• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    籽粒高效特異性表達(dá)啟動(dòng)子的克隆與表達(dá)分析

    2021-06-09 03:45:16王美華高潔李玉蓮張淑娟宋國(guó)琦張榮志李瑋李吉虎李根英
    山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年5期
    關(guān)鍵詞:胚乳元件籽粒

    王美華,高潔,李玉蓮,張淑娟,宋國(guó)琦,張榮志,李瑋,李吉虎,李根英

    (山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/農(nóng)業(yè)部黃淮北部小麥生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/小麥玉米國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室,山東 濟(jì)南 250100)

    啟動(dòng)子是一段位于基因上游能夠與RNA聚合酶結(jié)合的DNA序列,也是RNA聚合酶的識(shí)別和結(jié)合序列,CAAT-box和TATA-box是啟動(dòng)子的典型特征。啟動(dòng)子上游的順式作用元件是轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),也是決定轉(zhuǎn)錄激活和抑制關(guān)鍵因子,因此啟動(dòng)子是調(diào)控基因表達(dá)的重要元件[1]。啟動(dòng)子分為組成型啟動(dòng)子、組織或器官特異性啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子[2]。組成型啟動(dòng)子調(diào)控下的基因,在不同組織器官中沒(méi)有明顯差異。植物中最常使用的組成型啟動(dòng)子是花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子[3]、玉米的泛素蛋白(ubiquitin)啟動(dòng)子[4]、水稻的肌動(dòng)蛋白(actin)啟動(dòng)子等[5]。組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的外源基因在整株中表達(dá),而有些器官人們并不想讓它表達(dá)外源蛋白,因?yàn)楫愒吹鞍踪|(zhì)或代謝產(chǎn)物的積累容易打破植物原有的生理生化平衡,影響植株正常生長(zhǎng),有些產(chǎn)物甚至有毒,造成植物死亡。另外,同一種啟動(dòng)子用于多個(gè)外源基因的驅(qū)動(dòng),可能引起基因沉默或共抑制現(xiàn)象[6]。因此,尋找多種類型的組織特異性啟動(dòng)子,減少組成型啟動(dòng)子的使用是科學(xué)家一直努力的方向。

    組織特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的基因一般在根、莖、葉、果實(shí)和種子等某一個(gè)特異性的器官組織中特異表達(dá)。隨著基因工程的發(fā)展,人們從禾谷類作物中克隆了許多種子特異性啟動(dòng)子,并將它們應(yīng)用于禾谷類籽粒品質(zhì)的改良之中。應(yīng)用較多的是來(lái)源于普通小麥的高分子量麥谷蛋白亞基1DX5、Bx17和水稻的G1t等[7-9]。但這些啟動(dòng)子的啟動(dòng)外源基因表達(dá)活性存在差異,不能滿足基因工程的需要,而且在需要多基因串聯(lián)時(shí),如果利用同一啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)不同的基因表達(dá),很容易導(dǎo)致基因沉默。本研究擬尋找轉(zhuǎn)錄效率更高的種子特異性啟動(dòng)子,用于提高目標(biāo)基因的表達(dá),改良禾谷類植物的加工和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    質(zhì)粒pGEM-Teasy和pCAMBIA3301購(gòu)自長(zhǎng)沙贏潤(rùn)生物技術(shù)有限公司;質(zhì)粒和轉(zhuǎn)基因小麥基因組DNA的提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;配制培養(yǎng)基所需無(wú)機(jī)鹽、維生素、抗生素以及激素、GUS染色所需藥品購(gòu)自Sigma-Aldrich中國(guó)公司;農(nóng)桿菌菌株購(gòu)自北京華越洋生物科技有限公司;PCR擴(kuò)增所需的Pfu、rTaq酶購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

    用于克隆胚乳特異性啟動(dòng)子(glo啟動(dòng)子)的燕麥品種為四倍體大燕麥,由張家口農(nóng)業(yè)科學(xué)院楊才研究員提供;用于基因轉(zhuǎn)化的小麥品種為Fielder。

