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    面包面條優(yōu)質(zhì)小麥轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

    2021-06-09 03:45:12巨偉王紅日薛春芝龐亞男吳德豪郭憲峰程敦公韓冉劉愛峰李豪圣劉建軍曹新有宋健民訾妍
    山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年5期
    關(guān)鍵詞:花后淀粉酶蔗糖

    巨偉,王紅日,薛春芝,龐亞男,吳德豪,郭憲峰,程敦公,韓冉,劉愛峰,李豪圣,劉建軍,曹新有,宋健民,訾妍

    (1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所,山東 濟(jì)南 250100;2.山東魯研農(nóng)業(yè)良種有限公司,山東 濟(jì)南 250100;3.菏澤市牡丹區(qū)種子資源開發(fā)保護(hù)中心,山東 菏澤 274000)

    轉(zhuǎn)錄組測序是解析生物經(jīng)濟(jì)性狀形成分子機(jī)制、發(fā)掘基因資源的重要手段之一[1],該技術(shù)為差異基因表達(dá)分析、功能基因和轉(zhuǎn)錄因子挖掘、等位基因特異性表達(dá)研究等提供了新的手段,尤其是對(duì)全面解析復(fù)雜性狀的遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)非常有效,已成功應(yīng)用于水稻、玉米、小麥、黃瓜、黃豆、番茄等多種作物研究。因此,獲得高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄組對(duì)于作為重要糧食作物之一的小麥具有重要的研究意義。近年來,針對(duì)小麥抗旱、耐熱、抗病等性狀進(jìn)行了一些轉(zhuǎn)錄組研究,篩選出部分目的基因,并對(duì)篩選到的基因進(jìn)行了深入分析[2-5]。

    小麥?zhǔn)称芳庸て焚|(zhì)是決定其生產(chǎn)應(yīng)用和市場競爭力的關(guān)鍵因素,小麥品質(zhì)主要受蛋白、淀粉等籽粒主要成分理化特性的控制,而蛋白和淀粉的合成受一系列基因和調(diào)控因子的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控,因此利用RNA-Seq技術(shù)構(gòu)建不同面包、面條品質(zhì)類型典型品種籽粒轉(zhuǎn)錄組文庫,篩選差異表達(dá)基因,發(fā)掘調(diào)控面包、面條品質(zhì)的關(guān)鍵基因和調(diào)控因子,解析小麥品質(zhì)形成的生理代謝機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò),對(duì)于指導(dǎo)我國小麥品質(zhì)遺傳改良具有重要意義。小麥品質(zhì)性狀非常復(fù)雜,過去研究多局限于單一或個(gè)別性狀的影響和調(diào)控分析,研究方法也多是統(tǒng)計(jì)分析,很少在全基因組水平全面解析小麥品質(zhì)的遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。RNA-Seq技術(shù)的發(fā)展,為從轉(zhuǎn)錄組水平全面解析小麥品質(zhì)遺傳調(diào)控提供了可能。Yu等[6]通過動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)錄組分析,鑒定出8個(gè)對(duì)淀粉與蛋白質(zhì)合成以及壓力脅迫響應(yīng)相關(guān)的基因。利用我們前期研究中篩選出的6類有代表性的小麥材料:面包優(yōu)質(zhì)小麥、面包劣質(zhì)小麥、面條優(yōu)質(zhì)小麥、面條劣質(zhì)小麥、面包和面條兼優(yōu)小麥、面包和面條均劣小麥各2份,本研究利用RNA-Seq技術(shù)分析了其灌漿不同時(shí)期(開花后7、17、27 d)的基因表達(dá)情況,以期篩選調(diào)控面包、面條品質(zhì)性狀的差異基因和調(diào)控因子,結(jié)合蛋白和淀粉理化特性篩選關(guān)鍵基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證,這對(duì)全面解析小麥品質(zhì)遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、促進(jìn)小麥品質(zhì)遺傳改良具有重要意義。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料與種植方法

    供試品種為6類12個(gè)小麥品種,分別是面包優(yōu)質(zhì)小麥(GB)JM4072、ZM12,面條優(yōu)質(zhì)小麥(GN)JM19、ZM18,面包劣質(zhì)小麥(BB)TN18、QF1,面條劣質(zhì)小麥(BN)LM1、LM19,面包面條均優(yōu)小麥(GBN)JM20、ZM366,面包面條均劣小麥(BBN)LM14、XM18。

