小麥PLT2基因的克隆及功能分析

劉會文，宋少帥，尹華燕，賀小彥，劉家斌，林琪，穆平

（青島農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，山東 青島 266109）

小麥是世界上的重要糧食作物之一，保持小麥高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)對保障我國糧食安全和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。鹽脅迫是自然界主要非生物逆境之一，嚴重影響小麥生長和發(fā)育［1］。鹽脅迫對植株的危害主要表現(xiàn)在滲透脅迫、離子毒性和氧化脅迫［2］。土壤鹽分過多導致細胞離子失衡引發(fā)滲透脅迫，而這種離子失衡又進而引發(fā)活性氧的產(chǎn)生，造成氧化脅迫［3］。

目前已發(fā)現(xiàn)的糖轉運蛋白分為三類：單糖轉運蛋白（monosaccharide transporters，MSTs）、蔗糖轉運蛋白（sucrose transporters，SUTs）、SWEET蛋白（sugars will eventually be exported transporters）。SWEET蛋白為新發(fā)現(xiàn)的蛋白，含有MtN3／saliva保守結構域，屬于MtN3家族。除SWEET外，大多數(shù)已鑒定的糖轉運蛋白含有MFS（major facilitator superfamily）保守結構域，屬于協(xié)助擴散超家族MFS中的糖轉運子亞族［4-6］。該亞族蛋白具有疏水性的特點。研究表明，糖轉運蛋白在維管束介導的糖運輸以及應答多種逆境脅迫中發(fā)揮作用［7，8］。Miao等［9］研究發(fā)現(xiàn)，在高鹽脅迫下油菜中BrSWEET11-LF和BrSWEET17-MF1的表達量均顯著提高。Feng等［10］發(fā)現(xiàn)在高溫、高鹽、低溫條件下番茄糖轉運蛋白家族成員在葉片、根等組織中的表達量明顯改變。擬南芥糖轉運蛋白基因受低溫、干旱和高鹽脅迫的誘導表達［11-13］。

本研究基于抗旱耐鹽小麥品種青麥6號轉錄組數(shù)據(jù)，篩選到一個鹽脅迫下差異表達的糖轉運蛋白基因序列，命名為TaPLT2。本研究擬通過對該基因的克隆與功能分析來探究小麥糖蛋白基因與耐鹽性的關系，為小麥耐鹽遺傳改良提供新的基因資源及理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

TaPLT2基因克隆及表達水平分析采用的試驗材料為耐鹽小麥青麥6號；基因多態(tài)性分析選用72份黃淮麥區(qū)冬小麥新品系。

1.2 TaPLT2的篩選

本研究根據(jù)實驗室自存的青麥6號鹽脅迫處理前后轉錄組數(shù)據(jù)（https://pan.baidu.com／s／1VEhmkf4n7qY7rw6JhG2tgA，提取碼1234），在差異倍數(shù)以及顯著水平兩個層次上進行篩選，設定閾值為且q-value＜0.005，篩選出不同處理時間點的差異表達基因。將所有差異表達基因按照差異表達倍數(shù)降序排列，并在NCBI網(wǎng)站上分別對差異表達倍數(shù)大的基因進行BLAST比對，篩掉前人研究過的基因，篩選出Traes＿2AS＿E158810C6基因，預測功能為糖轉運蛋白基因，命名為TaPLT2，并進行下一步基因克隆及后續(xù)研究。

1.3 TaPLT2基因的克隆及測序

將青麥6號幼苗按照TaKaRa公司的RNA提取試劑盒、cDNA反轉錄試劑盒說明書提取RNA并反轉為cDNA。采用Primer Premier V5.0軟件進行引物設計，引物見表1中cPLT2F／R，由擎科生物股份有限公司合成。采用TaKaRa公司的高保真酶進行TaPLT2基因擴增。PCR反應程序為98℃預變性3 min；98℃變性10 s，71℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)35次；72℃延伸10 min，12℃保存。擴增片段回收產(chǎn)物送擎科生物股份有限公司測序。將測序結果放入小麥全基因組數(shù)據(jù)庫進行比對，分析該基因在染色體中的位置、內(nèi)含子個數(shù)及拷貝序列數(shù)。