    1.2 引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增

    采用DNA提取試劑盒從黑暗中萌發(fā)的燕麥幼苗中提取基因組DNA,用作擴(kuò)增啟動(dòng)子的模版,擴(kuò)增引物根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的參考序列AY795082進(jìn)行設(shè)計(jì),上游引物5′-CGAAGCTTTGGAAAGTCATTTTGCCTC-3′,下游引物5′-GCCCATGGTAGATTGTAGAAGGTGGATTGG-3′(劃線處分別為Hin dⅢ和NcoⅠ的酶切位點(diǎn))。PCR反應(yīng)體系(20μL):基因組DNA(50 ng/μL)1μL,上、下游引物(10 pmol/L)各2 μL,dNTPs(250μmol/L)2μL,10×buffer(50 mmol/L KCl,10 mmol/L Tris-HCl,1.5 mmol/L MgCl2,pH 8.3)2μL,Pfu高保真酶1μL,水10 μL。PCR擴(kuò)增程序:94℃3 min;94℃45 s,60℃45 s,72℃1 min,36個(gè)循環(huán);72℃10 min。PCR產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠中分離,EB染色后進(jìn)行紫外觀察并拍照保存。

    1.3 基因轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)

    轉(zhuǎn)化普通小麥參考Zhang等[10]的方法,PCR檢測(cè)所用引物為:上游引物5′-GGTCACTCATTACGGCAAAGT-3′,下游引物5′-GACGACCAAAGCCAGTAAAGT-3′。PCR反應(yīng)體系(20 μL):基因組DNA(50 ng/μL)1μL,上、下游引物(10 pmol/L)各2μL,dNTPs(250μmol/L)2μL,10×buffer(50 mmol/L KCl,10 mmol/L Tris-HCl,1.5 mmol/L MgCl2,pH 8.3)2μL,rTaq高保真酶1μL,水10μL。PCR擴(kuò)增程序:94℃3 min;94℃30 s,58℃30 s,72℃45 s,36個(gè)循環(huán);72℃8 min。PCR產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠中電泳分離,EB染色后進(jìn)行紫外觀察并拍照保存。

    1.4 不同部位GUS基因表達(dá)活性分析

    GUS組織染色液的配制:0.2 mol/L磷酸鈉緩沖液100 mL;0.1 mol/L亞鐵氰化鉀和0.1 mol/L鐵氰化鉀各1 mL;0.5 mol/L Na2-EDTA 8 mL;已溶于400μL DMSO中的200 mg X-gluc;水90 mL。

    GUS組織染色:待轉(zhuǎn)基因植株開花后兩周,挑選PCR鑒定為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因苗,取其部分籽粒、葉和根分別裝入5 mL離心管中,用GUS染色液完全浸沒(méi),37℃振蕩過(guò)夜,次日用70%乙醇沖洗3次,觀察GUS基因表達(dá)強(qiáng)度。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 胚乳特異性啟動(dòng)子的克隆

