94份小麥育種親本的功能基因分子檢測

李瑋，宋國琦，商航，李玉蓮，張淑娟，張榮志，李吉虎，高潔，李根英

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所／農(nóng)業(yè)部黃淮北部小麥生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／小麥玉米國家工程實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

小麥?zhǔn)菑?fù)雜的異源六倍體物種，其基因組約為17 Gb［1］，是水稻的36倍多、玉米的7倍多。巨大的基因組給基因克隆和基因功能分析帶來重重困難，是導(dǎo)致小麥分子育種滯后于水稻和玉米的原因之一。2012年Liu等［2］系統(tǒng)總結(jié)了小麥中已克隆的30多個(gè)功能基因或遺傳位點(diǎn)及其相關(guān)的97個(gè)功能標(biāo)記，主要涉及小麥加工品質(zhì)、農(nóng)藝性狀和抗病性。功能標(biāo)記是根據(jù)功能基因上的等位變異開發(fā)的分子標(biāo)記，不同于連鎖標(biāo)記，不會因?yàn)槿旧w交換導(dǎo)致標(biāo)記與表型不符，是用于分子標(biāo)記輔助選擇的理想標(biāo)記。這97個(gè)功能標(biāo)記主要為STS、SCAR和CAPS，需要通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測，較為費(fèi)時(shí)費(fèi)力。2016年Rasheed等［3］報(bào)道了70個(gè)小麥KASP功能標(biāo)記，相比需要通過凝膠電泳進(jìn)行檢測的分子標(biāo)記，通過熒光檢測的KASP標(biāo)記檢測速度提高了45倍。2017年國際小麥基因組測序聯(lián)盟提前釋放了中國春參考基因組序列，為小麥功能基因研究鋪平了道路。2019年Khalid等［4］報(bào)道了小麥中已克隆功能基因或遺傳位點(diǎn)增加到87個(gè)，對應(yīng)的KASP標(biāo)記數(shù)量也增加到124個(gè)。隨著越來越多的KASP功能標(biāo)記被開發(fā)，功能標(biāo)記也逐漸被應(yīng)用。2019年Zhao等［5］對來自全球的1 152份小麥材料進(jìn)行了47個(gè)基因的KASP標(biāo)記檢測分析，粒重、抗旱、黃色素、穗發(fā)芽和株高相關(guān)的幾個(gè)基因優(yōu)異等位變異占比較高，而抗病相關(guān)的Lr68、Fhb1、Yr15和品質(zhì)相關(guān)的Wx-B1優(yōu)異等位變異占比較低，可作為未來改良的目標(biāo)。2020年單子龍等［6］利用22個(gè)品質(zhì)相關(guān)的KASP功能標(biāo)記對153份河北省歷年審定的小麥品種進(jìn)行了檢測，僅有5個(gè)基因的優(yōu)異等位變異占比超過60%，7個(gè)基因的優(yōu)異等位變異占比低于10%，表明通過輔助選擇優(yōu)異等位變異改良河北省小麥品質(zhì)性狀仍有力可為。2020年王志偉等利用抗病［7］、株高和粒重［8］相關(guān)的KASP標(biāo)記對云南省42份小麥品種（系）進(jìn)行了檢測，絕大部分基因的優(yōu)異等位變異占比較低，仍有遺傳改良潛力。2021年Zhang等［9］對寧夏自治區(qū)種植的小麥地方品種、現(xiàn)代品種（系）和引進(jìn)品種共207份進(jìn)行了44個(gè)KASP標(biāo)記檢測，與粒重、硬度、黃色素、株高等相關(guān)的幾個(gè)基因優(yōu)異等位變異占比較高，其他大部分基因的優(yōu)異等位變異占比有待提高。

現(xiàn)代育種技術(shù)已經(jīng)從傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)育種向精準(zhǔn)育種轉(zhuǎn)變，通過提高與育種目標(biāo)相關(guān)功能基因優(yōu)異等位變異的占比可以促進(jìn)育種基礎(chǔ)的提高，功能基因的分子標(biāo)記輔助選擇對小麥分子育種意義重大。山東省是我國小麥生產(chǎn)大省，為了促進(jìn)小麥分子育種技術(shù)在山東的發(fā)展和應(yīng)用，了解山東省小麥優(yōu)異等位變異占比情況，本研究從課題組保存的小麥育種親本出發(fā)，選擇部分分型效果較好的KASP功能標(biāo)記進(jìn)行檢測，旨在明確功能基因優(yōu)異等位變異在育種親本材料中的占比，促進(jìn)山東省小麥育種單位利用小麥分子標(biāo)記輔助選擇進(jìn)行遺傳改良。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究選用的小麥材料（表1）是本課題組收集保存用于育種的小麥品種或高代品系，共94份。2019年11月播種于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所濟(jì)南試驗(yàn)基地。播種機(jī)點(diǎn)播，行距33 cm，行長2 m，株距5 cm，按行長劃排，排間留1 m的田間走道。

