• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    面包面條優(yōu)質(zhì)小麥轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

    2021-06-09 03:45:12巨偉王紅日薛春芝龐亞男吳德豪郭憲峰程敦公韓冉劉愛峰李豪圣劉建軍曹新有宋健民訾妍
    山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年5期
    關(guān)鍵詞:花后淀粉酶蔗糖

    巨偉,王紅日,薛春芝,龐亞男,吳德豪,郭憲峰,程敦公,韓冉,劉愛峰,李豪圣,劉建軍,曹新有,宋健民,訾妍

    (1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所,山東 濟(jì)南 250100;2.山東魯研農(nóng)業(yè)良種有限公司,山東 濟(jì)南 250100;3.菏澤市牡丹區(qū)種子資源開發(fā)保護(hù)中心,山東 菏澤 274000)

    轉(zhuǎn)錄組測序是解析生物經(jīng)濟(jì)性狀形成分子機(jī)制、發(fā)掘基因資源的重要手段之一[1],該技術(shù)為差異基因表達(dá)分析、功能基因和轉(zhuǎn)錄因子挖掘、等位基因特異性表達(dá)研究等提供了新的手段,尤其是對(duì)全面解析復(fù)雜性狀的遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)非常有效,已成功應(yīng)用于水稻、玉米、小麥、黃瓜、黃豆、番茄等多種作物研究。因此,獲得高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄組對(duì)于作為重要糧食作物之一的小麥具有重要的研究意義。近年來,針對(duì)小麥抗旱、耐熱、抗病等性狀進(jìn)行了一些轉(zhuǎn)錄組研究,篩選出部分目的基因,并對(duì)篩選到的基因進(jìn)行了深入分析[2-5]。

    小麥?zhǔn)称芳庸て焚|(zhì)是決定其生產(chǎn)應(yīng)用和市場競爭力的關(guān)鍵因素,小麥品質(zhì)主要受蛋白、淀粉等籽粒主要成分理化特性的控制,而蛋白和淀粉的合成受一系列基因和調(diào)控因子的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控,因此利用RNA-Seq技術(shù)構(gòu)建不同面包、面條品質(zhì)類型典型品種籽粒轉(zhuǎn)錄組文庫,篩選差異表達(dá)基因,發(fā)掘調(diào)控面包、面條品質(zhì)的關(guān)鍵基因和調(diào)控因子,解析小麥品質(zhì)形成的生理代謝機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò),對(duì)于指導(dǎo)我國小麥品質(zhì)遺傳改良具有重要意義。小麥品質(zhì)性狀非常復(fù)雜,過去研究多局限于單一或個(gè)別性狀的影響和調(diào)控分析,研究方法也多是統(tǒng)計(jì)分析,很少在全基因組水平全面解析小麥品質(zhì)的遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。RNA-Seq技術(shù)的發(fā)展,為從轉(zhuǎn)錄組水平全面解析小麥品質(zhì)遺傳調(diào)控提供了可能。Yu等[6]通過動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)錄組分析,鑒定出8個(gè)對(duì)淀粉與蛋白質(zhì)合成以及壓力脅迫響應(yīng)相關(guān)的基因。利用我們前期研究中篩選出的6類有代表性的小麥材料:面包優(yōu)質(zhì)小麥、面包劣質(zhì)小麥、面條優(yōu)質(zhì)小麥、面條劣質(zhì)小麥、面包和面條兼優(yōu)小麥、面包和面條均劣小麥各2份,本研究利用RNA-Seq技術(shù)分析了其灌漿不同時(shí)期(開花后7、17、27 d)的基因表達(dá)情況,以期篩選調(diào)控面包、面條品質(zhì)性狀的差異基因和調(diào)控因子,結(jié)合蛋白和淀粉理化特性篩選關(guān)鍵基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證,這對(duì)全面解析小麥品質(zhì)遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、促進(jìn)小麥品質(zhì)遺傳改良具有重要意義。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料與種植方法

    供試品種為6類12個(gè)小麥品種,分別是面包優(yōu)質(zhì)小麥(GB)JM4072、ZM12,面條優(yōu)質(zhì)小麥(GN)JM19、ZM18,面包劣質(zhì)小麥(BB)TN18、QF1,面條劣質(zhì)小麥(BN)LM1、LM19,面包面條均優(yōu)小麥(GBN)JM20、ZM366,面包面條均劣小麥(BBN)LM14、XM18。

    試驗(yàn)于2014—2016年在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)站(36°42′N、117°05′E)進(jìn)行。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),播種密度為3×106株/hm2,行距25 cm,小區(qū)面積6 m2(4.0 m×1.5 m),重復(fù)3次。2014年10月和2015年10月播種,2015年6月和2016年6月收獲,均按高產(chǎn)田常規(guī)栽培措施管理。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 樣本采集及RNA提取、純化 分別于花后7、17、27 d取同一天開花的小穗中部籽粒,送至廣州基迪奧生物科技有限公司,利用Trizol法提取總RNA,采用DNaseⅠ(RNase-free)消化所得RNA樣本中的殘余DNA。