    胚乳特異性啟動(dòng)子大小約960 bp(圖1),將其與pGEM-Teasy載體進(jìn)行連接,含有該啟動(dòng)子的重組載體命名為pTglo。

    圖1 glo啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增

    將獲得的啟動(dòng)子序列與已報(bào)道序列(AY795082)進(jìn)行比對(duì),相似性達(dá)99%。兩個(gè)序列之間存在9個(gè)SNPs,其中在85 bp處A變?yōu)镚,364 bp處T變?yōu)锳,369 bp處A變?yōu)門,620 bp處發(fā)生A堿基的插入,640 bp處T變?yōu)镃,701 bp和788 bp處G變?yōu)锳,858 bp處T變?yōu)镃,961 bp處C變?yōu)锳(圖2)。對(duì)啟動(dòng)子組成元件進(jìn)行分析表明,該啟動(dòng)子含有胚乳特異表達(dá)所必須的5個(gè)Skn-1(GTCAT)基序,其中3個(gè)位于正鏈上,分別在第7、235、873 bp處,2個(gè)位于負(fù)鏈上,分別在第176 bp和551 bp處(綠色覆蓋并加邊框的區(qū)域)。在啟動(dòng)子的正鏈第622 bp和830 bp處存在胚乳表達(dá)相關(guān)的順式調(diào)控元件GCN4(加框部分)。在啟動(dòng)子的正鏈550 bp和負(fù)鏈869 bp處有兩個(gè)O2位點(diǎn),曾在玉米中被驗(yàn)證為醇溶蛋白的代謝順式調(diào)控元件(紅色斜體序列)。在啟動(dòng)子的869 bp處有一個(gè)回文結(jié)構(gòu)ACATGTCATCATGT,該序列是胚乳特異表達(dá)所必需的。這些結(jié)構(gòu)元件與啟動(dòng)子的活性是否存在聯(lián)系,還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。除了上述與胚乳特異性表達(dá)有關(guān)的元件,該啟動(dòng)序列中還有許多與逆境響應(yīng)有關(guān)的序列元件,包括負(fù)鏈573 bp處有一個(gè)ABA順式響應(yīng)元件ABRE(紅色字母部分);正鏈825 bp處有一個(gè)赤霉素順式響應(yīng)元件(藍(lán)色字母部分);正鏈561 bp處有一個(gè)TC-rich重復(fù)序列(灰色覆蓋部分),該序列在煙草中是逆境和防御反應(yīng)的順式作用元件;負(fù)鏈第725 bp處有一個(gè)水楊酸反應(yīng)順式調(diào)控元件TCA-element(綠色覆蓋部分);正鏈的694 bp和負(fù)鏈的697 bp處各有一個(gè)TGACG-motif,該序列在大麥中與茉莉酸的順式調(diào)控有關(guān)。這些與抗逆有關(guān)的結(jié)構(gòu)單元的存在或許與燕麥的高度抗逆性有關(guān)。

    2.2 表達(dá)載體構(gòu)建

    為了驗(yàn)證新克隆的啟動(dòng)子與已報(bào)道的glo啟動(dòng)子啟動(dòng)后續(xù)基因表達(dá)強(qiáng)度的差異,委托生工生物工程(上海)股份有限公司對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中提供的glo啟動(dòng)子序列(AY795082)進(jìn)行人工合成,并直接克隆到質(zhì)粒pCAMBIA3301的Hin dⅢ和NcoⅠ酶切位點(diǎn)之間,完成的重組質(zhì)粒命名為 pGloUdiA1。

    將從大燕麥中新克隆到的glo啟動(dòng)子序列利用Hin dⅢ和NcoⅠ從pTglo上切下,電泳分離并做凝膠回收后與經(jīng)過(guò)同樣酶切的pCAMBIA3301大片段進(jìn)行連接,PCR鑒定陽(yáng)性克隆子(圖3)。

    挑選部分陽(yáng)性克隆子進(jìn)行酶切鑒定(圖4),并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證,完成的重組質(zhì)粒命名為pGloUdiA2,基因表達(dá)框見(jiàn)圖5。

    選用載有GUS基因但沒(méi)有啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體pCAMBIA1381xb作為陰性對(duì)照。利用GUS基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為616 bp(圖6)。PCR結(jié)果顯示,經(jīng)過(guò)篩選后最終獲得轉(zhuǎn)pGloUdiA1、pGloUdiA2和pCAMBIA1381xb的陽(yáng)性小麥植株分別為8、12、5個(gè)。

    圖3 PCR鑒定陽(yáng)性克隆子

    圖4 陽(yáng)性克隆子的酶切鑒定

    圖5 pGloUdiA2的表達(dá)框結(jié)構(gòu)

    圖6 轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定

    2.3 基因特異性表達(dá)檢測(cè)

