小麥新品種濟麥70籽粒發(fā)育過程中細胞形態(tài)及內(nèi)源激素的動態(tài)變化分析

李永波，崔德周，黃琛，隋新霞，樊慶琦，楚秀生，2

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所／農(nóng)業(yè)部黃淮北部小麥生物學與遺傳育種重點實驗室／小麥玉米國家工程實驗室，山東 濟南 250100；2.山東師范大學生命科學學院，山東 濟南 250014）

小麥是全球最重要的糧食作物之一。小麥穎果由外向內(nèi)依次由外果皮、種皮、糊粉層和胚乳組成［1］。在小麥籽粒發(fā)育過程中，外層果皮和內(nèi)層胚乳細胞會發(fā)生程序性細胞死亡（PCD），表現(xiàn)為染色質凝集、核DNA降解以及核酸酶活性增加等［2］。籽粒的這種PCD是為蛋白質和淀粉合成提供場所以及為其它細胞提供能量供應［3，4］，其進程直接影響小麥灌漿、籽粒大小和品質。因此，研究小麥籽粒PCD及相關細胞形態(tài)的動態(tài)變化對培育高產(chǎn)優(yōu)質小麥新品種具有重要的理論指導意義。

植物PCD是內(nèi)部基因有序地調(diào)控組織細胞降解的過程，對維持機體的正常生長發(fā)育及適應外界環(huán)境因子的脅迫具有重要意義［5］。種子成熟過程中，PCD的發(fā)生受干旱［6］、澇害［7］、激素等多種環(huán)境因素的影響。干旱可以促進線粒體釋放細胞色素C，進而導致PCD［6］；澇害會引起胚乳細胞染色質凝聚、核退化、線粒體破裂等PCD特點［8］；花后高溫會加速小麥胚乳細胞的降解［9］；乙烯會加速小麥種子PCD，而ABA則延遲PCD［10］。小麥籽粒發(fā)育過程中會應對干旱、干熱風等各種復雜多變的環(huán)境，環(huán)境因子決定了籽粒PCD進程，因此研究小麥籽粒PCD的動態(tài)變化過程對適應外界環(huán)境脅迫、保證后期籽粒正常灌漿意義重大。

本研究以高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、抗倒、廣適小麥新品種濟麥70為材料，探究其籽粒發(fā)育過程中內(nèi)部細胞形態(tài)變化與PCD進程的對應關系及內(nèi)源激素ABA的動態(tài)變化，以期為進一步探究PCD調(diào)控小麥籽粒發(fā)育的分子機理奠定重要理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

小麥新品種濟麥70由山東省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所培育，于2020年通過山東省農(nóng)作物品種審定委員會審定，編號為魯審麥20200005，其主要特點是產(chǎn)量潛力高、高抗倒伏、抗病性好、廣適等。

1.2 番紅固綠染色

取開花后5、10、15、20、25 d具有代表性的小麥籽粒3粒進行石蠟切片。依次將切片放入二甲苯中20 min，無水乙醇中5 min，75%乙醇中5 min，然后用自來水清洗。清洗好的片子放入番紅染液中染色1～2 h，用自來水洗去多余的染料。接下來將切片依次放入50%、70%、80%梯度乙醇中各3～8 s，然后放入固綠染液中染色30～60 s，用無水乙醇進行脫水。最后，將切片置于二甲苯中透明5 min，然后用中性樹膠封片，用熒光顯微鏡（Axiocam，卡爾蔡司，Germany）進行拍照（放大100倍）。

1.3 DNA梯度檢測

取開花后5、10、15、20、25 d的小麥籽粒，用細胞凋亡-DNA Ladder抽提試劑盒（C30007，碧云天，上海）對籽粒中的DNA進行分離，具體操作詳見說明書。取1μg DNA上樣，用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.4 內(nèi)源性激素測定