    1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測序 樣品提取總RNA后,經(jīng)富集、打斷、六堿基隨機(jī)引物(random hexamers)合成、末端修復(fù)、加堿基A、加測序接頭、PCR擴(kuò)增等過程制備測序文庫,構(gòu)建好的文庫用Illumina-HiSeqTM進(jìn)行測序。

    1.2.3 RNA-Seq質(zhì)量評(píng)估和序列比對(duì) 在全部測序結(jié)果中選擇錯(cuò)誤率小于1%的用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組分析,更嚴(yán)格過濾得到high quality clean reads,同時(shí)計(jì)算Q20和Q30。小麥參考基因組從http://www.wheatgenome.org/下載,選取HISAT軟件將過濾后的測序序列進(jìn)行基因組定位分析。樣本之間(包括3個(gè)生物學(xué)重復(fù))的基因表達(dá)水平則采用皮爾遜相關(guān)性檢測進(jìn)行分析。

    1.2.4 差異基因篩選 將同一類型的兩個(gè)品種作為一組,進(jìn)行不同組間小麥品種的差異基因分析?;虮磉_(dá)量的計(jì)算采用FPKM(fragments per kilobase of exon per million fragments mapped reads)法[7]。使用DESeq R軟件包(1.18.0)[8]對(duì)不同類型小麥之間的差異表達(dá)基因進(jìn)行研究。當(dāng)FDR校正后的p值<0.05且時(shí)則認(rèn)為該基因表達(dá)差異顯著。

    1.2.5 GO注釋和KEGG分析 Gene Ontology(簡稱GO,http://www.geneontology.org/)富集分析采用軟件為GOseq[9],GO分為分子功能(molecular Function)、生物過程(biological process)和細(xì)胞組成(cellular component)三個(gè)部分。

    KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,http://www.kegg.jp/)是系統(tǒng)分析基因功能、基因組信息數(shù)據(jù)庫,分析內(nèi)容包括碳水化合物、核苷、氨基酸等的代謝及有機(jī)物的生物降解[10]。

    1.2.6 qRT-PCR驗(yàn)證 為了驗(yàn)證RNA-Seq檢測出的基因表達(dá)水平是否正確,從RNA-Seq測序用總RNA中取出1μg用于qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。使用Primer Premier 5軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì),引物序列由擎科生物技術(shù)有限公司合成,釆用PAGE純化(表1)。

    使用羅氏公司的LightCycler 480Ⅱ進(jìn)行熒光定量PCR。熒光定量PCR反應(yīng)體系10μL包括:2×SYBR Premix Ex TaqⅠ5μL,正向引物與反向引物各0.5μL,cDNA 1μL,ddH2O 3μL。PCR程序?yàn)椋?5℃1 min預(yù)變性;40×(95℃15 s,55℃15 s,72℃15 s)收集熒光信號(hào);95℃1 s,60℃1 s,95℃1 s,37℃1 s為熔解曲線階段。采用2-ΔΔCt法[11]分析目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 測序結(jié)果質(zhì)量評(píng)估

    對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾去除大量的測序接頭序列、低質(zhì)量的讀段、序列N的比例大于10%的reads,最終得到2 882 357 526條clean reads,每個(gè)樣本測序量超過10 G,達(dá)到文庫采樣深度的要求。質(zhì)量達(dá)到Q30級(jí)別的堿基占總堿基數(shù)的84%以上(表2)。51%以上的reads可以比對(duì)到參考基因組上,50%以上的reads能夠比對(duì)到唯一轉(zhuǎn)錄本上,2%左右的reads可比對(duì)到多個(gè)轉(zhuǎn)錄本上。且reads打斷隨機(jī)性好,在參考基因組各個(gè)位置分布均勻。比對(duì)到唯一轉(zhuǎn)錄本的reads可以用來進(jìn)行下一步的分析工作。

    表2 RNA-Seq測序結(jié)果質(zhì)量評(píng)估

    2.2 不同類型面包、面條小麥不同時(shí)期差異表達(dá)基因的分析

    為了鑒別6類不同加工品質(zhì)小麥的差異表達(dá)基因(DEGs),對(duì)組間基因表達(dá)量進(jìn)行了比對(duì)分析。以同期GB小麥為對(duì)照,花后7 d共找到4 529個(gè)差異表達(dá)基因,其中有2 549、1 980個(gè)基因表達(dá)量分別呈上調(diào)和下調(diào);花后17 d共找到3 198個(gè)差異表達(dá)基因,其中有1 775、1 423個(gè)基因表達(dá)量分別呈上調(diào)和下調(diào);花后27 d共找到2 955個(gè)差異表達(dá)基因,其中,1 731、1 224個(gè)基因表達(dá)量分別呈上調(diào)和下調(diào)(圖1)。6類品種在花后7 d差異表達(dá)基因最多,其次是花后17 d,花后27 d最少,這可能是因?yàn)楣酀{前期籽粒膨大生長階段差異基因較多。