    GUS染色結(jié)果顯示,無(wú)論是轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pGloUdiA1還是pGloUdiA2,其根和葉中都無(wú)藍(lán)色信號(hào)出現(xiàn)(圖7),與轉(zhuǎn)化pCAMBIA1381xb的陰性對(duì)照表現(xiàn)一致。但在轉(zhuǎn)化pGloUdiA1和pGloUdiA2的小麥籽粒中都有藍(lán)色信號(hào)出現(xiàn)(圖8),說(shuō)明該啟動(dòng)子具有良好的組織特異性。轉(zhuǎn)化pGloUdiA2的籽粒中藍(lán)色信號(hào)強(qiáng)度大約是轉(zhuǎn)化pGloUdiA1的5倍,表明新克隆的glo啟動(dòng)子序列的基因表達(dá)活性更強(qiáng)。轉(zhuǎn)化陰性對(duì)照質(zhì)粒pCAMBIA1381xb的籽粒中沒(méi)有觀察到藍(lán)色信號(hào),說(shuō)明GUS基因表達(dá)差異是由啟動(dòng)子的表達(dá)所造成的。新克隆glo啟動(dòng)子序列的高效啟動(dòng)活性和高度的組織特異性表達(dá)特性為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良小麥籽粒性狀提供了良好的基礎(chǔ)材料。

    圖7 轉(zhuǎn)基因植株根和葉的GUS染色

    圖8 轉(zhuǎn)基因小麥植株的籽粒GUS染色

    3 討論與結(jié)論

    啟動(dòng)子是調(diào)控基因表達(dá)的重要元件,本研究利用已經(jīng)報(bào)道的燕麥啟動(dòng)子序列作為參考序列,從我國(guó)四倍體燕麥中克隆了燕麥球蛋白基因新的啟動(dòng)子序列,經(jīng)過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)新克隆的啟動(dòng)子序列長(zhǎng)960 bp,與參考序列AY795082存在9個(gè)SNPs。對(duì)該啟動(dòng)子組成元件進(jìn)行分析表明,該啟動(dòng)子含有胚乳特異表達(dá)所必須的5個(gè)Skn-1(GTCAT)基序,其中3個(gè)位于正鏈上,2個(gè)位于負(fù)鏈上;在啟動(dòng)子的正鏈第622 bp和830 bp處存在胚乳表達(dá)相關(guān)的順式調(diào)控元件GCN4;在啟動(dòng)子的正鏈550 bp和負(fù)鏈869 bp處有兩個(gè)O2位點(diǎn),曾在玉米中被驗(yàn)證為醇溶蛋白代謝順式調(diào)控元件;在啟動(dòng)子的869 bp處有一個(gè)回文結(jié)構(gòu)ACATGTCATCATGT,該序列是胚乳特異表達(dá)所必需的。利用上述啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá),結(jié)果表明該啟動(dòng)子啟動(dòng)功能基因表達(dá)的強(qiáng)度約為參考序列的5倍,為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良小麥籽粒性狀提供了良好的基因表達(dá)驅(qū)動(dòng)元件。