1.2 DNA提取

于小麥抽穗期取2 cm左右旗葉，液氮冷凍，用Geno／Grinder 2010組織研磨機(jī)（SPEX，美國）進(jìn)行研磨，800 r／min研磨20 s。用快捷型植物基因組DNA提取系統(tǒng)［天根生化科技（北京）有限公司］提取DNA，去離子水溶解，調(diào)整濃度至100 ng／μL。

1.3 KASP標(biāo)記檢測

KASP反應(yīng)體系和反應(yīng)程序均參考Rasheed等［3］的，所用42個(gè)KASP標(biāo)記引物序列來自Rasheed［3］、Khalid［4］和高潔［10］等，引物由青島擎科生物技術(shù)有限公司合成。KASP Master Mix購自LGC公司（北京）。使用PHERAstar SNP分型檢測儀（LGC，英國）檢測KASP反應(yīng)最終熒光顏色，檢測結(jié)果導(dǎo)入Kluster Caller軟件進(jìn)行分型?；蛎Q和相應(yīng)基因標(biāo)記名稱見表2。

表1 參試小麥品種（系）

表2 基因名稱和相應(yīng)基因標(biāo)記名稱

2 結(jié)果與分析

2.1 KASP標(biāo)記檢測效果

本研究共檢測了42個(gè)KASP標(biāo)記，基本上所有標(biāo)記都能較好地分型（圖1）。除TaGS2B1＿1936檢測缺失數(shù)據(jù)為15個(gè)外，其余標(biāo)記的缺失數(shù)據(jù)均較少（圖2），平均每個(gè)標(biāo)記的缺失數(shù)據(jù)個(gè)數(shù)為2.4?；虻膬?yōu)異等位變異占比從0至100%，優(yōu)異等位變異占比低于10%的有7個(gè)基因，高于80%的有11個(gè)。

圖1 部分KASP標(biāo)記檢測結(jié)果

圖2 94份小麥材料的等位變異占比

2.2 1B／1R易位檢測結(jié)果

選擇1RS∶1BL＿6110檢測1B/1R易位，94份參試小麥材料中28份含有1B/1R易位，占比30%。1RS染色體同時(shí)含有抗病基因和不利品質(zhì)的黑麥堿基因，在本研究中將含有1B/1R易位列入優(yōu)異等位變異。含有優(yōu)異等位變異的材料有魯原502、周麥22、周8425B、北京841、濮麥053、內(nèi)鄉(xiāng)188、HM-1、濟(jì)寧12、西農(nóng)511、周麥36、周麥38、JM268、德05-10、華麥1號、寧麥11、淮麥20、寧 洪17237、17J218、17J236、JN331、科 農(nóng)3106、菏麥0662、菏麥0746-2、漯抗2號、K35、山農(nóng)0713-2、山農(nóng)多粒1號、山融3號。

2.3 株高相關(guān)標(biāo)記檢測結(jié)果

對Rht-B1和Rht-D1兩個(gè)株高基因進(jìn)行了KASP標(biāo)記檢測，分別有17份和75份材料含有矮稈等位變異，占比為18%和80%。同時(shí)含有兩個(gè)矮稈基因的有3份材料，分別是豫麥47、周8425B和金麥1號。不含上述兩個(gè)矮稈基因的材料是京411和北京841。