    圖1 不同類型小麥組間差異表達(dá)基因的維恩圖

    2.3 差異表達(dá)基因的篩選及GO注釋和KEGG分析

    發(fā)現(xiàn)花后7、17、27 d分別有1 743、1 195、981個(gè)DEGs在優(yōu)質(zhì)小麥(GN與GBN)中上調(diào),在劣質(zhì)小麥(BB、BN與BBN)中下調(diào),對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行GO功能分類分析發(fā)現(xiàn),三個(gè)時(shí)期差異基因均主要分布在生物過程(biological process)的metabolic process和cellular process、細(xì)胞成分(cell component)的cell和cell part以及分子功能(molecular function)的binding和catalytic activity中。

    利用KEGG分析研究了與品質(zhì)相關(guān)的生物代謝通路。發(fā)現(xiàn)花后7 d篩選出的1 743個(gè)DEGs被富集到103條通路中,包括DNA及RNA的合成及轉(zhuǎn)運(yùn)、碳循環(huán)、氮代謝、氨基酸代謝、淀粉及糖代謝等,富集DEGs數(shù)目最多的代謝通路有:protein processing in endoplasmic reticulum(36)、starch and sucrose metabolism(22)、spliceosome(20)、plant-pathogen interaction(18)、RNA transport(17)(圖2A)?;ê?7 d篩選出的1 195個(gè)DEGs被富集到98條通路中,包括DNA及RNA的合成及轉(zhuǎn)運(yùn)、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、氨基酸的生物合成、碳循環(huán)等,富集DEGs數(shù)目最多的代謝通路有:RNA transport(15)、spliceosome(12)、biosynthesis of amino acids(12)、plant-pathogen interaction(12)(圖2B)?;ê?7 d篩選出的981個(gè)DEGs被富集到89條通路中,包括DNA及RNA的合成及轉(zhuǎn)運(yùn)、氨基酸生物合成、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白合成、淀粉及糖代謝等,富集DEGs數(shù)目最多的代謝通路有:RNA transport(14)、protein processing in endoplasmic reticulum(10)、spliceosome(9)、biosynthesis of amino acids(9)、starch and sucrose metabolism(9)(圖2C)。

    2.4 蔗糖與淀粉代謝通路有關(guān)的差異基因分析

    對(duì)蔗糖與淀粉代謝通路進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),在以GB為對(duì)照的條件下,花后7、17 d及27 d BB與GB、BBN與GB間淀粉合成通路中差異表達(dá)基因最多。花后7 d,相較于GB小麥,其他類型小麥下調(diào)差異基因較多,花后17 d與花后27 d,BB小麥與GN小麥均為上調(diào)基因較多,其他類型為下調(diào)基因較多(表3)。

    圖2 花后7 d(A)、17 d(B)及27 d(C)差異表達(dá)基因KEGG富集分析

    對(duì)淀粉與蔗糖代謝通路的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析,以GB小麥為對(duì)照,從花后7 d的BB、GN、BN、GBN、BBN品種中分別篩選到14、5、8、6和12個(gè)差異表達(dá)基因,從花后17 d的BB、GN、BN、GBN、BBN品種中分別篩選到14、4、6、4和4個(gè)差異表達(dá)基因,從花后27 d的BB、GN、BN、GBN、BBN品種中分別篩選到7、4、7、4和5個(gè)差異表達(dá)基因,主要涉及糖代謝過程中的蔗糖合成酶(sucrose synthase,SuS,EC2.4.1.13)和轉(zhuǎn)化酶(invertase,INV,EC3.2.1.26)、蔗糖磷酸酯酶(sucrose phosphatase,SPP)、蔗糖磷酸合酶(sucrosephosphate synthase,SPS),淀粉代謝過程中的去分支酶(debranching enzyme,DBE)、α-淀粉酶(alpha-amylase,EC3.2.1.1)和 β-淀粉酶(beta-amylase,EC3.2.1.2)。

    SPS基因花后7 d在BN小麥中上調(diào),花后17 d在BB小麥中下調(diào),花后27 d在GN、BN與BBN小麥中均上調(diào)。相反,SuS在花后7 d的BB、BN小麥中上調(diào),在GN與BBN中下調(diào),花后17 d的BB、GN、BN以及BBN小麥中均上調(diào),花后27 d的BB小麥中上調(diào);INV在花后7 d的BB、BN與GBN中均下調(diào),花后17 d在BB、BN和GBN小麥中均下調(diào),花后27 d在BB、GN、GBN、BBN小麥中均下調(diào)(表4—表6)。推測花后7 d GN小麥、GBN及BBN小麥蔗糖分解能力較弱;花后17 d GN小麥及BBN小麥蔗糖分解能力高于GB小麥;花后27 d GN、BN與BBN小麥的蔗糖合成能力高于GB小麥。

