性的亞基，果蠅zeste基因增強(qiáng)子的人類同源基因2(EZH2)是主要起組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的作用，通過甲基化修飾核小體組蛋白H3K27位點(diǎn)賴氨酸調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖及腫瘤的形成[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn)，EZH2在多種惡性實(shí)體腫瘤如腎癌、肺癌及甲狀腺癌遷移及預(yù)后差相關(guān)[5-7]，且有研究報(bào)道EZH2抑制劑在體外有抗白血病作用[8]。但是EZH2在白血病的作用及其參與EMI的機(jī)制研究較少。本課題前期研究證實(shí)人APL細(xì)胞系HL-60和Kasumi-1細(xì)胞均高表達(dá)EZH2，且已通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)在Kasumi-1 細(xì)胞株中EZH2促進(jìn)其細(xì)胞遷移、增殖，抑制其凋亡[9]。本研究旨在探究EZH2對(duì)HL-60細(xì)胞遷移、增殖能力的影響及可能的機(jī)制，以為APL的表觀遺傳學(xué)治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

55例初治AML患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞標(biāo)本來源于南方醫(yī)院血液科。HL-60細(xì)胞購自天津血液病研究所。細(xì)胞的培養(yǎng)基為含有10%新生牛血清(杭州四季青公司，中國)的RPIM-1640培養(yǎng)基(Hyclone,USA)，并添加100 U/L青霉素、100 μg/L 鏈霉素；在含有37 ℃、5% CO2飽和濕度條件進(jìn)行培養(yǎng)。RNA 提取試劑Trizol試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自中國TaRaRa公司。EZH2和β-actin基因引物均由上海英俊捷基公司設(shè)計(jì)并合成。核蛋白/胞漿蛋白試劑盒購自中國弗德生物公司，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)單抗、EZH2單抗、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)單抗、H3K27me3單抗、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)單抗、B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)單抗、GAPDH單抗均購自美國Cell Signaling Technology(CST)公司，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液購自中國DAKO公司。能夠敲除EHZ2的3種不同序列小干擾RNA(siRNA-1:AAC AGC TGC CTT AGC TTC A,siRNA-2:AAC AGC TCT AGA CAA CAA A,siRNA-3:GGA TAG AGA ATG TGG GTT T) 及對(duì)照組空病毒(NC：TTC TCC GAA CGT GTC ACG T)購自中國吉?jiǎng)P基因。

1.2 方法

1.2.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)方法檢測EZH2表達(dá)

qRT-PCR方法檢測AML患者骨髓EZH2 mRNA的表達(dá)水平，并分析其表達(dá)與臨床特征的關(guān)系。

1.2.2建立敲除EZH2的HL-60細(xì)胞株

6孔板接種對(duì)數(shù)生長期的HL-60細(xì)胞，使每個(gè)孔細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)，HL-60細(xì)胞分別用3種不同序列siRNA的慢病毒(分別為siRNA-1組、siRNA-2組、siRNA-3組)及空載體慢病毒(為NC組，而未轉(zhuǎn)染的HL-60則為wild組)轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)72 h后在熒光顯微鏡下拍照。隨后流式細(xì)胞術(shù)用來檢測細(xì)胞的綠色熒光蛋白(GFP)轉(zhuǎn)染率，并篩選出GFP陽性的細(xì)胞，用qRT-PCR及Western blot驗(yàn)證3個(gè)不同序列的siRNA敲除EZH2的效果并篩選出最佳序列記為siEZH2組，體外擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.3Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷徙能力

細(xì)胞的遷移能力用Transwell遷移小室實(shí)驗(yàn)來檢測，小室基底膜的孔徑為8 μm。HL-60的3個(gè)處理組細(xì)胞株(wild、NC和siEZH2組)，用磷酸緩沖鹽溶(PBS)分別洗滌細(xì)胞2次，RPIM-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞使細(xì)胞濃度為3×106個(gè)/L。分別取3×105個(gè)細(xì)胞接種到Transwell小室的上室。下室加入500 μL各自細(xì)胞所需含有血清的正常培養(yǎng)基，在含有37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)18 h后，對(duì)遷移到下室的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。同上處理各組細(xì)胞，培養(yǎng)時(shí)間為10 h。取出小室，用蘇木素對(duì)小室膜上細(xì)胞進(jìn)行染色，選擇相同位置的5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)并拍照。上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.4CCK8檢測細(xì)胞增殖活性