    試驗(yàn)于2014—2016年在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)站(36°42′N、117°05′E)進(jìn)行。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),播種密度為3×106株/hm2,行距25 cm,小區(qū)面積6 m2(4.0 m×1.5 m),重復(fù)3次。2014年10月和2015年10月播種,2015年6月和2016年6月收獲,均按高產(chǎn)田常規(guī)栽培措施管理。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 樣本采集及RNA提取、純化 分別于花后7、17、27 d取同一天開花的小穗中部籽粒,送至廣州基迪奧生物科技有限公司,利用Trizol法提取總RNA,采用DNaseⅠ(RNase-free)消化所得RNA樣本中的殘余DNA。

    1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測序 樣品提取總RNA后,經(jīng)富集、打斷、六堿基隨機(jī)引物(random hexamers)合成、末端修復(fù)、加堿基A、加測序接頭、PCR擴(kuò)增等過程制備測序文庫,構(gòu)建好的文庫用Illumina-HiSeqTM進(jìn)行測序。

    1.2.3 RNA-Seq質(zhì)量評(píng)估和序列比對(duì) 在全部測序結(jié)果中選擇錯(cuò)誤率小于1%的用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組分析,更嚴(yán)格過濾得到high quality clean reads,同時(shí)計(jì)算Q20和Q30。小麥參考基因組從http://www.wheatgenome.org/下載,選取HISAT軟件將過濾后的測序序列進(jìn)行基因組定位分析。樣本之間(包括3個(gè)生物學(xué)重復(fù))的基因表達(dá)水平則采用皮爾遜相關(guān)性檢測進(jìn)行分析。

    1.2.4 差異基因篩選 將同一類型的兩個(gè)品種作為一組,進(jìn)行不同組間小麥品種的差異基因分析?;虮磉_(dá)量的計(jì)算采用FPKM(fragments per kilobase of exon per million fragments mapped reads)法[7]。使用DESeq R軟件包(1.18.0)[8]對(duì)不同類型小麥之間的差異表達(dá)基因進(jìn)行研究。當(dāng)FDR校正后的p值<0.05且時(shí)則認(rèn)為該基因表達(dá)差異顯著。

    1.2.5 GO注釋和KEGG分析 Gene Ontology(簡稱GO,http://www.geneontology.org/)富集分析采用軟件為GOseq[9],GO分為分子功能(molecular Function)、生物過程(biological process)和細(xì)胞組成(cellular component)三個(gè)部分。

    KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,http://www.kegg.jp/)是系統(tǒng)分析基因功能、基因組信息數(shù)據(jù)庫,分析內(nèi)容包括碳水化合物、核苷、氨基酸等的代謝及有機(jī)物的生物降解[10]。

    1.2.6 qRT-PCR驗(yàn)證 為了驗(yàn)證RNA-Seq檢測出的基因表達(dá)水平是否正確,從RNA-Seq測序用總RNA中取出1μg用于qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。使用Primer Premier 5軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì),引物序列由擎科生物技術(shù)有限公司合成,釆用PAGE純化(表1)。

    使用羅氏公司的LightCycler 480Ⅱ進(jìn)行熒光定量PCR。熒光定量PCR反應(yīng)體系10μL包括:2×SYBR Premix Ex TaqⅠ5μL,正向引物與反向引物各0.5μL,cDNA 1μL,ddH2O 3μL。PCR程序?yàn)椋?5℃1 min預(yù)變性;40×(95℃15 s,55℃15 s,72℃15 s)收集熒光信號(hào);95℃1 s,60℃1 s,95℃1 s,37℃1 s為熔解曲線階段。采用2-ΔΔCt法[11]分析目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 測序結(jié)果質(zhì)量評(píng)估

    對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾去除大量的測序接頭序列、低質(zhì)量的讀段、序列N的比例大于10%的reads,最終得到2 882 357 526條clean reads,每個(gè)樣本測序量超過10 G,達(dá)到文庫采樣深度的要求。質(zhì)量達(dá)到Q30級(jí)別的堿基占總堿基數(shù)的84%以上(表2)。51%以上的reads可以比對(duì)到參考基因組上,50%以上的reads能夠比對(duì)到唯一轉(zhuǎn)錄本上,2%左右的reads可比對(duì)到多個(gè)轉(zhuǎn)錄本上。且reads打斷隨機(jī)性好,在參考基因組各個(gè)位置分布均勻。比對(duì)到唯一轉(zhuǎn)錄本的reads可以用來進(jìn)行下一步的分析工作。

