小麥面筋蛋白基因克隆及序列分析

牛志偉，汪曉璐，徐文競，劉愛峰，李豪圣，李洪振，韓冉，劉成，劉建軍

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所／農(nóng)業(yè)部黃淮北部小麥生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室／小麥玉米國家工程實驗室，山東 濟南 250100；2.煙臺大學(xué)生命科學(xué)院，山東 煙臺 264000；3.武城縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東 武城 253300）

小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪匾娜蠹Z食作物之一，其因出色的加工特性受到人類的青睞。小麥面粉常被加工成面包、饅頭和面條等，為人們提供了主要能量和營養(yǎng)。Osborne［1］根據(jù)溶解特性將小麥籽粒蛋白分為清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和麥谷蛋白4種類型，其中醇溶蛋白和麥谷蛋白統(tǒng)稱為面筋蛋白，約占小麥總蛋白的80%～85%，是小麥面筋的主要成分，決定著小麥的品質(zhì)特性［2］。小麥醇溶蛋白根據(jù)在酸性聚丙烯酰胺凝膠中遷移率分為α、β、γ和ω4種類型，其中，α和β類醇溶蛋白存在結(jié)構(gòu)同源性，往往被統(tǒng)稱為α類醇溶蛋白［3］。醇溶蛋白主要影響面團的延展性和黏性［4］。麥谷蛋白根據(jù)分子量大小可分為高分子量麥谷蛋白（HMW-GS）和低分子量麥谷蛋白（LMW-GS）。其中低分子量麥谷蛋白占全部麥谷蛋白的60%，決定著面團的強度和粘度，對面粉的加工品質(zhì)起著重要作用［5］。

乳糜瀉（celiac disease，CD）是一種自身免疫性疾病，是因攝入小麥、大麥或黑麥中的面筋蛋白而引發(fā)的慢性小腸炎癥性疾病，該病由Th1型細胞（T helper cell 1，Th1）介導(dǎo)并具有基因易感性。小麥α-和γ-醇溶蛋白內(nèi)存在多種肽段與CD誘發(fā)有關(guān)。迄今為止，已經(jīng)從普通小麥及其近緣物種中檢測到31種具有免疫活性的致乳糜瀉表位［6］，由9個核心區(qū)氨基酸組成。其中有5個高頻率免疫活性的抗原表位［7］，分別是DQ2.5-gliaγ1（PQQSFPEQQ）、DQ2.5-glia-α1（PFPQPQLPY）、DQ2.5-glia-α2（PQPQLPYPQ）、DQ2.5-glia-α3（FRPQQPYPQ）和DQ8-gliaα1（QGSFQPSQQ）。

濟南17、濟麥229和濟麥262的高分子量麥谷蛋白亞基分別為（1、7＋8和4＋12）、（1、7＋8和5＋10）和（1、4＋15和2＋12）。但是，三個品種的低分子量麥谷蛋白和醇溶蛋白尚未有相關(guān)信息。鑒于此，本研究對上述品種的低分子量麥谷蛋白和醇溶蛋白基因進行克隆和序列分析，以期發(fā)掘新的面筋蛋白等位基因，同時為小麥加工品質(zhì)的分子改良提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

優(yōu)質(zhì)強筋小麥品種濟南17和濟麥229以及抗旱節(jié)水小麥新品種濟麥262，由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物所小麥遺傳育種團隊育成并提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA提取 小麥基因組DNA的提取參照文獻［8］。

1.2.2 低分子量麥谷蛋白、α-和γ-醇溶蛋白基因克隆 利用表1引物對三個小麥品種的低分子量麥谷蛋白、α-和γ-醇溶蛋白基因進行克隆。

表1 基因克隆所需引物

PCR反應(yīng)體系為50μL，含有DNA模板50 ng，4種dNTP各200μmol·L-1，2×GC BufferⅠ25μL，上下游引物各0.2μmol·L-1，2.5 U Fastpfu DNA聚合酶。PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性20 s，55～65℃退火20 s，72℃延伸2 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，對目的片段進行切膠回收和純化，純化產(chǎn)物連接到pEASY-Blunt載體上，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。挑取單菌落并通過菌落PCR鑒定陽性克隆，送青島擎科生物技術(shù)有限公司進行雙向測序。

1.3 序列分析、CD毒性肽識別和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

用DNAMAN軟件進行基因結(jié)構(gòu)分析和氨基酸序列預(yù)測。根據(jù)van Herpen等［13］的方法識別克隆基因所編碼的5種主要的T-細胞毒性抗原表位，同時分析LGQGSFRPSQQN和LGQQQPFPPQQPYPQPQ毒性肽的分布［14］。在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載相關(guān)序列，用MEGA 6.0軟件（Neighbor-Joining法）構(gòu)建麥谷蛋白系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 低分子量麥谷蛋白的克隆及序列分析