CCK8實(shí)驗(yàn)用來檢測細(xì)胞的增殖活性，將HL-60的wild、NC、siEZH2 3組對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板，調(diào)整每孔細(xì)胞數(shù)為1×104個(gè)，各組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。分別于0、24、48、72、96 h后加入CCK8試劑，培養(yǎng)3 h后在酶標(biāo)儀下測定各孔450 nm吸光度(A)值，以上試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡用細(xì)胞凋亡雙標(biāo)檢測試劑盒膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-APC/PI)檢測，用PBS液漂洗wild、NC、siEZH2 3組細(xì)胞，1×Binding Buffer漂洗細(xì)胞1次離心棄上清液，隨后用100 μL 1×Binding Buffer重懸3組細(xì)胞，加5 μL Annexin V-APC，室溫光孵育15 min。1×Binding Buffer漂洗細(xì)胞1次之后離心棄上清液，在200 μL 1×Binding Buffer重懸的3組細(xì)胞中加入5 μL PI；用流式細(xì)胞儀來檢測細(xì)胞凋亡。

1.2.6qRT-PCR及Western blot方法檢測相關(guān)基因及蛋白表達(dá)

采用qRT-PCR方法檢測相關(guān)基因表達(dá)，具體方法同本課題組前期研究[10-11]。Western blot方法用來測定相關(guān)蛋白，取HL-60的wild、NC、siEZH2 3組細(xì)胞提取蛋白，蛋白濃度用二喹啉甲酸(BCA)法檢測，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)之后轉(zhuǎn)膜，加入一抗在4 ℃冰箱孵育過夜，次日洗膜之后加入二抗孵育2 h。以GAPDH為內(nèi)參，化學(xué)發(fā)光顯色后拍照分析EZH2、組蛋白H3第27位賴氨酸上三甲基化(H3K27me3)、MMP-2及E-cadherin蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 AML患者EZH2表達(dá)水平與臨床特征的關(guān)系

55例AML患者EZH2表達(dá)與臨床特征的關(guān)系,在AML中高表達(dá)EZH2患者EMI發(fā)生率明顯升高(P<0.01)，見表1。

表1 AML患者EZH2表達(dá)與臨床特征關(guān)系

續(xù)表1 AML患者EZH2表達(dá)與臨床特征關(guān)系

2.2 各組細(xì)胞EZH2的表達(dá)水平比較

在HL-60細(xì)胞中轉(zhuǎn)染載有不同siRNA片段的慢病毒，培養(yǎng)72 h，熒光顯微鏡下拍照，見圖1。qRT-PCR及Western blot檢測EHZ2基因及蛋白表達(dá)均下調(diào)。siRNA-1組EZH2 mRNA(0.003 0±0.000 2)明顯低于siRNA-3組(0.004 3±0.000 1)和siRNA-2組(0.006 4±0.000 6)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。 其中以siRNA-1(序列AAC AGC TGC CTT AGC TTC A)下調(diào)HL-60細(xì)胞的EZH2最明顯，Western blot檢測結(jié)果與PCR結(jié)果一致，流式篩選siRNA-1組GFP陽性細(xì)胞體外擴(kuò)大培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),隨后檢測NC、siEZH2、wild 3組細(xì)胞EZH2的表達(dá)，qRT-PCR及Western blot結(jié)果均顯示，siEZH2組EZH2表達(dá)均明顯低于NC組及wild組(P<0.001)，見圖2。

A:siRNA-1組；B:siRNA-2組；C:siRNA-3組。

a：P<0.001,與wild組比較；bP<0.001，與siRNA-1組比較。

2.3 各組HL-60細(xì)胞增殖活性及凋亡率比較

CCK8實(shí)驗(yàn)提示在HL-60細(xì)胞中敲除EZH2后siEZH2組的增殖能力明顯下降(P<0.05)。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)siEZH2組細(xì)胞凋亡明顯增加(P<0.05)，見圖3。

a：P<0.05，與siEZH2組比較。

2.4 各組HL-60細(xì)胞敲除EZH2后細(xì)胞遷移能力比較

Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中siEZH2組的下室細(xì)胞比例[(4.50±0.26)%]明顯低于wild組[(9.05±0.30)%]和NC組[(9.03±0.27)%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；蘇木素染色后發(fā)現(xiàn)siEZH2組小室膜上細(xì)胞基數(shù)比wild組和NC組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)，見圖4。

a:P<0.001,與siEZH2組比較。

2.5 各組HL-60細(xì)胞敲除EZH2后H3K27me3和MMP-2蛋白水平比較

在HL-60細(xì)胞中敲除EZH2，H3K27me3和MMP-2蛋白均明顯下調(diào)(P<0.05)，而E-cadherin則上調(diào)(P<0.05)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)EZH2下調(diào)后抗凋亡蛋白Bcl-2亦下調(diào),而細(xì)胞凋亡途徑關(guān)鍵蛋白caspase-3上調(diào)，見圖5。