    6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶(glucose-6-phosphate isomerase,GPI,EC5.3.1.9)基因在花后7、17、27 d的BB小麥中均上調(diào)。DBE基因在花后不同時(shí)期其他5類小麥中均上調(diào),推測與成熟期GB小麥總淀粉含量最低一致。α-淀粉酶和β-淀粉酶基因在花后7 d的BB小麥中下調(diào),但花后17 d BB小麥中的α-淀粉酶上調(diào),可以進(jìn)一步推測是成熟期支鏈淀粉含量低于GB小麥的原因之一。

    表3 不同時(shí)期不同類型DEGs及與淀粉合成相關(guān)的DEGs匯總

    表4 花后7 d與蔗糖和淀粉代謝通路相關(guān)的DEGs

    表5 花后17 d與蔗糖和淀粉代謝通路相關(guān)的DEGs

    表6 花后27 d與蔗糖和淀粉代謝通路相關(guān)的DEGs

    2.5 qRT-PCR驗(yàn)證差異表達(dá)基因

    為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的真實(shí)性,從淀粉合成通路中隨機(jī)挑選了7個(gè)候選基因(Traes_7BL_11C5C7BC4、Traes_7AS_7D1CD8641、Traes_3B_55B913FD2、Traes_6BL_C22DEC10D、Traes_2AL_0C8275227、Traes_6BL_FC54B7E8F和Traes_7DS_E488AA1F2)進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證(圖3、4、5)。將驗(yàn)證結(jié)果與RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析,兩者的相關(guān)系數(shù)較高且表達(dá)趨勢基本相同,表明RNA-Seq的分析結(jié)果可靠。

    圖5 qRT-PCR驗(yàn)證花后27 d RNA-Seq結(jié)果

    3 討論與結(jié)論

    本研究采用RNA-Seq技術(shù)分析不同面包、面條品質(zhì)類型小麥在花后7、17、27 d的差異表達(dá)基因。以相同時(shí)期面包優(yōu)質(zhì)小麥為對(duì)照,分別發(fā)現(xiàn)4 529、3 198、2 955個(gè)差異表達(dá)基因。通過對(duì)不同加工品質(zhì)小麥差異表達(dá)基因的GO富集分析,發(fā)現(xiàn)不同類型小麥在淀粉代謝通路中的差異表達(dá)基因及其參與的生物過程以及本身的分子功能。與面包優(yōu)質(zhì)小麥進(jìn)行比較,不同類型小麥在花后不同時(shí)期差異表達(dá)的基因主要參與代謝過程、細(xì)胞生理過程、細(xì)胞、細(xì)胞組分、結(jié)合功能以及催化活性。對(duì)不同類型小麥的KEGG通路注釋結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同類型小麥之間的差異表達(dá)基因在蛋白質(zhì)合成的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工過程通路、淀粉和蔗糖代謝通路、剪接體通路、RNA轉(zhuǎn)錄通路、氨基酸合成通路以及核糖體通路等通路富集較多。

    淀粉與蔗糖代謝在植物發(fā)育、抗逆反應(yīng)等多個(gè)生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。小麥淀粉含量及特性對(duì)小麥品質(zhì)特別是面條品質(zhì)影響較大,培育面包面條兼優(yōu)小麥的其中一個(gè)思路即為在面包優(yōu)質(zhì)小麥的基礎(chǔ)上提高面條品質(zhì)。因此,我們重點(diǎn)對(duì)淀粉與蔗糖代謝通路進(jìn)行分析。對(duì)淀粉與蔗糖代謝通路的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析,以面包優(yōu)質(zhì)小麥為對(duì)照,從花后7、17、27 d的面包劣質(zhì)、面條優(yōu)質(zhì)、面條劣質(zhì)、包條兼優(yōu)以及包條均劣品種分別篩選到一些差異表達(dá)基因,主要涉及糖代謝過程中的蔗糖合成酶(SuS)和轉(zhuǎn)化酶(INV)、蔗糖磷酸酯酶(SPP)、蔗糖磷酸合酶(SPS),淀粉代謝過程中的去分支酶(DBE)、α-淀粉酶和β-淀粉酶。在蔗糖代謝方面,蔗糖在蔗糖合酶和轉(zhuǎn)化酶調(diào)控下參與淀粉的合成[12],蔗糖磷酸酯酶和蔗糖磷酸合酶在蔗糖合成中起關(guān)鍵作用[13,14]。INV對(duì)蔗糖的水解作用是單向的,而SuS能可逆地催化蔗糖代謝,通常認(rèn)為SuS主要起水解蔗糖的作用。SPS在碳水化合作物代謝方面發(fā)揮重要作用,可以調(diào)控碳在淀粉合成和碳水化合物積累間的分配[15]。