    表2 RNA-Seq測序結(jié)果質(zhì)量評(píng)估

    2.2 不同類型面包、面條小麥不同時(shí)期差異表達(dá)基因的分析

    為了鑒別6類不同加工品質(zhì)小麥的差異表達(dá)基因(DEGs),對(duì)組間基因表達(dá)量進(jìn)行了比對(duì)分析。以同期GB小麥為對(duì)照,花后7 d共找到4 529個(gè)差異表達(dá)基因,其中有2 549、1 980個(gè)基因表達(dá)量分別呈上調(diào)和下調(diào);花后17 d共找到3 198個(gè)差異表達(dá)基因,其中有1 775、1 423個(gè)基因表達(dá)量分別呈上調(diào)和下調(diào);花后27 d共找到2 955個(gè)差異表達(dá)基因,其中,1 731、1 224個(gè)基因表達(dá)量分別呈上調(diào)和下調(diào)(圖1)。6類品種在花后7 d差異表達(dá)基因最多,其次是花后17 d,花后27 d最少,這可能是因?yàn)楣酀{前期籽粒膨大生長階段差異基因較多。

    圖1 不同類型小麥組間差異表達(dá)基因的維恩圖

    2.3 差異表達(dá)基因的篩選及GO注釋和KEGG分析

    發(fā)現(xiàn)花后7、17、27 d分別有1 743、1 195、981個(gè)DEGs在優(yōu)質(zhì)小麥(GN與GBN)中上調(diào),在劣質(zhì)小麥(BB、BN與BBN)中下調(diào),對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行GO功能分類分析發(fā)現(xiàn),三個(gè)時(shí)期差異基因均主要分布在生物過程(biological process)的metabolic process和cellular process、細(xì)胞成分(cell component)的cell和cell part以及分子功能(molecular function)的binding和catalytic activity中。

    利用KEGG分析研究了與品質(zhì)相關(guān)的生物代謝通路。發(fā)現(xiàn)花后7 d篩選出的1 743個(gè)DEGs被富集到103條通路中,包括DNA及RNA的合成及轉(zhuǎn)運(yùn)、碳循環(huán)、氮代謝、氨基酸代謝、淀粉及糖代謝等,富集DEGs數(shù)目最多的代謝通路有:protein processing in endoplasmic reticulum(36)、starch and sucrose metabolism(22)、spliceosome(20)、plant-pathogen interaction(18)、RNA transport(17)(圖2A)?;ê?7 d篩選出的1 195個(gè)DEGs被富集到98條通路中,包括DNA及RNA的合成及轉(zhuǎn)運(yùn)、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、氨基酸的生物合成、碳循環(huán)等,富集DEGs數(shù)目最多的代謝通路有:RNA transport(15)、spliceosome(12)、biosynthesis of amino acids(12)、plant-pathogen interaction(12)(圖2B)?;ê?7 d篩選出的981個(gè)DEGs被富集到89條通路中,包括DNA及RNA的合成及轉(zhuǎn)運(yùn)、氨基酸生物合成、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白合成、淀粉及糖代謝等,富集DEGs數(shù)目最多的代謝通路有:RNA transport(14)、protein processing in endoplasmic reticulum(10)、spliceosome(9)、biosynthesis of amino acids(9)、starch and sucrose metabolism(9)(圖2C)。

    2.4 蔗糖與淀粉代謝通路有關(guān)的差異基因分析

    對(duì)蔗糖與淀粉代謝通路進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),在以GB為對(duì)照的條件下,花后7、17 d及27 d BB與GB、BBN與GB間淀粉合成通路中差異表達(dá)基因最多。花后7 d,相較于GB小麥,其他類型小麥下調(diào)差異基因較多,花后17 d與花后27 d,BB小麥與GN小麥均為上調(diào)基因較多,其他類型為下調(diào)基因較多(表3)。