表1 所用引物

1.4 TaPLT2的生物信息學分析

根據(jù)克隆出的TaPLT2基因序列找到蛋白質編碼區(qū)（CDS），利用BioXM2.6翻譯成蛋白質。利用ExPASy網(wǎng)站在線工具ProtParam（https://web.expasy.org／protparam／）進行蛋白基本理化特性分析，包括氨基酸組成、相對分子量和理論pI值等；利用PROTCOM網(wǎng)站（http://www.softberry.com／berry.phtml？topic＝protcomppl＆group＝programs＆subgroup＝proloc）進行蛋白質的亞細胞定位；利用ProSWEETale工具（http://ca.expasy.org／tools／proSWEETale.html）進行蛋白質疏水性分析；利用TMpred工具（http://www.cbs.dtu.dk／services／TMHMM-2.0／）進行跨膜區(qū)和跨膜方向預測；通過ExPASy Proteomics Server系統(tǒng)中的軟件在線預測其功能性位點；利用CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov／Structure／cdd／wrpsb.cgi）進行蛋白質保守結構域分析；通過NCBI網(wǎng)站進行BLASTP比對，下載相似度較高的序列，結合MEGA 10.0對下載的序列構建NJ系統(tǒng)進化樹。

1.5 TaPLT2的表達模式分析

取青麥6號種子50粒，先用蒸餾水清洗干凈，再用75%酒精消毒5 min，最后用蒸餾水清洗至無酒精異味。將處理完成的小麥種子均勻平放在鋪有兩層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：光／暗為16 h／8 h，晝夜溫度為25℃／19℃。培養(yǎng)至兩葉一心期，用200 mmol／L的NaCl溶液脅迫處理0、24、48、72 h，3次重復；剪取脅迫處理后的小麥幼苗，液氮速凍，存放于-80℃超低溫冰箱中備用。用引物qPLT2F／R、βactinF／R（表1），采用TaKaRa公司的實時熒光定量試劑盒進行TaPLT2基因的表達模式分析，3次生物學重復。qRT-PCR反應程序：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，57℃退火延伸30 s，同時在退火過程中檢測熒光信號變化，共進行39個循環(huán)。

1.6 TaPLT2的多態(tài)性分析

挑選72份小麥材料飽滿一致的種子各60粒，消毒處理后于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至一葉一心時，剪取葉片，用CTAB法分別提取基因組DNA。采用引物gPLT2F／R（表1）對各品種TaPLT2基因組DNA序列進行擴增，測序由擎科生物股份有限公司完成。PCR反應程序為94℃預變性4 min；98℃變性10 s，60℃退火30 s，68℃延伸3 min，循環(huán)35次；68℃延伸10 min，12℃保存?；蚨鄳B(tài)性用DNAMAN軟件進行比對分析。

當小麥長到兩葉一心時，用200 mmol／L的NaCl溶液脅迫處理3、5 d后分別取樣，用刻度尺測量小麥根長、株高；用蒸餾水分別將小麥幼苗沖洗干凈，吸水紙吸干后裝入牛皮袋，于烘箱內(nèi)105℃殺青30 min后70℃烘干至恒重，測量干重；將烘干樣本置于組織破碎機中打成粉末，用1／10000天平稱取地上部約0.0500 g、根系約0.0200 g于消煮管中，加入5 mL HNO3，180℃消煮爐上恒溫消解60 min直至顏色消失，冷卻定容，過濾后用火焰光度計測量K＋、Na＋含量；參照蒽酮比色法［14］測定可溶性糖，稱取0.3 g樣品放入大試管中，加入15 mL蒸餾水，沸水浴20 min，冷卻，過濾入100 mL容量瓶中，用蒸餾水沖洗殘渣數(shù)次，定容至刻度。取提取液1.0 mL加蒽酮試劑5 mL，在沸水浴中煮10 min，取出冷卻，在620 nm波長下測定光密度，3次重復；從標準曲線上查出每毫升被測樣品液可溶性糖的含量，再計算出鮮樣中可溶性糖的平均值。

