小麥-智利大麥染色體端體系的鑒定

陳志偉，宮文萍，韓冉，李豪圣，劉建軍，賈舉慶，劉成

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，山東 濟南 250100）

小麥?zhǔn)侵匾募Z食作物，為全世界人類提供了大約20%的能量［1］。我國的小麥種植面積約是世界小麥種植面積的十分之一，播種面積僅次于玉米和水稻，是我國第三大糧食作物。近年來，我國小麥單產(chǎn)穩(wěn)步提升、總產(chǎn)持續(xù)增長，小麥生產(chǎn)取得了舉世矚目的成就［2］。然而，長期以來育種家們對少數(shù)骨干親本的大量利用及相似品種間的相互雜交，容易造成品種抗源日趨單一化和遺傳變異范圍縮小等問題［3］，一旦新致病生理小種爆發(fā)，將很難應(yīng)對。因此，通過遺傳改良并培育多樣性更加豐富的高產(chǎn)抗病品種是解決上述問題的關(guān)鍵。小麥野生近緣種中含有抗病、抗逆和多分蘗等優(yōu)異性狀，是小麥的優(yōu)異基因源［4］，育種家可以通過小麥遠緣雜交和染色體工程培育多樣性更加豐富的高產(chǎn)抗病品種。

向小麥引進近緣物種的優(yōu)異基因通常過程是先將二者雜交，獲得小麥-近緣植物雙二倍體或部分雙二倍體［3，5］；再將雙二倍體或部分雙二倍體與小麥進行雜交回交，獲得小麥-近緣植物附加系或代換系［3，5，6］；然后，再將附加系或代換系與小麥或ph1b基因缺失突變體進行雜交回交，獲得易位系或端體系［3，7］。其中，小麥-近緣植物雙二倍體、部分雙二倍體、附加系和代換系是近緣植物向小麥轉(zhuǎn)移優(yōu)異基因的橋梁材料，附加系、代換系、易位系和端體系是定位和利用近緣植物優(yōu)異基因的重要材料［3］。

智利大麥?zhǔn)切←湼牧嫉膬?yōu)異近緣物種，主要分布在智利和阿根廷，基因組為HchHch，高抗葉銹病、白粉病和全蝕病等病害［8，9］，同時具有耐干旱［10］和耐鹽［10，11］等特點。目前，已有小麥-智利大麥雙二倍體和附加系創(chuàng)制的報道［3，8，12，13］，但有關(guān)端體系的報道非常少見。鑒于此，本研究利用熒光原位雜交和分子標(biāo)記等方法對小麥-智利大麥1Hch＋1HchS附加系自交后代進行篩選，鑒定出小麥-智利大麥1HchS單端體系和1HchL雙端體系，為將源自智利大麥1Hch染色體的耐鹽和抗禾谷孢囊線蟲基因［8］定位到染色體臂上提供了重要材料，并獲得了可以追蹤小麥背景中智利大麥1Hch染色體的特異分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

小麥中國春（Chinese Spring，CS）由電子科技大學(xué)楊足君教授提供。濟麥22（JM22）和濟麥23（JM23）由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所小麥遺傳育種團隊培育。中國春-智利大麥雙二倍體（CS-Hchamp）和中國春-智利大麥1Hch＋1HchS附加系（Heter CS-Hchadd）由英國約翰英納斯中心（John Innes Centre，JIC）的Reader S M教授提供。中國春-智利大麥4Hch附加系（TA7588）、5Hch附加系（TA7589）、6Hch附加系（TA7590）以及7Hch附加系（TA7591）由美國堪薩斯州立大學(xué)小麥遺傳與基因資源中心（Wheat Genetic and Genomic Resources Center，WGGRC）的Gill B S提供。ZLDM1—ZLDM50為小麥-智利大麥1Hch＋1HchS附加系自交F2后代材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 供試材料基因組總DNA用快捷型植物基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取。取約100 mg的葉片放入2 mL離心管（提前加入直徑2 mm的鋼珠）中，液氮中速凍，然后用SCIENTZ-192組織研磨機在30 Hz頻率下將葉片打碎至粉末，提取方法參照文獻［14］。