2.4 產(chǎn)量相關(guān)標(biāo)記檢測結(jié)果

檢測了9個(gè)產(chǎn)量相關(guān)的KASP標(biāo)記。千粒重相關(guān)的TaCwi、GW2-6B-721SNP和Sus1-7B-2932IND優(yōu)異等位變異占比較高，分別是89%、100%和94%，而TaGS2B1＿1936、GS5-2334、TaGW2-6A優(yōu)異等位變異占比較低，分別是33%、44%和23%；TaGASR是粒長的KASP標(biāo)記，優(yōu)異等位變異占比為10%；TEF7A1＿606是小穗粒數(shù)的KASP標(biāo)記，優(yōu)異等位變異占比38%；TaMoc-2433是穗數(shù)的KASP標(biāo)記，優(yōu)異等位變異占比僅為5%。參試小麥材料中，山融3號含有除TaMoc-2433外的8個(gè)優(yōu)異等位變異，是含有產(chǎn)量相關(guān)優(yōu)異等位變異最多的材料；其次是山農(nóng)9540-55，含有除TaMoc-2433和TEF7A1＿606的7個(gè)優(yōu)異等位變異。同時(shí)含有TaMoc-2433和TEF7A1＿606優(yōu)異等位基因的材料有西農(nóng)511和科農(nóng)3106。

2.5 品質(zhì)相關(guān)標(biāo)記檢測結(jié)果

檢測了9個(gè)與品質(zhì)相關(guān)的KASP標(biāo)記。GluA1.1＿1883和GluD1＿4777是高分子量麥谷蛋白亞基2*／1和（5＋10）標(biāo)記，分別占68%和28%，參試小麥材料中濟(jì)麥20、鄭麥366、冀師02-1、洲元9369、藁優(yōu)5766、煙農(nóng)1212、煙農(nóng)999、HM-1、硬B2 16-6、濟(jì)寧12、濟(jì)麥229、濟(jì)麥44、中麥578、新麥9、華麥1號、寧麥11、漯抗2號、山農(nóng)0538、山農(nóng)24、山農(nóng)25同時(shí)含有優(yōu)異亞基2*／1和（5＋10）；脂肪氧化酶標(biāo)記LoxB1＿SNP的低酶活優(yōu)異等位基因占比70%，含有脂肪氧化酶優(yōu)異等位變異的材料較多；與硬度相關(guān)的Pina-D1＿INS、Pinb2-v2-3和Pinb-D1＿INS的優(yōu)異等位變異占比分別為5%、51%和72%，一般小麥中硬度優(yōu)異等位變異僅含Pina-D1和Pinb-D1其中一個(gè)，本研究中含有Pina-D1優(yōu)異等位變異的材料較少，冀師02-1、Manital和藁優(yōu)5766同時(shí)含有Pina-D1和Pinb2-V優(yōu)異等位變異；與黃色素相關(guān)的Zds-A1＿SNP、ZDS-D1＿SNP和Pds-B1＿2002的優(yōu)異等位變異占比分別為26%、99%和22%，同時(shí)含有三個(gè)黃色素優(yōu)異等位變異的材料有新麥26、內(nèi)鄉(xiāng)188、濟(jì)寧12和山農(nóng)29。

2.6 抗性相關(guān)標(biāo)記檢測結(jié)果

檢測了12個(gè)與抗性相關(guān)的KASP標(biāo)記?？钩嗝共〉腇hb1的snp3BS-8檢測陽性材料僅有山農(nóng)抗赤1號，占比1%；抗小麥黃花葉病的Sbmp＿6061檢測陽性占比5%，有煙農(nóng)19、硬B2 16-6、濟(jì)糯麥1號、漯抗1號和山農(nóng)25；未檢測到Pm21陽性材料；抗葉銹的ubw14和Lr68-2檢測陽性占比分別是50%和15%，兼抗條銹、葉銹和白粉的多效抗病基因標(biāo)記C6K2C1、Sr2K3和Lr46g22K3檢測陽性占比分別是0、0和93%，ubw14、Lr68-2和Lr46g22K3均為陽性的材料有京411、北京841、陜7859、煙農(nóng)1212、煙農(nóng)999、濟(jì)寧12、濟(jì)麥60、西農(nóng)511、德05-10、華麥1號、淮麥20、17J218、山融3號；抗旱的1fehw3檢測陽性材料占比66%，含有該基因的材料較多；抗穗發(fā)芽的TaSdr-B1和PHS1-prom-222優(yōu)異等位變異占比分別為21%和51%，Vp1B1有a、b、c三個(gè)等位變異，等位變異a不抗穗發(fā)芽，等位變異b和c抗穗發(fā)芽，Vp1B2-83不能區(qū)分a和b，故本研究中將c作為優(yōu)異等位變異，占比51%，同時(shí)含有Vp1B2-83和PHS1-prom-222優(yōu)異等位變異的材料有洲元9369和華麥1號，同時(shí)含有TaSdr-B1和Vp1B2-83優(yōu)異等位變異的材料有陜7859、藁優(yōu)5766、內(nèi)鄉(xiāng)188、中麥578、寧麥11、科農(nóng)3106、漯抗1號、漯抗2號、K35、山農(nóng)0538、山農(nóng)抗赤1號、山農(nóng)特大粒1號、山融3號。