    催化6-磷酸果糖和6-磷酸葡萄糖相互轉(zhuǎn)化的6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶(GPI)[16]基因在花后7、17、27 d的BB小麥中均上調(diào),而6-磷酸葡萄糖是合成ADPG的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[17],因此推測BB籽粒中ADPG的合成能力高于GB小麥,這與BB小麥具有最高的總淀粉及直鏈淀粉含量相符合。α-淀粉酶與β-淀粉酶是淀粉水解過程中的關(guān)鍵酶,其中α-淀粉酶可以水解淀粉內(nèi)部的α-1,4-糖苷鍵,β-淀粉酶能將直鏈淀粉分解為麥芽糖;淀粉脫支酶(DBE)專一水解α-1,6-糖苷鍵,支鏈淀粉經(jīng)淀粉酶水解產(chǎn)生的極限糊精,由脫支酶水解去除α-1,6-糖苷鍵,再在α-淀粉酶和β-淀粉酶的作用下徹底水解[18]。

    不同品質(zhì)類型小麥籽粒中蔗糖代謝形成淀粉合成前體的相關(guān)酶類(SPS、INV、SuS)以及淀粉代謝相關(guān)酶類(DBE、α-淀粉酶與β-淀粉酶)存在差異,是總淀粉含量及其組分的差異原因之一。面包劣質(zhì)小麥籽粒淀粉含量及直鏈淀粉含量均高于面包優(yōu)質(zhì)小麥,可能是由于其6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶基因的高表達(dá)導(dǎo)致。其他5類小麥品種中DBE與α-淀粉酶基因均高于面包優(yōu)質(zhì)小麥,可能是面包優(yōu)質(zhì)小麥總淀粉含量較低、支鏈淀粉含量較高的原因。因此調(diào)控籽粒蔗糖代謝通路以及淀粉水解通路可以作為調(diào)控小麥加工品質(zhì)的新思路。