1.2.2 IT引物與PLUG引物的PCR擴增及電泳 IT引物序列及PCR擴增程序參照文獻［15］，PLUG引物序列及PCR擴增程序參照文獻［16］。染色體第一同源群的135對IT引物和26對PLUG引物由青島擎科天成生物技術(shù)有限公司合成。IT-PCR和PLUG-PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠中電泳，電泳后凝膠在紫外凝膠成像儀GDS-Gel Dol 2000下掃描照相。

1.2.3 染色體制片與熒光原位雜交 試驗材料的根尖處理和染色體制片方法，以O(shè)ligopSc119.2-1和Oligo-pTa535-1為探針進行的原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）所用探針合成、探針濃度、具體操作步驟，以及原位雜交染色體制片自然干燥后的具體操作步驟等參見文獻［8］。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥-智利大麥染色體端體系的篩選與鑒定

以O(shè)ligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa535-1為探針的FISH可以鑒定出小麥背景中的智利大麥1Hch染色體，且其染色體長臂和短臂信號不同［8］。本研究以上述兩探針的FISH對小麥-智利大麥1Hch＋1HchS附加系自交F2后代材料ZLDM1—ZLDM50進行篩選與鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，50個單株中，20個單株含整條1Hch染色體，12個單株含1HchS和1HchL端體，13個單株無外緣染色體，ZLDM7和ZLDM43含1條1HchL染色體，ZLDM29含1對1HchL染 色 體，ZLDM14和ZLDM37含1條1HchS染色體。對ZLDM29和ZLDM37進行染色體計數(shù)發(fā)現(xiàn)，二者的染色體條數(shù)分別為42＋2t（t＝telosomics）和42＋t，外緣染色體臂雜交信號與文獻相同，因此，ZLDM29和ZLDM37分別是小麥-智利大麥1HchL雙端體系（圖1A）和1HchS單端體系（圖1B）。

圖1 寡聚核苷酸探針Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa535-1對供試材料的鑒定結(jié)果

2.2 染色體第一同源群IT引物與PLUG引物篩選

以中國春和中國春-智利大麥雙二倍體為材料，篩選合成的染色體第一同源群IT引物和PLUG引物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超過95%的引物均能在供試材料中擴增出明顯的2～3條DNA條帶。相比中國春，PLUG引物中的TNAC1530、TNAC1535和TNAC1536可以在中國春-智利大麥雙二倍體中擴增出額外的多態(tài)性條帶（圖2A）；IT引物中的CINAU1185、CINAU1186和CINAU1187可以在中國春-智利大麥雙二倍體中擴增出額外的多態(tài)性條帶（圖2B）。上述條帶可能可作為分子標(biāo)記用于檢測小麥背景中智利大麥染色質(zhì)。

圖2 IT引物和PLUG引物在中國春和中國春-智利大麥雙二倍體中的擴增結(jié)果

2.3 智利大麥基因組多態(tài)性DNA片段的染色體定位

為了驗證上述IT引物和PLUG引物擴增出多態(tài)性條帶在檢測小麥背景中智利大麥染色質(zhì)的可行性及確定它們在智利大麥染色體上的定位，用引 物TNAC1530、TNAC1535、TNAC1536、CINAU1185、CINAU1186和CINAU1187對中國春-智利大麥1Hch＋1HchS附加系、1HchL單端體系、1HchL雙端體系、1HchS＋1HchL端體系、1HchS單端體系、4Hch附加系、5Hch附加系、6Hch附加系、7Hch附加系、1Hch＋1HchS附加系自交F2后代材料ZLDM1—ZLDM50以及濟麥22和濟麥23進行擴增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅引物CINAU1186和TNAC1536可以在含1HchL的材料中擴增出長度分別為350 bp和700 bp的特異多態(tài)性條帶（圖3），而在其他材料中擴增不出這些多態(tài)性條帶（除TNAC1536能在6Hch附加系中擴增出多態(tài)性條帶），因此，這些多態(tài)性條帶可以作為分子標(biāo)記檢測小麥背景中的1HchL染色質(zhì)。引物TNAC1530、TNAC1535、CINAU1185和CINAU1187未能像預(yù)期一樣在除中國春-智利大麥雙二倍體外的供試材料中擴增出目標(biāo)多態(tài)性帶，表明這些多態(tài)性條帶可能在中國春-智利大麥雙二倍體與小麥雜交回交過程中丟失或?qū)?yīng)基因序列發(fā)生了變異。引物CINAU1186和TNAC1536的序列信息如表1所示。