    猜你喜歡
    胚乳元件籽粒
    籽粒莧的飼用價(jià)值和高產(chǎn)栽培技術(shù)
    籽粒莧的特性和種植技術(shù)
    胚乳切割與置換對(duì)小麥種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響
    玉米機(jī)械脫粒籽粒含水量與破碎率的相關(guān)研究
    商麥1619 籽粒灌漿的特性
    為什么種子含有豐富的營(yíng)養(yǎng)?
    QFN元件的返工指南
    在新興產(chǎn)業(yè)看小元件如何發(fā)揮大作用
    寶馬i3高電壓元件介紹(上)
    Cu4簇合物“元件組裝”合成及其結(jié)構(gòu)與電催化作用
    欧美又色又爽又黄视频| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲精华国产精华精| 精品无人区乱码1区二区| 精品久久久久久久久久免费视频| 精品不卡国产一区二区三区| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 一夜夜www| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 黑人欧美特级aaaaaa片| 欧美激情久久久久久爽电影| 久久久久久九九精品二区国产| 成人av一区二区三区在线看| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产精品,欧美在线| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 日本免费a在线| 亚洲成人久久爱视频| 色尼玛亚洲综合影院| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 国产乱人视频| 国产三级黄色录像| 美女 人体艺术 gogo| 免费在线观看日本一区| 老熟妇仑乱视频hdxx| 波多野结衣高清作品| 男插女下体视频免费在线播放| 国产精品 欧美亚洲| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 欧美在线黄色| 日本 欧美在线| 亚洲人成网站在线播| www日本在线高清视频| 国产三级在线视频| 国产高清有码在线观看视频| 99久久成人亚洲精品观看| 国产乱人伦免费视频| 啦啦啦免费观看视频1| 国产精品女同一区二区软件 | 日韩欧美精品免费久久 | 老熟妇乱子伦视频在线观看| 99久久精品热视频| 男插女下体视频免费在线播放| 久久久久精品国产欧美久久久| h日本视频在线播放| 男女下面进入的视频免费午夜| 两个人视频免费观看高清| 少妇的丰满在线观看| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 男人舔女人下体高潮全视频| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 黄色丝袜av网址大全| 亚洲专区国产一区二区| 国产av不卡久久| 麻豆国产av国片精品| 天堂网av新在线| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 高清日韩中文字幕在线| 日韩亚洲欧美综合| 欧美日本视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 男女之事视频高清在线观看| 久久久国产成人精品二区| 一本综合久久免费| 国产主播在线观看一区二区| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产成人a区在线观看| 精品国产亚洲在线| 90打野战视频偷拍视频| 色av中文字幕| 九九在线视频观看精品| 一二三四社区在线视频社区8| 给我免费播放毛片高清在线观看| 午夜精品一区二区三区免费看| 在线天堂最新版资源| 美女黄网站色视频| 美女cb高潮喷水在线观看| 两个人看的免费小视频| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 国产精品免费一区二区三区在线| 亚洲欧美日韩高清专用| 91在线观看av| 国产一区二区在线观看日韩 | 国产精品电影一区二区三区| 欧美又色又爽又黄视频| a级毛片a级免费在线| 国产中年淑女户外野战色| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 在线视频色国产色| 成人无遮挡网站| 亚洲天堂国产精品一区在线| 亚洲专区中文字幕在线| or卡值多少钱| 亚洲国产中文字幕在线视频| 成年女人看的毛片在线观看| 久久久久久大精品| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 精品福利观看| 十八禁网站免费在线| 99在线视频只有这里精品首页| 两个人看的免费小视频| 亚洲国产精品合色在线| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 高清毛片免费观看视频网站| 中文字幕av在线有码专区| 日本五十路高清| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲久久久久久中文字幕| 在线观看66精品国产| 亚洲av免费在线观看| 国产真实乱freesex| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲精品日韩av片在线观看 | 9191精品国产免费久久| 午夜影院日韩av| 91在线精品国自产拍蜜月 | 国产黄a三级三级三级人| 美女 人体艺术 gogo| 搞女人的毛片| 97超视频在线观看视频| 欧美黑人巨大hd| 69av精品久久久久久| 男女床上黄色一级片免费看| 欧美成人性av电影在线观看| 色视频www国产| 免费人成在线观看视频色| 国产精品久久久久久久电影 | 欧美中文日本在线观看视频| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 亚洲中文字幕日韩| 热99在线观看视频| 91在线精品国自产拍蜜月 | 国产午夜福利久久久久久| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 观看美女的网站| 