小麥近緣物種通用標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用

劉占圣，郭軍，韓冉，徐文競(jìng)，傅曉藝，劉任糠，潘凱琳，李豪圣，劉建軍，汪曉璐，劉成

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所／農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃淮北部小麥生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／小麥玉米國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100；2.煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005；3.石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院，河北 石家莊 050049；4.江蘇大學(xué)，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪匾募Z食作物之一。小麥近緣物種中含有豐富的抗病、抗逆和抗蟲(chóng)等優(yōu)異基因，是改良小麥抗病、抗逆等性狀的珍貴基因庫(kù)［1-4］。將近緣植物與小麥雜交，創(chuàng)制小麥遺傳改良材料是小麥遠(yuǎn)緣雜交的重要內(nèi)容［5］。隨著小麥遠(yuǎn)緣雜交和染色體工程研究的深入開(kāi)展，含優(yōu)異基因的外源染色體或染色體片段被導(dǎo)入小麥［6］，創(chuàng)制出了一大批優(yōu)良的中間材料［7］，為豐富普通小麥的遺傳基礎(chǔ)和性狀遺傳改良提供了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。

分子標(biāo)記是鑒定小麥遠(yuǎn)緣雜交種質(zhì)的有效工具。在小麥近緣植物特異標(biāo)記建立方面，劉旭等［8］利用RAPD引物對(duì)高大山羊草及對(duì)照進(jìn)行分析，建立了可以用于檢測(cè)小麥背景中高大山羊草染色體的RAPD標(biāo)記。王春梅等［9］利用STS引物對(duì)中國(guó)春、黑麥、普通小麥-黑麥1R-7R二體異附加系進(jìn)行分析，建立了黑麥1R染色體特異STS標(biāo)記。Zhang等［10］根據(jù)小麥EST序列設(shè)計(jì)引物對(duì)小麥、簇毛麥以及小麥-簇毛麥漸滲系進(jìn)行擴(kuò)增，建立了簇毛麥5VS特異EST標(biāo)記。Mattera等［11］利用EST引物對(duì)智利大麥和小麥等材料進(jìn)行擴(kuò)增，建立了智利大麥7Hch染色體EST標(biāo)記。Liu等［12］利用一套小麥-擬斯卑爾脫山羊草附加系和代換系為材料，開(kāi)發(fā)了擬斯卑爾脫山羊草S基因組染色體特異EST標(biāo)記和SSR標(biāo)記。

上述標(biāo)記主要是建立某一小麥近緣物種特異標(biāo)記，或者是建立小麥近緣物種某一條染色體（臂）特異分子標(biāo)記［8-12］，但可用于同時(shí)區(qū)分不同小麥近緣物種的分子標(biāo)記，以及可同時(shí)用于檢測(cè)小麥背景中不同近緣物種的通用標(biāo)記還未見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，本研究通過(guò)篩選小麥A、B和D染色體共線性基因某一內(nèi)含子三個(gè)亞基因組間長(zhǎng)度差異超過(guò)10 bp的區(qū)域，在該內(nèi)含子上下游的外顯子保守序列處設(shè)計(jì)引物，利用小麥為對(duì)照，小麥近緣物種、小麥-近緣物種雜交種質(zhì)為材料，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，建立了能檢測(cè)小麥近緣物種的通用標(biāo)記，對(duì)篩選鑒定小麥外緣材料、小麥-外緣物種雜交種質(zhì)、分離群體以及選育含外緣物種血緣的小麥品系（種）均具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