利用Glu-A3F／R、Glu-B3F／R、Glu-D3F／R三對引物對濟南17、濟麥262和濟麥229基因組總DNA進行PCR擴增（圖1A）并測序，結(jié)果共獲得9個麥谷蛋白基因。三品種A位點PCR片段大小均為1 382 bp，其中包括ATG上游197 bp和TAA下游51 bp的序列。序列比對發(fā)現(xiàn)三個品種之間的擴增序列完全相同，且其編碼區(qū)序列與NCBI登錄號KJ152523.1序列完全一致。濟南17、濟麥262和濟麥229的B位點擴增片段大小分別為1 344、1 341 bp和1 195 bp，ATG上游均為174 bp片段，TAA下游分別為111 bp（濟麥262和濟南17）和106 bp片段（濟麥229）。序列比對發(fā)現(xiàn)濟南17和濟麥262的序列相似性較高，為99.5%，僅存在3個SNP和1個三堿基的插入／缺失。濟麥229與其他兩個品種之間的序列差距較大。濟南17、濟麥262和濟麥229的D位點擴增片段大小均為1 594 bp，包括ATG上游605 bp片段和TAA下游71 bp片段。三個序列中僅濟南17存在1個SNP位點的差異。

圖1 供試材料LMW-GS和α、γ-醇溶蛋白PCR結(jié)果

利用DNAMAN軟件將擴增得到的麥谷蛋白基因核酸序列翻譯成蛋白序列，發(fā)現(xiàn)A位點的蛋白序列在三個品種間無差異，其翻譯的氨基酸數(shù)目為376，N端第一個氨基酸均為異亮氨酸（I）。D位點蛋白序列在三個品種間也無差異，其翻譯的氨基酸數(shù)目為304，N端第一個氨基酸均為甲硫氨酸（M）。在B位點濟南17和濟麥262翻譯的氨基酸個數(shù)分別為351和350，濟麥229翻譯后的氨基酸數(shù)目為303（圖2），三條序列N端第一個氨基酸均為M。從圖2可以發(fā)現(xiàn)三條氨基酸序列均含有8個半胱氨酸（C），其中7個半胱氨酸的位置相同，濟南17和濟麥262第一個半胱氨酸位于重復(fù)區(qū)；而濟麥229的第一個半胱氨酸位于N端區(qū)，剩余7個半胱氨酸均位于C端區(qū)。

2.2 醇溶蛋白基因的克隆與序列分析

三個品種中共獲得6條α-醇溶蛋白基因和8條 γ-醇溶蛋白基因，gli-α的片段大小為841～896 bp，gli-γ的片段大小為976～1 098 bp。通過序列分析發(fā)現(xiàn)所克隆的醇溶蛋白基因中包括8個假基因（gli-α3條，gli-γ5條）和6個含有完整編碼區(qū)的醇溶蛋白基因（gli-α3條、gliγ3條）。對6條醇溶蛋白基因（圖1B）進行序列比對發(fā)現(xiàn)，3條gli-α序列相似性為96%，3條gli-γ序列的相似性為94%。

利用DNAMAN軟件將擴增得到的醇溶蛋白基因序列翻譯成蛋白序列發(fā)現(xiàn)，濟南17、濟麥262和濟麥229的gli-α氨基酸個數(shù)分別為287、297和297，其中濟南17的α-醇溶蛋白在多聚谷氨酰胺區(qū)Ⅰ的位置少了10個Q。gli-γ的氨基酸個數(shù)分別為295、327和327。分析CD誘發(fā)因子發(fā)現(xiàn)，克隆得到的gli-α蛋白均含有T-細胞毒性抗原表位（圖3），其中濟南17含有DQ2.5-gli-α3，位于N-端重復(fù)區(qū)。濟麥262和濟麥229含有DQ2.5-gli-α1和DQ2.5-gli-α3，位于N-端重復(fù)區(qū)。另外，克隆獲得的三個品種的gli-α 中 均 未 發(fā) 現(xiàn)LGQGSFRPSQQN和LGQQQPFPPQQPYPQPQ毒性肽。gli-γ蛋白序列分析未發(fā)現(xiàn)DQ2.5-gli-γ1，但發(fā)現(xiàn)了DQ8.5-gli-γ1（PQQSFPQQQ）的存在，位于重復(fù)Ⅱ區(qū)。

圖2 B位點LMW-GS蛋白序列比對

圖3 gli-α蛋白序列比對

2.3 B位點低分子量麥谷蛋白的進化分析

基于三個品種B位點低分子量麥谷蛋白序列差異較大，在NCBI中搜索小麥B位點的完整低分子量麥谷蛋白序列（共18個）與本試驗推導(dǎo)的三個B位點蛋白序列進行比對。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有序列中的半胱氨酸（C）的位置相對比較保守，其中第2、3、4、5、6和8位的C位置一致，但第1和7位置的C位置不固定，第1個C位于N端區(qū)的共 有2個 （登 錄 號 為AAQ63839.1和AAP87371.1）。