用SPSS和Microsoft Excel進行相關性分析。不同品種的耐鹽性差異采用各性狀指標的相對值進行比較，用鹽脅迫處理的測定值與對照組的測定值比較得到相對值。SNP位點與耐鹽性狀指標相關系數(shù)大于0.3表明有相關性［15］。為了消除單個指標帶來的片面性，用隸屬函數(shù)法［16，17］將各小麥材料的各耐鹽指標擴展到［0，1］閉區(qū)間內(nèi)，用下式分別計算各耐鹽指標的隸屬函數(shù)值：

2 結果與分析

2.1 TaPLT2基因的克隆

以青麥6號cDNA為模板，利用引物組合cPLT2F／R（表1）進行PCR擴增，得到大小為1 300 bp左右的單一條帶（圖1）。將目的片段回收、測序后，得到長度為1 385 bp的序列，開放閱讀框為1 155 bp，編碼385個氨基酸，將該基因命名為TaPLT2。

圖1 TaPLT2的擴增

2.2 TaPLT2生物信息學分析

分析表明，TaPLT2定位于2AS染色體，基因組序列全長2 194 bp，存在2個內(nèi)含子，在小麥染色體中為單拷貝。TaPLT2編碼385個氨基酸，丙氨酸（Ala）和亮氨酸（Leu）是占比最高的兩種氨基酸，分別達到10.0%和10.2%；負電荷殘基總數(shù)（Asp＋Glu）為27，正電荷殘基總數(shù)（Arg＋Lys）為33，相對分子質量42 269.99 Da，理論等電點為8.99。TaPLT2多肽鏈第250位的具有最高分值4.500，疏水性最強；第138位的具有最低分值-4.500，親水性最強，整條多肽鏈表現(xiàn)為疏水性（圖2A），因此可推斷TaPLT2是一種疏水性蛋白。其定位于細胞質，有7個跨膜結構域（圖2B），分析該多肽鏈的功能性位點發(fā)現(xiàn)多肽鏈含有糖轉運蛋白功能位點Sugar transport proteins signature 1（圖3）。

圖2 TaPLT2蛋白的親疏水性和跨膜區(qū)域

圖3 TaPLT2蛋白的功能性位點分析

將TaPLT2編碼的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLASTP對比，結果表明其與節(jié)節(jié)麥（XM＿020325583.2）、小苔草（SWLB＿01000017.1）、青 稞 （SDOW＿01000136.1）、大 麥 （AK＿363174.1）、高粱（XM＿002462974.2）、蘭花（KZ＿453008.1）、香蕉（PYDT＿01000002.1）、Ensete ventricosum（AMZH＿03009594.1）的糖轉運載體蛋白同源。利用DNAMAN軟件將TaPLT2氨基酸序列和其他物種的氨基酸序列進行多序列比對，結果顯示，該蛋白與其他物種蛋白的相似度為79%～99%，且都含有MFS＿STP結構域，屬于MFS家族的糖轉運子亞族（圖3—圖5）。

圖4 TaPLT2與其他物種氨基酸序列的多重比對

圖5 糖轉運蛋白系統(tǒng)進化樹

2.3 TaPLT2的表達模式分析

以不同處理青麥6號總RNA反轉錄的cDNA為模板進行實時熒光定量分析，結果顯示，TaPLT2的表達整體呈先升高后持平趨勢，表達量在鹽脅迫24 h時最高，為對照組的3.2倍，48 h及72 h時相對表達量大體保持一致（圖6）。表明TaPLT2基因受到鹽脅迫誘導。

圖6 TaPLT2基因的表達情況

2.4 TaPLT2序列多態(tài)性分析

分別以72個小麥品系的基因組DNA為模板，以表1中A基因組特異引物gPLT2F／R擴增TaPLT2基因組全長序列（外顯子＋內(nèi)含子）。經(jīng)測序及比對分析（圖7），72份材料存在一個SNP多態(tài)性位點，命名為TaPLT2-SNP1，位于TaPLT2基因1 326位，即基因第3個外顯子上存在T／C兩種多態(tài)性，氨基酸存在蘇氨酸／丙氨酸兩種情況，突變率為9.46%，通過對蛋白質親疏水性進行分析，該突變使基因親水性增加0.006。