    猜你喜歡
    花后淀粉酶蔗糖
    花前漬水鍛煉調(diào)控花后小麥耐漬性的生理機(jī)制研究
    增施磷肥對(duì)冀東平原強(qiáng)筋小麥花后干物質(zhì)積累和籽粒產(chǎn)量的影響
    基于花后累積地上生物量比例的冬小麥動(dòng)態(tài)收獲指數(shù)估算
    2019年來賓市蔗糖業(yè)總產(chǎn)值近100億元
    蘋果品質(zhì)要提高 花后追肥很重要
    異淀粉酶法高直鏈銀杏淀粉的制備
    摻HRA 對(duì)蔗糖超緩凝水泥基材料性能的影響
    瀾滄縣蔗糖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的思考
    中國糖料(2016年1期)2016-12-01 06:49:06
    冷脅迫與非冷脅迫溫度條件下桃果實(shí)的蔗糖代謝差異
    α-淀粉酶的基因改造與菌種選育研究進(jìn)展
    精品久久久精品久久久| 免费日韩欧美在线观看| 这个男人来自地球电影免费观看| 亚洲人成网站在线观看播放| 亚洲中文字幕日韩| 日本av手机在线免费观看| 男女高潮啪啪啪动态图| 日本wwww免费看| 满18在线观看网站| 国产一卡二卡三卡精品| 十八禁高潮呻吟视频| 亚洲国产精品成人久久小说| 久久热在线av| 婷婷丁香在线五月| 亚洲七黄色美女视频| 九草在线视频观看| 免费少妇av软件| 国产av国产精品国产| 少妇的丰满在线观看| 丝袜人妻中文字幕| 免费黄频网站在线观看国产| 一区二区三区四区激情视频| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 国产在线免费精品| 男人添女人高潮全过程视频| 嫩草影视91久久| 亚洲av综合色区一区| 又黄又粗又硬又大视频| 91精品国产国语对白视频| 中国国产av一级| 欧美中文综合在线视频| 成人国语在线视频| bbb黄色大片| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 色视频在线一区二区三区| 中文字幕最新亚洲高清| 丝袜美腿诱惑在线| 成年美女黄网站色视频大全免费| 欧美精品一区二区免费开放| 色综合欧美亚洲国产小说| av在线播放精品| 丁香六月欧美| 老司机亚洲免费影院| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 午夜福利视频精品| 亚洲欧美一区二区三区国产| 亚洲精品国产av蜜桃| 免费少妇av软件| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 国产一区二区激情短视频 | 老司机在亚洲福利影院| 亚洲成人手机| 国产午夜精品一二区理论片| www.自偷自拍.com| 999久久久国产精品视频| 午夜两性在线视频| 99国产精品一区二区三区| 2021少妇久久久久久久久久久| 咕卡用的链子| 国产成人免费无遮挡视频| 黄色怎么调成土黄色| 日本一区二区免费在线视频| 久久久国产精品麻豆| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 免费日韩欧美在线观看| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 国产黄色免费在线视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 一区二区三区乱码不卡18| 99热网站在线观看| 久久人妻熟女aⅴ| 国产免费又黄又爽又色| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 热re99久久国产66热| 99热国产这里只有精品6| 国产成人影院久久av| 老鸭窝网址在线观看| 免费看十八禁软件| 只有这里有精品99| 久久精品亚洲av国产电影网| 色精品久久人妻99蜜桃| 久久久亚洲精品成人影院| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 亚洲av国产av综合av卡| 色精品久久人妻99蜜桃| 婷婷色麻豆天堂久久| 亚洲av国产av综合av卡| 久久精品成人免费网站| 久久精品成人免费网站| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 免费人妻精品一区二区三区视频| 中国美女看黄片| 国产黄色免费在线视频| 久9热在线精品视频| 在线观看免费日韩欧美大片| 欧美成狂野欧美在线观看| 婷婷色综合大香蕉| 中文字幕人妻熟女乱码| 国产伦人伦偷精品视频| 欧美xxⅹ黑人| 亚洲黑人精品在线| 久久人妻熟女aⅴ| 性色av乱码一区二区三区2| 久久久亚洲精品成人影院| 国产精品国产三级专区第一集| 久久性视频一级片| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 操出白浆在线播放| 老司机午夜十八禁免费视频| 女人精品久久久久毛片| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产精品三级大全| 我的亚洲天堂| 日本色播在线视频| 纯流量卡能插随身wifi吗| a级毛片在线看网站| 午夜视频精品福利| 亚洲国产av新网站| av线在线观看网站| 丝袜喷水一区| 日本欧美视频一区| 亚洲国产看品久久| 国产不卡av网站在线观看| 亚洲成人国产一区在线观看 | 欧美日韩福利视频一区二区| bbb黄色大片| 国产极品粉嫩免费观看在线| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 制服诱惑二区| 国产成人av教育| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 午夜老司机福利片| 婷婷丁香在线五月| 精品一区二区三区av网在线观看 | 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 欧美日韩精品网址| 免费在线观看日本一区| 亚洲,一卡二卡三卡| 五月天丁香电影| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲欧美激情在线| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 亚洲图色成人| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲国产看品久久| 赤兔流量卡办理| 国产精品九九99| 香蕉丝袜av| 男女下面插进去视频免费观看| 日韩人妻精品一区2区三区| 欧美精品人与动牲交sv欧美| cao死你这个sao货| 欧美精品一区二区免费开放| 亚洲伊人久久精品综合| 日韩av免费高清视频| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 亚洲 欧美一区二区三区| 婷婷色综合www| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 国产一区二区 视频在线| 国产免费一区二区三区四区乱码| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 丁香六月天网| 国产又色又爽无遮挡免| 国产成人精品在线电影| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 飞空精品影院首页| 免费少妇av软件| 欧美人与善性xxx| 国产伦人伦偷精品视频| 国产一区二区三区av在线| 精品久久蜜臀av无| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产日韩欧美视频二区| 十八禁高潮呻吟视频| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 最近中文字幕2019免费版| 成人手机av| 欧美黄色淫秽网站| 欧美精品av麻豆av| 久久国产亚洲av麻豆专区| 手机成人av网站| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 亚洲国产日韩一区二区| 免费高清在线观看视频在线观看| 美国免费a级毛片| 