99久久精品国产亚洲精品| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 美女大奶头视频| 精品久久久久久久毛片微露脸| 成人性生交大片免费视频hd| 九色国产91popny在线| av天堂中文字幕网| 一级a爱片免费观看的视频| 有码 亚洲区| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲天堂国产精品一区在线| 精品福利观看| 国产成人系列免费观看| 亚洲av电影在线进入| 一级黄片播放器| 国产亚洲精品av在线| 久久久久久九九精品二区国产| 国产精品,欧美在线| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产精品 欧美亚洲| 欧美乱码精品一区二区三区| netflix在线观看网站| 看片在线看免费视频| 伊人久久精品亚洲午夜| 日本精品一区二区三区蜜桃| 又爽又黄无遮挡网站| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产国拍精品亚洲av在线观看 | 国产精品亚洲一级av第二区| 欧美性感艳星| 国产精品一区二区免费欧美| 丁香欧美五月| 欧美日韩一级在线毛片| 无限看片的www在线观看| 国产精品久久久人人做人人爽| 一本一本综合久久| 99久久九九国产精品国产免费| 99热只有精品国产| 中出人妻视频一区二区| 一进一出抽搐gif免费好疼| 极品教师在线免费播放| 国产成人a区在线观看| 国产男靠女视频免费网站| 啪啪无遮挡十八禁网站| netflix在线观看网站| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 99视频精品全部免费 在线| 久久久久久久午夜电影| 精品久久久久久久久久久久久| 一进一出抽搐gif免费好疼| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 看免费av毛片| 99久久精品热视频| 51国产日韩欧美| 少妇高潮的动态图| a级毛片a级免费在线| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 婷婷精品国产亚洲av在线| 亚洲精华国产精华精| 国产激情偷乱视频一区二区| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 99久久精品国产亚洲精品| 又紧又爽又黄一区二区| 免费大片18禁| 国产av麻豆久久久久久久| 3wmmmm亚洲av在线观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 手机成人av网站| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 亚洲av电影不卡..在线观看| 欧美又色又爽又黄视频| a在线观看视频网站| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 久久精品国产自在天天线| 久久久国产成人免费| 日韩国内少妇激情av| 久久中文看片网| e午夜精品久久久久久久| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 淫秽高清视频在线观看| 天堂网av新在线| 国产真人三级小视频在线观看| 真人一进一出gif抽搐免费| 欧美精品啪啪一区二区三区| 欧美性猛交黑人性爽| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 好男人电影高清在线观看| 国产精品久久视频播放| 9191精品国产免费久久| 少妇的逼好多水| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 99国产极品粉嫩在线观看| 高清毛片免费观看视频网站| 亚洲av五月六月丁香网| 俄罗斯特黄特色一大片| 高潮久久久久久久久久久不卡| 成人三级黄色视频| 国产淫片久久久久久久久 | 淫妇啪啪啪对白视频| 日韩欧美 国产精品| 亚洲av一区综合| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲国产色片| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 极品教师在线免费播放| 怎么达到女性高潮| 丰满人妻一区二区三区视频av | 91久久精品电影网| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产乱人伦免费视频| 久久久精品欧美日韩精品| 99热这里只有是精品50| 国产精品久久久人人做人人爽| 桃色一区二区三区在线观看| 午夜福利高清视频| tocl精华| 欧美日韩综合久久久久久 | 亚洲乱码一区二区免费版| 久久久色成人| 久久香蕉精品热| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 欧美乱色亚洲激情| a级毛片a级免费在线| 男女那种视频在线观看| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 国产视频内射| 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲精品久久国产高清桃花| 又黄又粗又硬又大视频| 少妇的逼好多水| 国产高清videossex| 亚洲精品日韩av片在线观看 | 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 亚洲av熟女| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 韩国av一区二区三区四区| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 日本三级黄在线观看| 国产男靠女视频免费网站| 亚洲最大成人手机在线| 国产精品亚洲一级av第二区| 久久精品91无色码中文字幕| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 亚洲精品亚洲一区二区| 久久九九热精品免费| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美 | h日本视频在线播放| 国产高清videossex| 国产一区二区三区视频了| 国产单亲对白刺激| 