2.5 TaPLT2-SNP1與耐鹽相關表型的關聯(lián)分析

由表2可以看出，鹽脅迫處理3 d和5 d的小麥根長、株高及干重顯著低于對照組；從滲透調(diào)節(jié)物質變化水平來看，鹽脅迫3 d的K＋含量顯著低于對照，鹽脅迫5 d的K＋含量與對照差異不顯著；鹽脅迫處理下的Na＋含量及可溶性糖含量均顯著高于對照組。

從表3可以看出，C變異與根長呈顯著負相關，并且隨著鹽處理時間的延長，相關性增大；C變異與株高無顯著相關性；鹽脅迫3 d時C變異與植株Na＋呈顯著正相關，鹽脅迫5 d時C變異與植株K＋呈顯著負相關；C變異與單株干重無顯著相關性，但相關系數(shù)隨處理時間增加而增大；C變異與可溶性糖含量呈極顯著正相關，與D值呈顯著正相關。

圖7 部分小麥品系TaPLT2基因SNP位點

表2 鹽脅迫對小麥相關性狀影響

表3 TaPLT2基因C變異與耐鹽性的相關關系

3 討論與結論

糖轉運蛋白在植物體中廣泛存在［18］，而小麥糖轉運蛋白基因在耐鹽方面的研究相對較少。本研究通過RT-PCR技術首次克隆出小麥TaPLT2基因的全長cDNA，cDNA全長為1 385 bp，開放閱讀框為1 155 bp，編碼385個氨基酸。通過對編碼氨基酸進行序列分析表明TaPLT2含有糖轉運功能部位且與節(jié)節(jié)麥、大麥、高粱的糖轉運蛋白序列高度同源，都含有MFS＿STP結構域，屬于MFS家族的糖轉運子亞族［19］。生物信息學分析顯示該蛋白具有疏水性，定位于細胞質且具有7個跨膜結構域。

研究表明，許多糖轉運蛋白基因家族成員都能響應鹽脅迫［20-23］。本研究結果顯示，TaPLT2基因受鹽脅迫誘導上調(diào)表達，在脅迫24 h后表達量達到最高，為對照組的3.2倍，這與Seo等［12］的研究結果一致，表明TaPLT2基因參與鹽脅迫的調(diào)控。高鹽分環(huán)境影響植物正常的新陳代謝和各項生理活動［24-27］。本研究同樣發(fā)現(xiàn)高鹽脅迫阻礙小麥植株根長及株高的伸長、干重的增加，提高小麥植株的可溶性糖含量及Na＋含量；鹽脅迫處理3 d的小麥植株K＋含量下降，而脅迫處理5 d的K＋含量與對照無異。這表明高鹽脅迫會阻礙小麥根長及株高的伸長、干物質的積累，提高植株Na＋及可溶性糖含量，影響植株K＋含量。

相關研究表明，植物耐鹽性與根長［28］、株高［29］、干重［30］、K＋、Na＋含量［31］和可溶性糖含量［32］存在相關性。D值作為通過隸屬函數(shù)法對所測性狀進行綜合分析所得的數(shù)據(jù)能避免單一性狀的局限性［15］。耐鹽基因多態(tài)性會對該耐鹽基因的耐鹽能力產(chǎn)生影響［33］。對TaPLT2基因在72個小麥品種中的序列多態(tài)性進行分析，發(fā)現(xiàn)TaPLT2基因的第1 326位即第3個外顯子處存在T／C兩種多態(tài)性，氨基酸存在蘇氨酸／丙氨酸兩種變異，72個品種的突變率為9.46%。通過相關性分析發(fā)現(xiàn)，C變異與根長呈顯著負相關，與可溶性糖含量呈極顯著正相關，推測C變異通過增加可溶性糖含量提高細胞滲透勢的方式來增強耐鹽性。C變異與D值呈顯著正相關，推測該多態(tài)性位點能夠影響TaPLT2基因的耐鹽性。