圖3 引物CINAU1186和TNAC1536在部分供試材料中的擴增結(jié)果

表1 獲得智利大麥染色體特異分子標(biāo)記對應(yīng)的引物信息

3 討論與結(jié)論

在小麥-智利大麥染色體系創(chuàng)制方面，Miller等［17］最早在1981年開展了將智利大麥染色質(zhì)轉(zhuǎn)移給小麥的研究，獲得了小麥-智利大麥雙二倍體以及4Hch—7Hch附加系等種質(zhì)。Antonio Fernández［18］、Padilla［19］等也先后在1985年 和1987年開展了四倍體小麥和智利大麥雜交工作并獲得了染色體雙二倍體。1990年，我國學(xué)者蔣繼明和劉大均也通過離體幼胚培養(yǎng)和回交等方法獲得了小麥-智利大麥BC1F1材料［20］。Del Carmen等［21］在2012年將智利大麥4Hch染色體導(dǎo)入硬粒小麥，獲得了硬粒小麥-智利大麥4Hch代換系和附加系。Mattera等［13］在2015年創(chuàng)制出了小麥-智利大麥7Hch染色體漸滲系。Mattera和Cabrera于2017年將中國春-圓柱山羊草2C染色體附加系與小麥-智利大麥7Hch（7D）附加系進行雜交，獲得了3個純合的小麥-智利大麥羅伯遜易位系［22］。2019年，Palomino和Cabrera又創(chuàng)制出了小麥-智利大麥2Hch染色體漸滲系［23］。上述研究中未發(fā)現(xiàn)涉及小麥-智利大麥1Hch端體系創(chuàng)制的報道，因為1Hch上含有耐鹽和抗禾谷孢囊線蟲等重要基因，因此，創(chuàng)制涉及智利大麥1Hch的染色體端體系對定位和利用相關(guān)基因具有重要價值。鑒于此，本研究從小麥-智利大麥1Hch＋1HchS附加系自交后代中鑒定出了小麥-智利大麥1HchS端體系和1HchL端體系，為智利大麥優(yōu)異基因定位提供了工具材料。

在智利大麥染色體特異標(biāo)記建立方面，Miller等［17］利用形態(tài)學(xué)標(biāo)記和生化標(biāo)記等對智利大麥染色體同源群歸屬進行了鑒定。Hueros等［24］從智利大麥中發(fā)掘出特異重復(fù)序列作為探針用于有效區(qū)分小麥和智利大麥染色體。Hernáhndez等［25］利用RAPD引物對小麥-智利大麥附加系等材料進行擴增，獲得智利大麥特異RAPD片段進行克隆測序并將其轉(zhuǎn)化成了STS標(biāo)記。Castillo等［26］利用EST-SSR引物對不同的智利大麥和小麥-大麥附加系進行擴增，建立了智利大麥EST-SSR標(biāo)記。Said和Cabrera［27］設(shè)計了大麥染色體4H特異引物對智利大麥和小麥進行擴增，建立了智利大麥4Hch染色體特異SSR標(biāo)記、EST-SSR標(biāo)記和STS標(biāo)記。Mattera等［13］利用染色體第7同源群上的EST和COS引物對智利大麥和小麥等材料進行擴增，建立了智利大麥染色體第4Hch染色體特異分子標(biāo)記。Mattera和Cabrera［22］以智利大麥7Hch上八氫番茄紅素合成酶（Psy1）基因序列為基礎(chǔ)開發(fā)了該基因標(biāo)記用于對小麥-智利大麥雜交后代進行鑒定。上述研究未見智利大麥1Hch染色體特異分子標(biāo)記建立的報道。鑒于此，本研究以源自簇毛麥的IT引物和源自水稻的PLUG引物對從小麥、小麥-智利大麥染色體系、小麥-智利大麥雜交分離群體等進行擴增，建立了智利大麥1HchL染色體臂特異分子標(biāo)記，為小麥背景中1HchL染色體臂追蹤提供了檢測方法。然而，本研究未在小麥和小麥-智利大麥1HchS端體系間發(fā)現(xiàn)多態(tài)性，需今后重點開發(fā)該染色體臂特異分子標(biāo)記。