利用植物激素的酶聯(lián)免疫吸附測定法，對小麥籽粒中的內(nèi)源激素進行測定，具體操作步驟詳見文獻［11］。

2 結果與分析

2.1 小麥籽粒內(nèi)部細胞形態(tài)動態(tài)變化與其PCD進程動態(tài)關系

對開花后5、10、15、20、25 d的小麥品種濟麥70籽粒進行番紅-甲基綠染色和DNA梯度檢測分析，結果顯示，開花后5 d，所有籽粒細胞呈橢圓形，扇狀排布，細胞沒有出現(xiàn)分化現(xiàn)象；開花后10 d，細胞出現(xiàn)明顯的分化現(xiàn)象，最內(nèi)部致密的胚乳細胞、包裹著胚乳的1～2層糊粉層細胞、單層種皮細胞以及最外面的多層果皮細胞等出現(xiàn)；開花后15 d，果皮細胞層數(shù)減少，胚乳細胞開始皺縮；開花后20、25 d，果皮只有單層細胞，而胚乳細胞出現(xiàn)破裂（圖1）。DNA梯度檢測結果顯示，只有到達開花后15 d時，DNA片段的斷裂現(xiàn)象才開始出現(xiàn)，表明在開花后15～25 d范圍內(nèi)，小麥籽粒細胞正在發(fā)生PCD（圖2）。綜上所述，小麥籽粒果皮細胞層數(shù)的減少及胚乳細胞的皺縮、破裂現(xiàn)象是一種PCD過程。

圖1 小麥籽粒內(nèi)部細胞形態(tài)結構（100×）

圖2 DNA梯度檢測

2.2 內(nèi)源植物激素的動態(tài)變化

對開花后不同時間點濟麥70籽粒內(nèi)源植物激素含量的分析結果（圖3）顯示，脫落酸（ABA）含量在開花后5～10 d呈現(xiàn)下降趨勢，10～25 d一直保持上升趨勢；生長素（IAA）含量在開花后5～10 d呈現(xiàn)上升趨勢，10～20 d下降，之后又上升；赤霉素（GA）含量在5～15 d呈現(xiàn)下降趨勢，15～20 d快速上升，20～25 d保持平穩(wěn)；而玉米素核苷（ZR）卻在5～25 d持續(xù)下降?？梢钥闯?，只有脫落酸含量的變化趨勢與籽粒PCD的發(fā)生時間比較吻合，因此推測，小麥籽粒發(fā)育后期脫落酸含量的增加，可能促進了小麥籽粒PCD的發(fā)生；但是籽粒發(fā)育期間所出現(xiàn)的細胞形態(tài)變化，可能是由多種內(nèi)源植物激素協(xié)同作用的結果。

圖3 花后5～25 d小麥籽粒內(nèi)源植物激素含量變化

3 討論與結論

小麥作為重要的糧食作物，其籽粒灌漿與產(chǎn)量和品質息息相關。小麥籽粒早期發(fā)育過程中會出現(xiàn)細胞數(shù)目增加、細胞分化、PCD以及內(nèi)源植物激素變化等現(xiàn)象，進而為后期灌漿做準備［12-14］。本研究發(fā)現(xiàn)，ABA在小麥籽粒早期發(fā)育過程中持續(xù)增加，而前人研究表明ABA是影響籽粒胚乳PCD的關鍵因子，可通過影響乙烯合成途徑影響胚乳PCD［15］，因此，推測籽粒早期的PCD現(xiàn)象可能受ABA調(diào)控。

小麥穎果在發(fā)育早期會出現(xiàn)果皮厚度變薄、細胞層數(shù)減少的現(xiàn)象。根據(jù)形態(tài)學及淀粉積累程度特點，可將籽粒果皮的發(fā)育過程分為生長期、形成期、消失期和成熟期［9，16］。本研究發(fā)現(xiàn)，花后15 d出現(xiàn)果皮層數(shù)減少、胚乳細胞破裂并伴隨PCD現(xiàn)象，推測此時果皮已進入消失期，通過PCD為籽粒灌漿擴容提供容納淀粉的充足內(nèi)部空間。小麥籽粒早期的發(fā)育過程，會經(jīng)歷細胞分裂、細胞分化、PCD現(xiàn)象，并伴隨著植物內(nèi)源激素的不斷變化，這種種變化是為保證其籽粒灌漿能夠順利進行而準備的。小麥籽粒發(fā)育過程中的PCD發(fā)生部位是在果皮和胚乳細胞中，如小麥品種華麥8果皮細胞在花后0～15 d完成PCD過程［3］，新冬18和新冬22胚乳細胞在花后15～25 d完成PCD［6］，而小麥新品種濟麥70在花后15～20 d可檢測到PCD現(xiàn)象，這是典型的胚乳PCD發(fā)生時間，但卻在花后5～20 d內(nèi)完成果皮的降解，這與前人研究相比有所延緩，這種PCD的差異可能與小麥品種以及氣候條件差異有關。

盡管本研究對小麥新品種濟麥70籽粒早期發(fā)育過程中細胞的形態(tài)變化、內(nèi)源植物激素含量以及PCD現(xiàn)象做了初步解析，但對其上游調(diào)控PCD的基因是什么、ABA參與調(diào)控PCD的分子機理等問題仍需進一步研究。