圖4

系統(tǒng)進化樹構(gòu)建結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有低分子量麥谷蛋白序列共分為5組（圖4）。其中，濟麥229的B位點低分子量麥谷蛋白獨自成第Ⅲ組。Ⅰ、Ⅱ和Ⅴ組序列的第1個C的位置位于重復(fù)區(qū)，其中Ⅰ、Ⅴ組C的位置后于Ⅱ組20個氨基酸；Ⅲ和Ⅳ組的第一個C的位置位于N端區(qū)。對于第7個C的位置，Ⅳ和Ⅴ組的位置前于Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組16個氨基酸。

3 討論與結(jié)論

根據(jù)成熟低分子量麥谷蛋白N端序列的第一個氨基酸，可以將LMW-GS分為m-type、stype和i-type，分別對應(yīng)的氨基酸為甲硫氨酸（M）、絲氨酸（S）和異亮氨酸（i）［15，16］。Ikeda等［17，18］從Norin 61中分離出12類LMW-GS基因，其中2類i-type、2類s-type和8類mtype，利用中國春缺四體將這些基因分別定位到A位點（3類）、B位點（2類）和D位點（7類）。Huang等［19］從Glenlea中獲得12個具有完整開放閱讀框的LMW-GS基因，其中1個編碼itype、2個編碼s-type、9個編碼m-type蛋白。通過對供試材料LMW-GS基因的克隆及蛋白翻譯發(fā)現(xiàn)，供試三個品種A位點蛋白均為i-type型蛋白、B位點為m-type型蛋白、D位點為mtype型蛋白。該結(jié)果豐富了三個品種的谷蛋白信息。

研究表明α-、γ-醇溶蛋白中存在的T-細胞毒性抗原表位是誘發(fā)CD的重要原因。在普通六倍體小麥A、B、D基因組中，B基因組含有較少數(shù)量的毒性多肽，D基因組中含有的毒性多肽相對較多，李文旭等［20］對鄭麥366的9個α-醇溶蛋白進行CD分析發(fā)現(xiàn)，ZM366-1和ZM366-2中存在LGQGSFRPSQQN毒性態(tài)，并發(fā)現(xiàn)4種T-細胞毒性抗原表位在9個α-醇溶蛋白中差異分布。Li等［21］在Zhengmai 004中共發(fā)現(xiàn)39個T-細胞毒性抗原表位。本研究克隆的α-醇溶蛋白分別含有1～2個T-細胞毒性抗原表位，位于N-端重復(fù)區(qū)，在獲得的α-醇溶蛋白序列中未發(fā)現(xiàn)LGQGSFRPSQQN和LGQQQPFPPQQPYPQPQ毒性肽。由于本研究只是克隆了三個品種的部分α-醇溶蛋白，所以該結(jié)果并不能表明這三個品種不含有以上兩個毒性態(tài)。γ-醇溶蛋白基因序列含有1個T-細胞毒性抗原表位，位于重復(fù)Ⅱ區(qū)。研究發(fā)現(xiàn)γ-醇溶蛋白Ⅱ重復(fù)區(qū)和Ⅲ非重復(fù)區(qū)附近乳糜瀉毒性相對較強，該結(jié)果表明在普通小麥品種中也有足夠?qū)е氯槊訛a發(fā)生的潛力，與前人研究結(jié)果基本一致［22］。

低分子量麥谷蛋白亞基通常都含有8個半胱氨酸（C）殘基，第1和第7個能形成分子間二硫鍵。兩個C殘基在位點上存在顯著變異，可能是導(dǎo)致LMW-GS結(jié)構(gòu)和功能差異的主要因素；其余6個半胱氨酸殘基所形成的分子內(nèi)二硫鍵對LMW-GS的結(jié)構(gòu)變異也有不同的作用，其中第2和第5個半胱氨酸殘基的結(jié)合對分子折疊是至關(guān)重要的［23，24］。本研究將獲得的B位點LMW-GS蛋白序列進行比對，發(fā)現(xiàn)第1和7位C的位置存在較大變異，其中濟麥229的B位點LMW-GS、AAQ63839.1和AAP87371.1第一個C位于N端區(qū)，不同于其他序列，且濟麥229 B位點蛋白序列中1和7位的C位置組合不同于其他序列并獨自分為一組，表明該序列在進化上不同于其他序列，其是否會影響小麥籽粒蛋白的結(jié)構(gòu)和功能需要進一步研究。