中國(guó)春（Chinese Spring，CS）、N-編號(hào)和A6-4材料由電子科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院楊足君教授提供。7047和15n-21由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所張曉軍研究員提供。XX030由英國(guó)約翰英納斯中心Steve M Reader教授提供。濟(jì)麥21、濟(jì)麥22、濟(jì)麥23、濟(jì)麥44、濟(jì)麥229和濟(jì)麥262由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究團(tuán)隊(duì)自主培育。PI編號(hào)材料由美國(guó)種質(zhì)資源庫(kù)Harold Bockelman博士提供。AE編號(hào)材料和NGB編號(hào)材料分別源自德國(guó)IPK和北歐遺傳資源中心，由江蘇大學(xué)何華綱教授引進(jìn)并提供。TA編號(hào)材料由美國(guó)堪薩斯州立大學(xué)小麥遺傳與資源中心Bernd Friebe教授提供，材料具體信息見(jiàn)表1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 序列分析與選擇 利用BLASTN對(duì)中國(guó)春小麥參考基因組及其注釋信息IWGSC RefSeq Annotation v1.0中的A∶B∶D＝1∶1∶1同源基因信息進(jìn)行分析，保留微觀共線性良好并且均來(lái)自相同同源群的基因（參數(shù)設(shè)置E-value≤1E-10），保留含有內(nèi)含子并且A、B和D亞基因組之間相對(duì)應(yīng)內(nèi)含子大小差別均超過(guò)10 bp的基因。在上一步篩選出的內(nèi)含子信息基礎(chǔ)上，分別獲取每個(gè)內(nèi)含子上下游的外顯子序列，長(zhǎng)度小于50 bp外顯子序列將被去除。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 利用Primer 3（https://github.com／primer3-org／primer3）分別在上下游外顯子序列中設(shè)計(jì)正向和反向PCR引物，PCR引物的長(zhǎng)度范圍19～23 bp。分別對(duì)每組內(nèi)含子中A、B和D三個(gè)亞基因組的正向或反向引物去重，然后以組為單位分別統(tǒng)計(jì)正向或反向引物重復(fù)出現(xiàn)的次數(shù)，只保留重復(fù)次數(shù)為3，即在A、B和D三個(gè)亞基因組中均完全匹配的引物。利用BLASTN對(duì)上述引物進(jìn)行整個(gè)基因組水平的特異性檢測(cè)，數(shù)據(jù)庫(kù)為中國(guó)春參考基因組TGAC v1.39，E-value設(shè)置為10，輸出格式設(shè)置為6；保留BLASTN輸出中100%匹配（匹配長(zhǎng)度與引物長(zhǎng)度相同）的結(jié)果，并統(tǒng)計(jì)每條引物匹配到基因組上的位置數(shù)目；只保留匹配位置數(shù)目為3的引物，即在每個(gè)亞基因組上有且只有唯一匹配的引物。利用BLASTN對(duì)上述引物在基因組上的位置進(jìn)行檢索，去除未知染色體（ChrUn）以及不能成對(duì)的引物（即只有正向或只有反向引物）。利用A基因組的序列信息，選取每個(gè)基因中PCR產(chǎn)物最小或正反向引物相距最近的組合。將設(shè)計(jì)的引物序列遞交青島擎科天成生物技術(shù)有限公司合成。

表1 試驗(yàn)材料

1.2.3 DNA提取及PCR擴(kuò)增 基因組DNA的提取方法參照Liu等［13］，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取液的完整性和濃度。PCR反應(yīng)體系（30μL）：DNA（25 ng／μL）2.0μL，Taq DNA polymerase（5 U／μL）0.3μL，dNTPs（200μmol／L）0.3μL，含Mg2＋的10×PCR buffer 3.0μL，上、下游引物（10μmol／L）各2μL，用無(wú)菌雙蒸餾水補(bǔ)充反應(yīng)體系至30μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃3 min；94℃45 s，55℃45 s，72℃2 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃10 min。4℃保存。

1.2.4 PCR產(chǎn)物電泳及檢測(cè) PCR產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）電泳檢測(cè)。PAGE每100 mL包括30%丙烯酰 胺 溶 液 （acrylamide-bisacrylamide，Acr-Bis，29∶1）20 mL，5×TBE緩沖液20 mL，10%過(guò)硫酸銨溶液（ammonium persulphate，AP）1 mL，四甲基乙二胺（N，N，N′，N′-tetramethylethylenediamine，TEMED）40μL，最后用無(wú)菌雙蒸餾水補(bǔ)充至100 mL。電泳完后，PAGE在1μg／mL溴化乙錠溶液中染色30 min，最后在GDS-Gel Dol 2000紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選與外緣物種通用標(biāo)記的獲得

