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    小麥-智利大麥染色體端體系的鑒定

    2021-06-09 03:45:22陳志偉宮文萍韓冉李豪圣劉建軍賈舉慶劉成
    山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年5期

    陳志偉,宮文萍,韓冉,李豪圣,劉建軍,賈舉慶,劉成

    (1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,山西 太谷 030801;2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所,山東 濟(jì)南 250100)

    小麥?zhǔn)侵匾募Z食作物,為全世界人類提供了大約20%的能量[1]。我國的小麥種植面積約是世界小麥種植面積的十分之一,播種面積僅次于玉米和水稻,是我國第三大糧食作物。近年來,我國小麥單產(chǎn)穩(wěn)步提升、總產(chǎn)持續(xù)增長,小麥生產(chǎn)取得了舉世矚目的成就[2]。然而,長期以來育種家們對少數(shù)骨干親本的大量利用及相似品種間的相互雜交,容易造成品種抗源日趨單一化和遺傳變異范圍縮小等問題[3],一旦新致病生理小種爆發(fā),將很難應(yīng)對。因此,通過遺傳改良并培育多樣性更加豐富的高產(chǎn)抗病品種是解決上述問題的關(guān)鍵。小麥野生近緣種中含有抗病、抗逆和多分蘗等優(yōu)異性狀,是小麥的優(yōu)異基因源[4],育種家可以通過小麥遠(yuǎn)緣雜交和染色體工程培育多樣性更加豐富的高產(chǎn)抗病品種。

    向小麥引進(jìn)近緣物種的優(yōu)異基因通常過程是先將二者雜交,獲得小麥-近緣植物雙二倍體或部分雙二倍體[3,5];再將雙二倍體或部分雙二倍體與小麥進(jìn)行雜交回交,獲得小麥-近緣植物附加系或代換系[3,5,6];然后,再將附加系或代換系與小麥或ph1b基因缺失突變體進(jìn)行雜交回交,獲得易位系或端體系[3,7]。其中,小麥-近緣植物雙二倍體、部分雙二倍體、附加系和代換系是近緣植物向小麥轉(zhuǎn)移優(yōu)異基因的橋梁材料,附加系、代換系、易位系和端體系是定位和利用近緣植物優(yōu)異基因的重要材料[3]。

    智利大麥?zhǔn)切←湼牧嫉膬?yōu)異近緣物種,主要分布在智利和阿根廷,基因組為HchHch,高抗葉銹病、白粉病和全蝕病等病害[8,9],同時具有耐干旱[10]和耐鹽[10,11]等特點(diǎn)。目前,已有小麥-智利大麥雙二倍體和附加系創(chuàng)制的報道[3,8,12,13],但有關(guān)端體系的報道非常少見。鑒于此,本研究利用熒光原位雜交和分子標(biāo)記等方法對小麥-智利大麥1Hch+1HchS附加系自交后代進(jìn)行篩選,鑒定出小麥-智利大麥1HchS單端體系和1HchL雙端體系,為將源自智利大麥1Hch染色體的耐鹽和抗禾谷孢囊線蟲基因[8]定位到染色體臂上提供了重要材料,并獲得了可以追蹤小麥背景中智利大麥1Hch染色體的特異分子標(biāo)記。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    小麥中國春(Chinese Spring,CS)由電子科技大學(xué)楊足君教授提供。濟(jì)麥22(JM22)和濟(jì)麥23(JM23)由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所小麥遺傳育種團(tuán)隊培育。中國春-智利大麥雙二倍體(CS-Hchamp)和中國春-智利大麥1Hch+1HchS附加系(Heter CS-Hchadd)由英國約翰英納斯中心(John Innes Centre,JIC)的Reader S M教授提供。中國春-智利大麥4Hch附加系(TA7588)、5Hch附加系(TA7589)、6Hch附加系(TA7590)以及7Hch附加系(TA7591)由美國堪薩斯州立大學(xué)小麥遺傳與基因資源中心(Wheat Genetic and Genomic Resources Center,WGGRC)的Gill B S提供。ZLDM1—ZLDM50為小麥-智利大麥1Hch+1HchS附加系自交F2后代材料。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 DNA提取 供試材料基因組總DNA用快捷型植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取。取約100 mg的葉片放入2 mL離心管(提前加入直徑2 mm的鋼珠)中,液氮中速凍,然后用SCIENTZ-192組織研磨機(jī)在30 Hz頻率下將葉片打碎至粉末,提取方法參照文獻(xiàn)[14]。