国内精品久久久久久久电影| 国产欧美日韩一区二区精品| 亚洲欧美日韩高清专用| 成人无遮挡网站| 岛国在线免费视频观看| 毛片女人毛片| 麻豆成人午夜福利视频| 成年免费大片在线观看| 欧美一级毛片孕妇| 国产色爽女视频免费观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产老妇女一区| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产精品,欧美在线| 嫩草影院精品99| 俺也久久电影网| 欧美黄色淫秽网站| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 国产黄片美女视频| 亚洲真实伦在线观看| 宅男免费午夜| 极品教师在线免费播放| 亚洲精品久久国产高清桃花| 免费在线观看亚洲国产| 中文在线观看免费www的网站| 亚洲成av人片在线播放无| 黄色成人免费大全| 日韩精品青青久久久久久| 国产免费av片在线观看野外av| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 一边摸一边抽搐一进一小说| 两人在一起打扑克的视频| 真实男女啪啪啪动态图| 日本熟妇午夜| 久久精品人妻少妇| 亚洲国产精品999在线| 免费电影在线观看免费观看| 免费观看人在逋| 麻豆成人午夜福利视频| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 婷婷精品国产亚洲av在线| 亚洲欧美日韩无卡精品| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 高清毛片免费观看视频网站| 国产v大片淫在线免费观看| 国产精品野战在线观看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 丰满的人妻完整版| 午夜福利免费观看在线| 国产精华一区二区三区| 91麻豆av在线| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲电影在线观看av| 热99在线观看视频| 亚洲av一区综合| 成人性生交大片免费视频hd| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 丰满人妻一区二区三区视频av | 搡老熟女国产l中国老女人| 中出人妻视频一区二区| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 色在线成人网| 一夜夜www| 精品久久久久久成人av| 又黄又爽又免费观看的视频| av欧美777| 亚洲五月天丁香| 久久久久精品国产欧美久久久| 日韩中文字幕欧美一区二区| 男女床上黄色一级片免费看| 男插女下体视频免费在线播放| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产极品精品免费视频能看的| 欧美黄色片欧美黄色片| tocl精华| 日韩欧美在线乱码| 国产男靠女视频免费网站| 偷拍熟女少妇极品色| 少妇的丰满在线观看| 成人永久免费在线观看视频| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 午夜亚洲福利在线播放| 精品一区二区三区视频在线 | 久久精品91蜜桃| 岛国视频午夜一区免费看| 一个人观看的视频www高清免费观看| 亚洲第一电影网av| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚洲熟妇熟女久久| 少妇人妻精品综合一区二区 | 亚洲精品在线美女| 九九热线精品视视频播放| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产午夜精品论理片| 亚洲乱码一区二区免费版| 国产伦人伦偷精品视频| 老司机福利观看| 国产视频一区二区在线看| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 操出白浆在线播放| 午夜日韩欧美国产| 日韩人妻高清精品专区| 国产精品三级大全| 在线观看免费午夜福利视频| 免费人成在线观看视频色| 免费在线观看影片大全网站| 国产亚洲欧美在线一区二区| 色视频www国产| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产私拍福利视频在线观看| 日韩亚洲欧美综合| 波多野结衣巨乳人妻| 精品久久久久久,| 日韩欧美精品免费久久 | www.熟女人妻精品国产| 国产精品1区2区在线观看.| 国产私拍福利视频在线观看| 美女cb高潮喷水在线观看| 精品久久久久久久久久免费视频| 免费在线观看影片大全网站| 99国产综合亚洲精品| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产一级毛片七仙女欲春2| 久久久久久大精品| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲无线观看免费| 国产精品久久久人人做人人爽| 成年人黄色毛片网站| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| av天堂在线播放| 国产精品 国内视频| 淫妇啪啪啪对白视频| 日本免费一区二区三区高清不卡| 91久久精品国产一区二区成人 | 欧美最新免费一区二区三区 | 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲精品粉嫩美女一区| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 在线a可以看的网站| 村上凉子中文字幕在线| 少妇人妻一区二区三区视频| 午夜福利在线观看吧| 国产精品一区二区免费欧美| 欧美日本亚洲视频在线播放| 日本 欧美在线| 免费人成在线观看视频色| 久久国产乱子伦精品免费另类| 亚洲精品影视一区二区三区av| 男女那种视频在线观看| 亚洲真实伦在线观看| a在线观看视频网站| 国产午夜精品论理片| 在线免费观看的www视频| 在线免费观看不下载黄p国产 | 亚洲欧美日韩卡通动漫| 脱女人内裤的视频| 一级a爱片免费观看的视频| 成人无遮挡网站| 在线观看舔阴道视频| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 