2.7 春化、光周期相關(guān)標(biāo)記檢測結(jié)果

檢測了6個(gè)與春化、光周期相關(guān)的KASP標(biāo)記。光周期標(biāo)記GS105-1117IND、TaPpdBJ001和TaPpdDD001優(yōu)異等位變異占比分別為99%、73%和98%；春化基因標(biāo)記Exon7＿C／T＿Vrn-A1、Vrn-B1＿B、Vrn-D1-D1a＿A優(yōu)異等位變異占比分別為85%、96%和80%。光周期和春化基因決定了小麥的生態(tài)適應(yīng)性，因此相同生態(tài)區(qū)的小麥主效基因的等位變異基本上是一致的且占比很高。

2.8 開花期相關(guān)標(biāo)記的檢測結(jié)果

檢測了3個(gè)與開花期相關(guān)的KASP標(biāo)記。開花期的優(yōu)異等位變異與生態(tài)區(qū)有關(guān)，本研究中將檢測數(shù)量較多的等位變異作為優(yōu)異等位變異。TaFT3-B1、TaELF3-B1和PRR73A1-9IND優(yōu)異等位變異的占比分別為67%、98%和81%。

3 討論與結(jié)論

1B／1R易位系小麥品種具有適應(yīng)性好、耐后期高溫、高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)［11］，這主要得益于1RS染色體上攜帶有Lr26、Sr31、Yr9和Pm8等抗病基因和其他高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)基因或基因組合［12］。1B／1R易位系被作為優(yōu)異親本廣泛利用，是外源基因用于小麥品種改良最成功的范例［13］，選擇是否攜帶1RS染色體最簡便有效的方法就是分子標(biāo)記輔助選擇。近期，Qi等［14］提出了作物育種“布達(dá)拉”模型，首先將品種的優(yōu)良性狀和優(yōu)異基因定向聚集，這就需要通過功能標(biāo)記輔助選擇來實(shí)現(xiàn)。小麥中已經(jīng)克隆的功能基因相對較少，如何利用功能標(biāo)記輔助選擇將這些已克隆的功能基因用于育種是當(dāng)務(wù)之急。雖然國內(nèi)有關(guān)親本基因型檢測的報(bào)道不少，但利用功能標(biāo)記輔助選擇成功選育小麥品種還鮮有報(bào)道。加強(qiáng)對現(xiàn)有功能標(biāo)記的利用，特別是育種親本中占比較低的優(yōu)異等位變異的利用對小麥改良有重要意義。本研究中與產(chǎn)量相關(guān) 的KASP標(biāo) 記TaGASR、TaMoc-2433、TaGS2B1＿1936、GS5-2334、TaGW2-6A，與品質(zhì)相關(guān)的KASP標(biāo)記GluD1＿4777、Zds-A1＿SNP、Pds-B1＿2002，與抗性相關(guān)的KASP標(biāo)記snp3BS-8、Sbmp＿6061、Lr68-2、C6K2C1、Sr2K3、TaSdr-B1在檢測的94份材料中優(yōu)異等位變異占比均較低，可作為未來小麥分子育種應(yīng)用的重要方向。

SNP是基因組中最豐富的變異類型，是未來分子標(biāo)記利用的方向，隨著越來越多功能基因被克隆，KASP功能標(biāo)記數(shù)量也會逐步增加。KASP是檢測SNP最簡便靈活的技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用。除LGC公司專用的檢測儀器外，熒光定量PCR儀、熒光酶標(biāo)儀等均可用于檢測KASP標(biāo)記。2019年KASP功能標(biāo)記數(shù)量已達(dá)124個(gè)［4］，Zhao［5］、Zhang［9］等 分 別 選 擇 了47個(gè) 和44個(gè)KASP標(biāo)記，本研究選用了42個(gè)標(biāo)記，這是因?yàn)樾←溁蚪M的復(fù)雜性導(dǎo)致將SNP轉(zhuǎn)化成KASP標(biāo)記相對比較困難［15］。已開發(fā)的KASP標(biāo)記可能還存在假陽性等問題［3］，部分KASP標(biāo)記的檢測結(jié)果不盡如人意，隨著KASP標(biāo)記開發(fā)和應(yīng)用的成熟，這些問題都有望得到解決［10，15］。