亚洲国产日韩一区二区| 国产有黄有色有爽视频| 嫁个100分男人电影在线观看 | 国产日韩欧美视频二区| 涩涩av久久男人的天堂| 99国产精品免费福利视频| 精品福利永久在线观看| 99精品久久久久人妻精品| 国产精品三级大全| 午夜日韩欧美国产| 午夜激情av网站| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 少妇被粗大的猛进出69影院| 在线天堂中文资源库| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 只有这里有精品99| 久久久久国产一级毛片高清牌| 精品高清国产在线一区| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 最黄视频免费看| 精品一区在线观看国产| 大片免费播放器 马上看| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲成人免费av在线播放| 十八禁网站网址无遮挡| 亚洲五月婷婷丁香| 久久久国产一区二区| 丰满少妇做爰视频| 亚洲成人免费电影在线观看 | 一区二区av电影网| 久久热在线av| 美国免费a级毛片| 亚洲 国产 在线| 男女床上黄色一级片免费看| 欧美精品一区二区大全| 一本色道久久久久久精品综合| 久久青草综合色| 日本av免费视频播放| 国产高清videossex| 日韩 亚洲 欧美在线| av不卡在线播放| 午夜福利乱码中文字幕| 男女免费视频国产| 国产男女内射视频| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 亚洲第一av免费看| 亚洲av欧美aⅴ国产| 天堂中文最新版在线下载| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 成人黄色视频免费在线看| 国产成人a∨麻豆精品| 欧美 日韩 精品 国产| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 桃花免费在线播放| 超碰成人久久| 另类亚洲欧美激情| 中文欧美无线码| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲欧美清纯卡通| 国产精品免费大片| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产高清视频在线播放一区 | 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 午夜福利,免费看| 国产精品国产三级专区第一集| 黑人欧美特级aaaaaa片| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲欧美色中文字幕在线| 免费观看人在逋| 免费不卡黄色视频| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产一区二区三区综合在线观看| 国产黄色免费在线视频| 成人影院久久| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 涩涩av久久男人的天堂| 国产男女超爽视频在线观看| 午夜老司机福利片| 久久精品国产综合久久久| 国产爽快片一区二区三区| 国产亚洲欧美在线一区二区| 99香蕉大伊视频| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 91字幕亚洲| 国产亚洲欧美在线一区二区| 人人妻人人澡人人看| 中文字幕高清在线视频| 少妇粗大呻吟视频| 黄色视频不卡| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 黄色怎么调成土黄色| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 国产一区二区三区综合在线观看| 婷婷色综合大香蕉| av在线播放精品| 中文字幕亚洲精品专区| 午夜福利一区二区在线看| 电影成人av| 亚洲精品国产色婷婷电影| 麻豆乱淫一区二区| 欧美黑人精品巨大| av网站免费在线观看视频| 日韩av免费高清视频| 精品福利观看| 18禁国产床啪视频网站| 免费人妻精品一区二区三区视频| 久久综合国产亚洲精品| 黄色 视频免费看| 黄色一级大片看看| 精品熟女少妇八av免费久了| 脱女人内裤的视频| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 美女高潮到喷水免费观看| 国产成人av教育| av电影中文网址| 一个人免费看片子| 亚洲av日韩在线播放| 午夜久久久在线观看| 国产黄色视频一区二区在线观看| 国产欧美日韩一区二区三 | 亚洲欧美色中文字幕在线| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 日本欧美国产在线视频| 午夜免费观看性视频| 免费人妻精品一区二区三区视频| 91老司机精品| 飞空精品影院首页| 国产免费现黄频在线看| 桃花免费在线播放| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 国产精品三级大全| 天堂俺去俺来也www色官网| 欧美日本中文国产一区发布| 极品人妻少妇av视频| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 黄片播放在线免费| 中文字幕亚洲精品专区| 国产高清不卡午夜福利| 啦啦啦在线观看免费高清www| 国产精品99久久99久久久不卡| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 啦啦啦 在线观看视频| 久久九九热精品免费| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 久久亚洲精品不卡| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 丝袜脚勾引网站| 亚洲国产精品一区二区三区在线| av网站在线播放免费| 一边摸一边做爽爽视频免费| 午夜福利,免费看| 国产国语露脸激情在线看| av电影中文网址| 午夜福利乱码中文字幕| 欧美日韩成人在线一区二区| 亚洲精品av麻豆狂野| videos熟女内射| a级毛片在线看网站| 一级毛片女人18水好多 | 日本色播在线视频| 美国免费a级毛片| 在线观看一区二区三区激情| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 中文字幕亚洲精品专区| 国产精品一区二区在线观看99| 国产男人的电影天堂91| 亚洲精品在线美女| 国产免费现黄频在线看| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲欧美激情在线| 亚洲中文av在线| 亚洲国产欧美在线一区| 亚洲欧美激情在线| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 久久99热这里只频精品6学生| 久久久久久久国产电影| 黄频高清免费视频| 男女边吃奶边做爰视频| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产在线免费精品| 中文字幕色久视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产伦理片在线播放av一区| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 蜜桃在线观看..