    圖2 花后7 d(A)、17 d(B)及27 d(C)差異表達(dá)基因KEGG富集分析

    對(duì)淀粉與蔗糖代謝通路的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析,以GB小麥為對(duì)照,從花后7 d的BB、GN、BN、GBN、BBN品種中分別篩選到14、5、8、6和12個(gè)差異表達(dá)基因,從花后17 d的BB、GN、BN、GBN、BBN品種中分別篩選到14、4、6、4和4個(gè)差異表達(dá)基因,從花后27 d的BB、GN、BN、GBN、BBN品種中分別篩選到7、4、7、4和5個(gè)差異表達(dá)基因,主要涉及糖代謝過程中的蔗糖合成酶(sucrose synthase,SuS,EC2.4.1.13)和轉(zhuǎn)化酶(invertase,INV,EC3.2.1.26)、蔗糖磷酸酯酶(sucrose phosphatase,SPP)、蔗糖磷酸合酶(sucrosephosphate synthase,SPS),淀粉代謝過程中的去分支酶(debranching enzyme,DBE)、α-淀粉酶(alpha-amylase,EC3.2.1.1)和 β-淀粉酶(beta-amylase,EC3.2.1.2)。

    SPS基因花后7 d在BN小麥中上調(diào),花后17 d在BB小麥中下調(diào),花后27 d在GN、BN與BBN小麥中均上調(diào)。相反,SuS在花后7 d的BB、BN小麥中上調(diào),在GN與BBN中下調(diào),花后17 d的BB、GN、BN以及BBN小麥中均上調(diào),花后27 d的BB小麥中上調(diào);INV在花后7 d的BB、BN與GBN中均下調(diào),花后17 d在BB、BN和GBN小麥中均下調(diào),花后27 d在BB、GN、GBN、BBN小麥中均下調(diào)(表4—表6)。推測花后7 d GN小麥、GBN及BBN小麥蔗糖分解能力較弱;花后17 d GN小麥及BBN小麥蔗糖分解能力高于GB小麥;花后27 d GN、BN與BBN小麥的蔗糖合成能力高于GB小麥。

    6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶(glucose-6-phosphate isomerase,GPI,EC5.3.1.9)基因在花后7、17、27 d的BB小麥中均上調(diào)。DBE基因在花后不同時(shí)期其他5類小麥中均上調(diào),推測與成熟期GB小麥總淀粉含量最低一致。α-淀粉酶和β-淀粉酶基因在花后7 d的BB小麥中下調(diào),但花后17 d BB小麥中的α-淀粉酶上調(diào),可以進(jìn)一步推測是成熟期支鏈淀粉含量低于GB小麥的原因之一。

    表3 不同時(shí)期不同類型DEGs及與淀粉合成相關(guān)的DEGs匯總

    表4 花后7 d與蔗糖和淀粉代謝通路相關(guān)的DEGs

    表5 花后17 d與蔗糖和淀粉代謝通路相關(guān)的DEGs

    表6 花后27 d與蔗糖和淀粉代謝通路相關(guān)的DEGs

    2.5 qRT-PCR驗(yàn)證差異表達(dá)基因

    為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的真實(shí)性,從淀粉合成通路中隨機(jī)挑選了7個(gè)候選基因(Traes_7BL_11C5C7BC4、Traes_7AS_7D1CD8641、Traes_3B_55B913FD2、Traes_6BL_C22DEC10D、Traes_2AL_0C8275227、Traes_6BL_FC54B7E8F和Traes_7DS_E488AA1F2)進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證(圖3、4、5)。將驗(yàn)證結(jié)果與RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析,兩者的相關(guān)系數(shù)較高且表達(dá)趨勢基本相同,表明RNA-Seq的分析結(jié)果可靠。

    圖5 qRT-PCR驗(yàn)證花后27 d RNA-Seq結(jié)果

    3 討論與結(jié)論

    本研究采用RNA-Seq技術(shù)分析不同面包、面條品質(zhì)類型小麥在花后7、17、27 d的差異表達(dá)基因。以相同時(shí)期面包優(yōu)質(zhì)小麥為對(duì)照,分別發(fā)現(xiàn)4 529、3 198、2 955個(gè)差異表達(dá)基因。通過對(duì)不同加工品質(zhì)小麥差異表達(dá)基因的GO富集分析,發(fā)現(xiàn)不同類型小麥在淀粉代謝通路中的差異表達(dá)基因及其參與的生物過程以及本身的分子功能。與面包優(yōu)質(zhì)小麥進(jìn)行比較,不同類型小麥在花后不同時(shí)期差異表達(dá)的基因主要參與代謝過程、細(xì)胞生理過程、細(xì)胞、細(xì)胞組分、結(jié)合功能以及催化活性。對(duì)不同類型小麥的KEGG通路注釋結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同類型小麥之間的差異表達(dá)基因在蛋白質(zhì)合成的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工過程通路、淀粉和蔗糖代謝通路、剪接體通路、RNA轉(zhuǎn)錄通路、氨基酸合成通路以及核糖體通路等通路富集較多。