    1.2.2 IT引物與PLUG引物的PCR擴(kuò)增及電泳 IT引物序列及PCR擴(kuò)增程序參照文獻(xiàn)[15],PLUG引物序列及PCR擴(kuò)增程序參照文獻(xiàn)[16]。染色體第一同源群的135對IT引物和26對PLUG引物由青島擎科天成生物技術(shù)有限公司合成。IT-PCR和PLUG-PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠中電泳,電泳后凝膠在紫外凝膠成像儀GDS-Gel Dol 2000下掃描照相。

    1.2.3 染色體制片與熒光原位雜交 試驗材料的根尖處理和染色體制片方法,以O(shè)ligopSc119.2-1和Oligo-pTa535-1為探針進(jìn)行的原位雜交(fluorescence in situ hybridization,F(xiàn)ISH)所用探針合成、探針濃度、具體操作步驟,以及原位雜交染色體制片自然干燥后的具體操作步驟等參見文獻(xiàn)[8]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 小麥-智利大麥染色體端體系的篩選與鑒定

    以O(shè)ligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa535-1為探針的FISH可以鑒定出小麥背景中的智利大麥1Hch染色體,且其染色體長臂和短臂信號不同[8]。本研究以上述兩探針的FISH對小麥-智利大麥1Hch+1HchS附加系自交F2后代材料ZLDM1—ZLDM50進(jìn)行篩選與鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn),50個單株中,20個單株含整條1Hch染色體,12個單株含1HchS和1HchL端體,13個單株無外緣染色體,ZLDM7和ZLDM43含1條1HchL染色體,ZLDM29含1對1HchL染 色 體,ZLDM14和ZLDM37含1條1HchS染色體。對ZLDM29和ZLDM37進(jìn)行染色體計數(shù)發(fā)現(xiàn),二者的染色體條數(shù)分別為42+2t(t=telosomics)和42+t,外緣染色體臂雜交信號與文獻(xiàn)相同,因此,ZLDM29和ZLDM37分別是小麥-智利大麥1HchL雙端體系(圖1A)和1HchS單端體系(圖1B)。

    圖1 寡聚核苷酸探針Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa535-1對供試材料的鑒定結(jié)果

    2.2 染色體第一同源群IT引物與PLUG引物篩選

    以中國春和中國春-智利大麥雙二倍體為材料,篩選合成的染色體第一同源群IT引物和PLUG引物,結(jié)果發(fā)現(xiàn),超過95%的引物均能在供試材料中擴(kuò)增出明顯的2~3條DNA條帶。相比中國春,PLUG引物中的TNAC1530、TNAC1535和TNAC1536可以在中國春-智利大麥雙二倍體中擴(kuò)增出額外的多態(tài)性條帶(圖2A);IT引物中的CINAU1185、CINAU1186和CINAU1187可以在中國春-智利大麥雙二倍體中擴(kuò)增出額外的多態(tài)性條帶(圖2B)。上述條帶可能可作為分子標(biāo)記用于檢測小麥背景中智利大麥染色質(zhì)。

    圖2 IT引物和PLUG引物在中國春和中國春-智利大麥雙二倍體中的擴(kuò)增結(jié)果

    2.3 智利大麥基因組多態(tài)性DNA片段的染色體定位

    為了驗證上述IT引物和PLUG引物擴(kuò)增出多態(tài)性條帶在檢測小麥背景中智利大麥染色質(zhì)的可行性及確定它們在智利大麥染色體上的定位,用引 物TNAC1530、TNAC1535、TNAC1536、CINAU1185、CINAU1186和CINAU1187對中國春-智利大麥1Hch+1HchS附加系、1HchL單端體系、1HchL雙端體系、1HchS+1HchL端體系、1HchS單端體系、4Hch附加系、5Hch附加系、6Hch附加系、7Hch附加系、1Hch+1HchS附加系自交F2后代材料ZLDM1—ZLDM50以及濟(jì)麥22和濟(jì)麥23進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果發(fā)現(xiàn),僅引物CINAU1186和TNAC1536可以在含1HchL的材料中擴(kuò)增出長度分別為350 bp和700 bp的特異多態(tài)性條帶(圖3),而在其他材料中擴(kuò)增不出這些多態(tài)性條帶(除TNAC1536能在6Hch附加系中擴(kuò)增出多態(tài)性條帶),因此,這些多態(tài)性條帶可以作為分子標(biāo)記檢測小麥背景中的1HchL染色質(zhì)。引物TNAC1530、TNAC1535、CINAU1185和CINAU1187未能像預(yù)期一樣在除中國春-智利大麥雙二倍體外的供試材料中擴(kuò)增出目標(biāo)多態(tài)性帶,表明這些多態(tài)性條帶可能在中國春-智利大麥雙二倍體與小麥雜交回交過程中丟失或?qū)?yīng)基因序列發(fā)生了變異。引物CINAU1186和TNAC1536的序列信息如表1所示。