通過(guò)生物信息學(xué)篩選，共獲得符合要求的引物2 189對(duì)，隨機(jī)選取并合成其中的36對(duì)，以濟(jì)麥21、濟(jì)麥22、濟(jì)麥23、濟(jì)麥44、濟(jì)麥229和濟(jì)麥262為材料，對(duì)其擴(kuò)增效果進(jìn)行篩選驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，36對(duì)引物均能在供試小麥中擴(kuò)增出相同的2～3條清晰DNA條帶。其中，引物Triad＿24、Tri-ad＿82、Triad＿199、Triad＿220、Triad＿291和Triad＿352的擴(kuò)增條帶如圖1所示。

為研究36對(duì)引物在小麥族物種間是否可以擴(kuò)增出多態(tài)性，以中國(guó)春、野生一粒小麥、烏拉爾圖小麥、黑麥、擬斯卑爾脫山羊草、沙融山羊草、高大山羊草、小傘山羊草、簇毛麥和智利大麥為研究材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，36對(duì)引物中有25對(duì)可以在供試材料間擴(kuò)增出明顯多態(tài)性。這些引物不僅可以在同一物種不同亞種間擴(kuò)增出多態(tài)性，還能在不同物種間擴(kuò)增出多態(tài)性，因此，這些多態(tài)性標(biāo)記可能可以應(yīng)用于檢測(cè)小麥背景的外源染色質(zhì)。篩選出的25對(duì)引物信息如表2所示。引物Triad＿24、Triad＿82、Triad＿199、Triad＿220、Triad＿291和Triad＿352的擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示。

圖1 Triad＿24等6對(duì)引物在普通小麥中擴(kuò)增產(chǎn)物的PAGE電泳檢測(cè)圖譜

圖2 Triad＿24等6對(duì)引物在小麥近緣物種中擴(kuò)增產(chǎn)物的PAGE電泳檢測(cè)圖譜

2.2 外緣物種通用標(biāo)記的應(yīng)用

為了驗(yàn)證篩選出的25對(duì)引物擴(kuò)增出多態(tài)性標(biāo)記在檢測(cè)小麥背景的外源染色質(zhì)的可行性，以中國(guó)春、硬粒小麥-簇毛麥雙二倍體、小麥-長(zhǎng)穗偃麥草雙二倍體、小麥-中間偃麥草部分雙二倍體（7047）、小麥-多年生簇毛麥附加系、小麥-非洲黑麥雙二倍體、小麥-中間偃麥草部分雙二倍體（15n-21）、中國(guó)春-智利大麥雙二倍體、圓錐小麥-頂芒山羊草雙二倍體、圓錐小麥-單芒山羊草雙二倍體、小麥-偏凸山羊草部分雙二倍體、烏拉爾圖小麥-沙融山羊草雙二倍體、栽培一粒小麥-二角山羊草、小麥-無(wú)芒山羊草雙二倍體、中國(guó)春-希爾斯山羊草雙二倍體和小麥-尾狀山羊草雙二倍體為研究材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，25對(duì)引物都可以在供試材料間擴(kuò)增出明顯多態(tài)性。因此，這些多態(tài)性標(biāo)記可以應(yīng)用于檢測(cè)小麥背景的外源染色質(zhì)。引物Triad＿24、Triad＿82、Triad＿199、Triad＿220、Triad＿291和Triad＿352的擴(kuò)增結(jié)果如圖3所示。