    淀粉與蔗糖代謝在植物發(fā)育、抗逆反應(yīng)等多個(gè)生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。小麥淀粉含量及特性對(duì)小麥品質(zhì)特別是面條品質(zhì)影響較大,培育面包面條兼優(yōu)小麥的其中一個(gè)思路即為在面包優(yōu)質(zhì)小麥的基礎(chǔ)上提高面條品質(zhì)。因此,我們重點(diǎn)對(duì)淀粉與蔗糖代謝通路進(jìn)行分析。對(duì)淀粉與蔗糖代謝通路的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析,以面包優(yōu)質(zhì)小麥為對(duì)照,從花后7、17、27 d的面包劣質(zhì)、面條優(yōu)質(zhì)、面條劣質(zhì)、包條兼優(yōu)以及包條均劣品種分別篩選到一些差異表達(dá)基因,主要涉及糖代謝過程中的蔗糖合成酶(SuS)和轉(zhuǎn)化酶(INV)、蔗糖磷酸酯酶(SPP)、蔗糖磷酸合酶(SPS),淀粉代謝過程中的去分支酶(DBE)、α-淀粉酶和β-淀粉酶。在蔗糖代謝方面,蔗糖在蔗糖合酶和轉(zhuǎn)化酶調(diào)控下參與淀粉的合成[12],蔗糖磷酸酯酶和蔗糖磷酸合酶在蔗糖合成中起關(guān)鍵作用[13,14]。INV對(duì)蔗糖的水解作用是單向的,而SuS能可逆地催化蔗糖代謝,通常認(rèn)為SuS主要起水解蔗糖的作用。SPS在碳水化合作物代謝方面發(fā)揮重要作用,可以調(diào)控碳在淀粉合成和碳水化合物積累間的分配[15]。

    催化6-磷酸果糖和6-磷酸葡萄糖相互轉(zhuǎn)化的6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶(GPI)[16]基因在花后7、17、27 d的BB小麥中均上調(diào),而6-磷酸葡萄糖是合成ADPG的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[17],因此推測BB籽粒中ADPG的合成能力高于GB小麥,這與BB小麥具有最高的總淀粉及直鏈淀粉含量相符合。α-淀粉酶與β-淀粉酶是淀粉水解過程中的關(guān)鍵酶,其中α-淀粉酶可以水解淀粉內(nèi)部的α-1,4-糖苷鍵,β-淀粉酶能將直鏈淀粉分解為麥芽糖;淀粉脫支酶(DBE)專一水解α-1,6-糖苷鍵,支鏈淀粉經(jīng)淀粉酶水解產(chǎn)生的極限糊精,由脫支酶水解去除α-1,6-糖苷鍵,再在α-淀粉酶和β-淀粉酶的作用下徹底水解[18]。

    不同品質(zhì)類型小麥籽粒中蔗糖代謝形成淀粉合成前體的相關(guān)酶類(SPS、INV、SuS)以及淀粉代謝相關(guān)酶類(DBE、α-淀粉酶與β-淀粉酶)存在差異,是總淀粉含量及其組分的差異原因之一。面包劣質(zhì)小麥籽粒淀粉含量及直鏈淀粉含量均高于面包優(yōu)質(zhì)小麥,可能是由于其6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶基因的高表達(dá)導(dǎo)致。其他5類小麥品種中DBE與α-淀粉酶基因均高于面包優(yōu)質(zhì)小麥,可能是面包優(yōu)質(zhì)小麥總淀粉含量較低、支鏈淀粉含量較高的原因。因此調(diào)控籽粒蔗糖代謝通路以及淀粉水解通路可以作為調(diào)控小麥加工品質(zhì)的新思路。

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