    圖3 引物CINAU1186和TNAC1536在部分供試材料中的擴(kuò)增結(jié)果

    表1 獲得智利大麥染色體特異分子標(biāo)記對應(yīng)的引物信息

    3 討論與結(jié)論

    在小麥-智利大麥染色體系創(chuàng)制方面,Miller等[17]最早在1981年開展了將智利大麥染色質(zhì)轉(zhuǎn)移給小麥的研究,獲得了小麥-智利大麥雙二倍體以及4Hch—7Hch附加系等種質(zhì)。Antonio Fernández[18]、Padilla[19]等也先后在1985年 和1987年開展了四倍體小麥和智利大麥雜交工作并獲得了染色體雙二倍體。1990年,我國學(xué)者蔣繼明和劉大均也通過離體幼胚培養(yǎng)和回交等方法獲得了小麥-智利大麥BC1F1材料[20]。Del Carmen等[21]在2012年將智利大麥4Hch染色體導(dǎo)入硬粒小麥,獲得了硬粒小麥-智利大麥4Hch代換系和附加系。Mattera等[13]在2015年創(chuàng)制出了小麥-智利大麥7Hch染色體漸滲系。Mattera和Cabrera于2017年將中國春-圓柱山羊草2C染色體附加系與小麥-智利大麥7Hch(7D)附加系進(jìn)行雜交,獲得了3個純合的小麥-智利大麥羅伯遜易位系[22]。2019年,Palomino和Cabrera又創(chuàng)制出了小麥-智利大麥2Hch染色體漸滲系[23]。上述研究中未發(fā)現(xiàn)涉及小麥-智利大麥1Hch端體系創(chuàng)制的報道,因為1Hch上含有耐鹽和抗禾谷孢囊線蟲等重要基因,因此,創(chuàng)制涉及智利大麥1Hch的染色體端體系對定位和利用相關(guān)基因具有重要價值。鑒于此,本研究從小麥-智利大麥1Hch+1HchS附加系自交后代中鑒定出了小麥-智利大麥1HchS端體系和1HchL端體系,為智利大麥優(yōu)異基因定位提供了工具材料。

    在智利大麥染色體特異標(biāo)記建立方面,Miller等[17]利用形態(tài)學(xué)標(biāo)記和生化標(biāo)記等對智利大麥染色體同源群歸屬進(jìn)行了鑒定。Hueros等[24]從智利大麥中發(fā)掘出特異重復(fù)序列作為探針用于有效區(qū)分小麥和智利大麥染色體。Hernáhndez等[25]利用RAPD引物對小麥-智利大麥附加系等材料進(jìn)行擴(kuò)增,獲得智利大麥特異RAPD片段進(jìn)行克隆測序并將其轉(zhuǎn)化成了STS標(biāo)記。Castillo等[26]利用EST-SSR引物對不同的智利大麥和小麥-大麥附加系進(jìn)行擴(kuò)增,建立了智利大麥EST-SSR標(biāo)記。Said和Cabrera[27]設(shè)計了大麥染色體4H特異引物對智利大麥和小麥進(jìn)行擴(kuò)增,建立了智利大麥4Hch染色體特異SSR標(biāo)記、EST-SSR標(biāo)記和STS標(biāo)記。Mattera等[13]利用染色體第7同源群上的EST和COS引物對智利大麥和小麥等材料進(jìn)行擴(kuò)增,建立了智利大麥染色體第4Hch染色體特異分子標(biāo)記。Mattera和Cabrera[22]以智利大麥7Hch上八氫番茄紅素合成酶(Psy1)基因序列為基礎(chǔ)開發(fā)了該基因標(biāo)記用于對小麥-智利大麥雜交后代進(jìn)行鑒定。上述研究未見智利大麥1Hch染色體特異分子標(biāo)記建立的報道。鑒于此,本研究以源自簇毛麥的IT引物和源自水稻的PLUG引物對從小麥、小麥-智利大麥染色體系、小麥-智利大麥雜交分離群體等進(jìn)行擴(kuò)增,建立了智利大麥1HchL染色體臂特異分子標(biāo)記,為小麥背景中1HchL染色體臂追蹤提供了檢測方法。然而,本研究未在小麥和小麥-智利大麥1HchS端體系間發(fā)現(xiàn)多態(tài)性,需今后重點(diǎn)開發(fā)該染色體臂特異分子標(biāo)記。

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