| 中文字幕人妻熟女乱码| 又黄又粗又硬又大视频| 18禁国产床啪视频网站| 人人妻人人澡人人看| 国产片特级美女逼逼视频| 亚洲,欧美,日韩| 各种免费的搞黄视频| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 一二三四社区在线视频社区8| 国产精品亚洲av一区麻豆| 99热全是精品| 视频区欧美日本亚洲| 国产激情久久老熟女| 晚上一个人看的免费电影| 亚洲欧美精品自产自拍| 久久综合国产亚洲精品| 欧美av亚洲av综合av国产av| 色网站视频免费| 欧美精品av麻豆av| 飞空精品影院首页| 51午夜福利影视在线观看| 国产成人av激情在线播放| 欧美精品高潮呻吟av久久| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲国产精品一区三区| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 男的添女的下面高潮视频| 校园人妻丝袜中文字幕| 丝瓜视频免费看黄片| 男女下面插进去视频免费观看| 欧美国产精品一级二级三级| 91字幕亚洲| 精品福利永久在线观看| av国产精品久久久久影院| 午夜免费成人在线视频| 老鸭窝网址在线观看| 亚洲精品久久午夜乱码| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 纵有疾风起免费观看全集完整版| av在线播放精品| 日韩精品免费视频一区二区三区| 亚洲人成电影免费在线| 国产精品久久久久久精品电影小说| 在线天堂中文资源库| 精品欧美一区二区三区在线| 老司机靠b影院| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 在线 av 中文字幕| 国产一区二区三区综合在线观看| 亚洲欧洲日产国产| 精品人妻1区二区| 国产成人影院久久av| 亚洲精品国产av成人精品| 一二三四社区在线视频社区8| 少妇的丰满在线观看| 免费看av在线观看网站| 亚洲九九香蕉| 久久午夜综合久久蜜桃| 麻豆av在线久日| 国产精品成人在线| 又黄又粗又硬又大视频| 99re6热这里在线精品视频| 精品欧美一区二区三区在线| 久久久久久久国产电影| 一级,二级,三级黄色视频| 色播在线永久视频| 国产伦理片在线播放av一区| 亚洲成国产人片在线观看| 欧美亚洲日本最大视频资源| 美国免费a级毛片| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 黄频高清免费视频| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 青春草视频在线免费观看| 满18在线观看网站| 脱女人内裤的视频| 天天影视国产精品| 免费高清在线观看视频在线观看| 好男人视频免费观看在线| av在线老鸭窝| 欧美精品一区二区免费开放| 超碰成人久久| 人妻一区二区av| 国产97色在线日韩免费| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 日韩人妻精品一区2区三区| 亚洲国产欧美网| 亚洲久久久国产精品| 亚洲欧洲日产国产| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产一区二区三区av在线| 在线 av 中文字幕| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 欧美 日韩 精品 国产| 久久免费观看电影| 最近手机中文字幕大全| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产精品欧美亚洲77777| videos熟女内射| 麻豆国产av国片精品| 国产精品一区二区精品视频观看| 天天添夜夜摸| 久久99热这里只频精品6学生| 热99久久久久精品小说推荐| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 999久久久国产精品视频| 超色免费av| 老司机亚洲免费影院| 丝袜美腿诱惑在线| 日日摸夜夜添夜夜爱| 91精品三级在线观看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 99久久精品国产亚洲精品| 蜜桃国产av成人99| 久久精品成人免费网站| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 亚洲国产精品成人久久小说| 国产成人精品在线电影| 校园人妻丝袜中文字幕| 尾随美女入室| av一本久久久久| 精品国产一区二区三区四区第35| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲一区二区三区欧美精品| 99国产精品一区二区三区| 夫妻性生交免费视频一级片| 两个人看的免费小视频| 午夜福利视频在线观看免费| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 天天影视国产精品| av片东京热男人的天堂| 免费在线观看影片大全网站 | 在线观看国产h片| 成年动漫av网址| 成年女人毛片免费观看观看9 | 又黄又粗又硬又大视频| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 欧美国产精品一级二级三级| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产成人欧美在线观看 | 国产不卡av网站在线观看| 少妇的丰满在线观看| 丁香六月天网| 老司机午夜十八禁免费视频| 亚洲精品国产av蜜桃| 这个男人来自地球电影免费观看| 在线 av 中文字幕| 性色av乱码一区二区三区2| 亚洲av片天天在线观看| 国产三级黄色录像| 国精品久久久久久国模美| 欧美黄色片欧美黄色片| www.熟女人妻精品国产| 男人添女人高潮全过程视频| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 欧美+亚洲+日韩+国产| 91国产中文字幕| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 欧美在线一区亚洲| 欧美日韩精品网址| 欧美在线一区亚洲| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 欧美黄色片欧美黄色片| 1024香蕉在线观看| 精品一区二区三区av网在线观看 | 少妇被粗大的猛进出69影院| 男女边摸边吃奶| 丰满少妇做爰视频| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 国产一区二区在线观看av| 晚上一个人看的免费电影| 婷婷色综合大香蕉| 嫩草影视91久久| 国产色视频综合| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲一区二区三区欧美精品| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 啦啦啦 在线观看视频| 黄色怎么调成土黄色| 看十八女毛片水多多多| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲成人免费电影在线观看 | 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 久久精品久久久久久久性| 国产精品成人在线| 亚洲精品第二区| 久久国产精品大桥未久av| 人人澡人人妻人| 91精品三级在线观看| 最黄视频免费看| 国产麻豆69| 999久久久国产精品视频| 国产一区二区在线观看av| av在线app专区| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 亚洲欧美色中文字幕在线| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 亚洲激情五月婷婷啪啪| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲熟女精品中文字幕| 飞空精品影院首页| 一区二区av电影网| av线在线观看网站| 黄色片一级片一级黄色片| 亚洲国产成人一精品久久久| 日本一区二区免费在线视频| 十八禁高潮呻吟视频| 国产97色在线日韩免费| 国产免费又黄又爽又色| 男女高潮啪啪啪动态图| 久久av网站| 中文字幕av电影在线播放| 色网站视频免费| 午夜福利影视在线免费观看| 99国产精品一区二区蜜桃av | 久久久久久免费高清国产稀缺| 麻豆国产av国片精品| 午夜精品国产一区二区电影| 欧美日韩福利视频一区二区| 亚洲少妇的诱惑av| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 成年动漫av网址| 久久综合国产亚洲精品| 五月开心婷婷网| 日韩免费高清中文字幕av|