国产精品亚洲美女久久久| 日本精品一区二区三区蜜桃| 精品午夜福利视频在线观看一区| 日本黄大片高清| 麻豆一二三区av精品| avwww免费| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 一本精品99久久精品77| 国产真实伦视频高清在线观看 | 亚洲美女黄片视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产精品爽爽va在线观看网站| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 国产精品一及| 欧美3d第一页| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产成人影院久久av| 又黄又爽又免费观看的视频| 久久久精品欧美日韩精品| 精品国内亚洲2022精品成人| 亚洲片人在线观看| 99热6这里只有精品| 国产老妇女一区| 欧美在线一区亚洲| 少妇的逼水好多| 波多野结衣高清作品| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲真实伦在线观看| 毛片女人毛片| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲不卡免费看| 久久精品人妻少妇| 真人一进一出gif抽搐免费| 99国产精品一区二区三区| 亚洲精品粉嫩美女一区| 久久伊人香网站| 久久人人精品亚洲av| 日本一二三区视频观看| 老司机深夜福利视频在线观看| 五月玫瑰六月丁香| 亚洲avbb在线观看| 日韩欧美国产一区二区入口| tocl精华| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 波多野结衣巨乳人妻| 国产精品,欧美在线| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产男靠女视频免费网站| 午夜激情福利司机影院| 999久久久精品免费观看国产| 搡老妇女老女人老熟妇| 欧美最黄视频在线播放免费| 国产高清激情床上av| 首页视频小说图片口味搜索| 国产高清视频在线播放一区| 亚洲五月天丁香| 日韩国内少妇激情av| 性色av乱码一区二区三区2| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产精品免费一区二区三区在线| 国产亚洲欧美98| 一区二区三区高清视频在线| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产精品精品国产色婷婷| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 午夜福利18| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲精品久久国产高清桃花| 99国产精品一区二区三区| or卡值多少钱| 中文字幕久久专区| 一进一出好大好爽视频| 亚洲国产精品久久男人天堂| 亚洲国产精品999在线| x7x7x7水蜜桃| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 听说在线观看完整版免费高清| av黄色大香蕉| 亚洲精品成人久久久久久| bbb黄色大片| 亚洲电影在线观看av| 男女视频在线观看网站免费| 激情在线观看视频在线高清| 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲成av人片在线播放无| 国产精品三级大全| 欧美最黄视频在线播放免费| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 欧美国产日韩亚洲一区| 在线观看一区二区三区| 成年女人毛片免费观看观看9| 欧美又色又爽又黄视频| 成人性生交大片免费视频hd| 人妻夜夜爽99麻豆av| 一级作爱视频免费观看| 亚洲色图av天堂| 欧美一区二区亚洲| 麻豆一二三区av精品| 国产欧美日韩精品亚洲av| 在线播放国产精品三级| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 欧美丝袜亚洲另类 | 久9热在线精品视频| 国产精品久久久久久久电影 | 免费看光身美女| 国产伦人伦偷精品视频| 国产探花极品一区二区| 免费大片18禁| 国产熟女xx| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 99久久99久久久精品蜜桃| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 久久久精品大字幕| 国产精品一区二区三区四区久久| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 长腿黑丝高跟| 啦啦啦韩国在线观看视频| 波多野结衣高清作品| 国产成人a区在线观看| www.999成人在线观看| 久久久精品大字幕| 深夜精品福利| 啦啦啦韩国在线观看视频| 深夜精品福利| 国产在视频线在精品| 久久亚洲精品不卡| 亚洲国产精品久久男人天堂| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 99热只有精品国产| xxx96com| 亚洲激情在线av| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 97碰自拍视频| 美女 人体艺术 gogo| 国产极品精品免费视频能看的| 久久性视频一级片| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲av免费高清在线观看| 国产视频一区二区在线看| 成人无遮挡网站| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 成人无遮挡网站| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产国拍精品亚洲av在线观看 | 国产在线精品亚洲第一网站| 国产免费av片在线观看野外av| 国产精品 欧美亚洲| 99精品欧美一区二区三区四区| 看免费av毛片| 国产一区二区激情短视频| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产av不卡久久| 国产成人a区在线观看|