圖5 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討 論

EZH2作為PcG蛋白家族成員之一，在多種腫瘤中起原癌基因作用。EZH2參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖及腫瘤的形成[3],有研究顯示EHZ2與多種實(shí)體腫瘤遷移能力相關(guān)[5-7]。APL為白血病中一種特殊類型，EMI發(fā)生率較高，EMI中以中樞浸潤較常見，一旦發(fā)生中樞侵犯預(yù)后較差。目前國內(nèi)外有關(guān)APL與EZH2的關(guān)系及其EMI機(jī)制研究極少。本課題組前期研究已證實(shí)在AML細(xì)胞株HL-60及Kasumi-1存在EZH2高表達(dá)，且在Kassumi-1細(xì)胞中證實(shí)敲除EZH2細(xì)胞凋亡增加，增殖減慢，機(jī)制研究顯示EZH2通過調(diào)控E-cadherin蛋白及p-ERK/p-cmyc/MMP-2通路影響細(xì)胞遷移[9-10]。且TANAKA等[11]研究顯示，在HL-60細(xì)胞中下調(diào)EZH2可抑制其增殖。因此，本研究猜測EZH2與APL細(xì)胞增殖、凋亡及遷移相關(guān)。本研究旨在探究在HL-60中敲除EZH2對(duì)細(xì)胞的增殖、凋亡及遷移的影響及其可能的機(jī)制。

相對(duì)于實(shí)體腫瘤的遷移而言，在白血病中則表現(xiàn)為EMI，白血病一旦發(fā)生EMI則預(yù)后較差。MMPs、黏附分子、趨化因子及E-cadherin異常表達(dá)均可影響白血病細(xì)胞EMI。當(dāng)骨髓中白血病細(xì)胞表面的黏附因子表達(dá)異常時(shí)其黏附能力下降促使細(xì)胞趨化黏附于血管內(nèi)皮上，進(jìn)而分泌MMPs促使細(xì)胞外基質(zhì)降解，最終細(xì)胞遷移至骨髓外導(dǎo)致EMI[12-14]。相關(guān)研究表明，在AML中EMI的發(fā)生亦與MMPs表達(dá)增加密切相關(guān)[15-16]。EZH2可通過甲基化腎癌、口腔癌細(xì)胞核小體組蛋白下調(diào)E-cadherin表達(dá)從而增強(qiáng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力[5，17]。本研究結(jié)果顯示，在HL-60細(xì)胞中敲除EZH2后E-cadherin表達(dá)上調(diào)，MMP-2下調(diào)，細(xì)胞遷移能力減弱。因此，本研究認(rèn)為EZH2可能通過上調(diào)HL-60細(xì)胞的MMP-2降解細(xì)胞外基質(zhì)或通過下調(diào)E-cadherin來增強(qiáng)APL細(xì)胞遷移能力。

EZH2主要通過甲基化周期蛋白、抑癌基因等靶基因參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分化增殖及腫瘤的形成[4]。林璐慧等[18]研究發(fā)現(xiàn)，敲除EZH2后HL-60細(xì)胞中H3K27me3亦下調(diào)從而導(dǎo)致Bcl-2下調(diào)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bcl-2是一種癌基因，具有抑制凋亡的作用。有研究報(bào)道，在HL-60細(xì)胞存在Bcl-2過表達(dá)，抑制Bcl-2的表達(dá)能夠增加細(xì)胞凋亡關(guān)鍵基因caspase-3活性，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，敲除EZH2后HL-60細(xì)胞的增殖減弱、凋亡增加。本研究認(rèn)為，敲除EZH2后對(duì)組蛋白 H3K27的甲基化作用減弱，進(jìn)而其對(duì)靶基因抑制作用減弱，從而引起B(yǎng)cl-2下調(diào)及caspase-3上調(diào)。

綜上所述，EZH2可能通過上調(diào)Bcl-2及下調(diào)caspase-3促進(jìn)HL-60細(xì)胞增殖并抑制其凋亡。臨床中使用去甲基化藥物如地西他濱及阿扎胞苷治療白血病可能基于表觀遺傳學(xué)調(diào)控，這為將來使用EZH2抑制劑或其他類型去甲基化藥物治療白血病提供一定理論基礎(chǔ)，更深的機(jī)制研究仍需進(jìn)一步探究。在APL細(xì)胞株(HL-60)中敲除EZH2能有效抑制其增殖和遷移能力,并促進(jìn)其凋亡，且EZH2可能通過MMP-2及E-cadherin影響HL-60細(xì)胞的遷移能力,EZH2可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2及caspase-3影響HL-60細(xì)胞增殖凋亡，這將為APL表觀遺傳學(xué)治療提供新靶點(diǎn)。