圖3 Triad＿24等6對(duì)引物在小麥遠(yuǎn)緣雜交種質(zhì)中擴(kuò)增產(chǎn)物的PAGE電泳檢測(cè)圖譜

表2 標(biāo)記名稱及引物

3 討論與結(jié)論

小麥EST-SSR引物、SSR引物、STS引物和PLUG引物均可用于小麥近緣物種標(biāo)記開(kāi)發(fā)［14-20］。李 宏 偉［14］、李 飛［15］、陳 仕 勇［16］、徐鑫［17］和宿俊吉［18］等分別對(duì)小麥EST-SSR引物在小麥及近緣物種間遺傳多樣性、小麥和黑麥草間通用性、小麥和垂穗披堿草間通用性、小麥與長(zhǎng)穗偃麥草間通用性、小麥與冰草間通用性進(jìn)行了研究，認(rèn)為部分引物可用于小麥近緣物種標(biāo)記開(kāi)發(fā)。徐鑫［17］、宿俊吉［18］、王黎明［19］、嚴(yán)學(xué)兵［20］等分別對(duì)小麥SSR引物在小麥與長(zhǎng)穗偃麥草間通用性、小麥與冰草間通用性、小麥與中間偃麥草通用性、小麥與披堿草間通用性進(jìn)行了研究，認(rèn)為部分引物可用于小麥近緣物種標(biāo)記開(kāi)發(fā)。此外，徐鑫［17］還對(duì)小麥STS引物和PLUG引物在普通小麥和長(zhǎng)穗偃麥草間的通用性進(jìn)行了研究，認(rèn)為部分STS引物和PLUG引物可以用于開(kāi)發(fā)長(zhǎng)穗偃麥草標(biāo)記。上述研究均是利用其他已經(jīng)發(fā)表文獻(xiàn)為基礎(chǔ)進(jìn)行引物通用性研究，且所用小麥近緣物種為某一物種或某一屬的較少幾個(gè)物種。本研究通過(guò)自主篩選小麥A、B和D染色體共線性基因某一內(nèi)含子三個(gè)亞基因組間長(zhǎng)度差異超過(guò)10 bp的區(qū)域，在該內(nèi)含子上下游的外顯子保守序列處設(shè)計(jì)引物，對(duì)小麥族黑麥屬、簇毛麥屬、大麥屬、偃麥草屬、山羊草屬等物種進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，建立了能檢測(cè)小麥近緣物種的通用標(biāo)記，為小麥近緣物種標(biāo)記開(kāi)發(fā)提供了新的研究思路。

不同類型引物在小麥近緣物種染色體特異標(biāo)記開(kāi)發(fā)效率方面，González等［21］利用RAPD引物開(kāi)發(fā)黑麥染色體標(biāo)記，開(kāi)發(fā)效率為32.86%（46／140）。Liu［22］、劉曉明［23］、Gong［24］、Said［25］等分別利用EST-STS引物開(kāi)發(fā)希爾斯山羊草、高大山羊草、尾狀山羊草和大麥染色體特異標(biāo)記，開(kāi)發(fā)效率分別為13.89%（20／144）、5.00%（6／120）、3.66%（15／410）和9.09%（4／44）。Liu［22］、Said［25］、Zhao［26］等分別利用SSR引物開(kāi)發(fā)高大山羊草、大麥和簇毛麥染色體特異標(biāo)記，開(kāi)發(fā)效率分別為12.50%（2／16）、12.90%（8／62）和2.44%（2／82）。Gong等［24，27］分別利用COS引物開(kāi)發(fā)尾狀山羊草和希爾斯山羊草染色體特異標(biāo)記，開(kāi)發(fā)效率分別為3.74%（4／107）和3.61%（3／83）。Gong［24，27］、Liu［28，29］等分別利用PLUG引物開(kāi)發(fā)尾狀山羊草、希爾斯山羊草、無(wú)芒山羊草、頂芒山羊草染色體特異標(biāo)記，開(kāi)發(fā)效率分別為12.43%（23／185）、5.00%（3／60）、8.97%（13／145）和8.94%（47／526）。RAPD引物擴(kuò)增效果非常不穩(wěn)定［30］，近十年來(lái)在小麥族物種研究中已被基本棄用。其它引物如SSR、COS和PLUG等對(duì)不同小麥近緣物種染色體特異標(biāo)記開(kāi)發(fā)效率從2.44%～13.88%不等。本研究利用新開(kāi)發(fā)的內(nèi)含子擴(kuò)增引物對(duì)小麥族不同物種進(jìn)行擴(kuò)增，開(kāi)發(fā)標(biāo)記的比例為69.44%（25／36），顯著高于上述研究，因而，該方法可廣泛應(yīng)用于小麥近緣物種染色體特異標(biāo)記建立研究。

致謝：感謝山東農(nóng)業(yè)大學(xué)倪飛教授和山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所張榮志副研究員在生物信息學(xué)分析方面給予的大力幫助，感謝江蘇大學(xué)何華綱在PAGE電泳技術(shù)中給予的指導(dǎo)和幫助。