蘭州百合病毒RT-PCR檢測技術建立及應用

王紅梅 王立光 劉新星 李淑潔 石有太 李忠旺

摘要：病毒病是引起蘭州百合產(chǎn)量下降、品種退化的主要原因，準確、高效的病毒檢測技術在百合脫毒種球生產(chǎn)和推廣應用中十分重要。根據(jù)CMV、LSV和LMoV病毒外殼蛋白基因序列設計引物，以百合18S rRNA為內(nèi)參照，建立蘭州百合病毒RT-PCR、二重RT-PCR檢測體系。對蘭州百合主栽區(qū)病毒病的抽樣調(diào)查發(fā)現(xiàn)，CMV、LSV帶毒率分別達到98%、100%，LMoV檢出率在不同時期樣品中存在較大差異。

關鍵詞：蘭州百合;病毒檢測;反轉錄-聚合酶鏈式反應;病毒病調(diào)查

Abstract：Virus disease is the main cause of yield decline and variety degradation of Lilium davidii Var. unicolor. It is very important to master efficient virus detection technologies in the production of virus-free bulb seedball and planting period. The PCR primers were designed according to the sequences of CMV， LSV and LMoV virus coat protein genes， and the virus detection system of RT-PCR and double RT-PCR was established with lily 18S rRNA as internal reference in this study. The results showed that sampling survey of Lilium davidii Var. unicolor. virus disease in main planting area， CMV and LSV were 98% and 100% respectively， and detection rates of LMoV were different in different periods samples.

Key words：Lilium davidii Var. unicolor; Virus detection; RT-PCR; Virus survey

蘭州百合（Lilium davidii Var. unicolor）屬百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium）多年生球根類草本植物，是蘭州市最具特色的名優(yōu)特農(nóng)產(chǎn)品之一，為中國國家地理標志保護產(chǎn)? ? ?品[1 ]，2014年“蘭州百合”被國家工商總局認定為“中國馳名商標”[2 ]。蘭州百合因鱗莖瓣大肉厚，色澤潔白如玉，味醇香甜，營養(yǎng)豐富，藥食同源，素有“蘭州百合甲天下”之美譽[3 ]。與其他旱地農(nóng)作物相比，蘭州百合在經(jīng)濟效益上有著明顯的優(yōu)勢，2016年僅蘭州市七里河區(qū)西果園百合種植面積0.38萬hm2，產(chǎn)量0.197萬t，實現(xiàn)產(chǎn)值達8.36億元。蘭州百合多年來靠對自然生長的母籽進行繁育， 種球退化導致蘭州百合產(chǎn)量下降，尤其病毒病是引起蘭州百合產(chǎn)量下降、品種退化的主要原因[4 ]，準確、高效的病毒檢測技術在百合脫毒種球生產(chǎn)中十分重要。近年來蘭州百合種植規(guī)模不斷擴大，但由于種源退化問題引起百合產(chǎn)量不穩(wěn)定、品質(zhì)良莠不齊、價格大幅度波動、市場萎縮等現(xiàn)象，嚴重制約了蘭州百合產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展。生產(chǎn)用百合種球繁殖通過籽球、鱗片扦插等方式進行， 而長期的無性繁殖極易造成病毒病害的傳播和積累， 一般發(fā)病率在65%～70%，二代種球的帶病率在95%以上[5 ]。百合感染病毒后終身帶毒，病毒侵入會破壞植株正常的生理機制，出現(xiàn)花葉、矮化、畸形、壞死等癥狀，致使生長衰弱、產(chǎn)量下降、品質(zhì)變劣、種性退化，一般種植2 a后失去商品價值[6 ]。植物病毒分布廣、繁殖快、防治難，有植物“癌癥”之稱。據(jù)統(tǒng)計，全世界每年因病毒病導致的糧食作物損失高達200億美元，經(jīng)濟作物因病毒病造成的損失每年高達600億美元[7 - 8 ]。據(jù)調(diào)查，浸染百合的病毒種類有20多種，危害蘭州百合的主要病毒有黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）、百合無癥病毒（Lily symptomless virus， LSV）、百合斑駁病毒（Lily mottle virus， LMoV）3種[9 - 10 ]。目前，生產(chǎn)和應用脫毒種球是控制蘭州百合病毒病的有效途徑，而準確、高效的病毒檢測手段是百合脫毒種球生產(chǎn)環(huán)節(jié)的核心技術。

植物病毒檢測方法主要有生物學檢測法、電子顯微鏡法、血清學檢測法和分子生物學方法等，不同方法在時效性、可操作性、準確性、靈敏度等方面各有優(yōu)缺點。RT-PCR技術因特異性強、靈敏度高、簡便快速等優(yōu)點，近年來在百合病毒檢測方面得到了一定的應用[9 - 12 ]。由于研究材料來源和試驗條件的不同，我們早期曾借鑒前人的研究成果用于蘭州百合病毒檢測，但出現(xiàn)PCR擴增片段大小與預期不符，或者無擴增產(chǎn)物等問題。我們又以蘭州百合主栽區(qū)病毒病危害嚴重的植株為材料，根據(jù)CMV、LSV和LMoV病毒外殼蛋白基因保守序列設計并合成引物，以百合18S rRNA為參照，改進了蘭州百合RT-PCR病毒檢測技術體系，以期為百合脫毒種苗和種球的生產(chǎn)以及田間病毒病調(diào)查研究提供技術支持。

1? ?材料與方法

1.1? ?材料來源

供試蘭州百合分別從主栽區(qū)七里河區(qū)西果園鄉(xiāng)、榆中縣園子岔鄉(xiāng)和永靖縣關山鄉(xiāng)采集。田間調(diào)查發(fā)病情況，選取發(fā)病嚴重的植株采集新鮮葉片，保存于液氮中帶回實驗室用于RNA提取。

1.2? ?試驗方法

1.2.1? ? 總RNA的提取? ? 稱取0.15 g 百合葉片在液氮中研磨。RNA提取按照天根生化科技有限公司生產(chǎn)的DP441 RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說明進行，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果;RNA反轉錄參照天根 KR116 FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒說明進行，RNA和cDNA濃度和質(zhì)量檢測在超微量分光光度計NanoDropTM ONE上進行。采用RNase-Free ddH2O將樣品cDNA稀釋到50 ng/uL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2? ? 引物設計? ? 根據(jù)NCBI Genbank登錄的百合CMV、LSV、LMoV病毒外殼蛋白基因序列和百合18S rRNA基因序列保守區(qū)段，應用Primer premier 5.0 軟件和Oligo 6.22軟件設計引物，分別設計CMV引物4對、LSV引物3對、LMoV引物5對。百合18S rRNA引物參照張玉寶等[11 ]的方法，引物委托北京Invitrogen生物技術有限公司合成。

1.2.3? ? RT-PCR、多重RT-PCR擴增與產(chǎn)物檢測? ? 首先采用百合18S rRNA引物進行擴增，PCR擴增體系為15 μL：模板cDNA 0.5 μL（25 ng），2×Taq PCR MasterMix（中科瑞泰北京生物科技有限公司）7.5 μL，上下游引物各1 μL（10 μmoL/L），ddH2O 5 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s，42～60 ℃梯度退火30 s，72 ℃延伸40 s，34個循環(huán);72 ℃延伸10 min，4℃保存。PCR反應在BIO-RAD T100TM型擴增儀中進行，PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，1×TAE緩沖液，100 V穩(wěn)壓電泳大約30 min，采用BIO-RAD ChemiDoc XRS+凝膠成像系統(tǒng)觀察結果。

通過上述方法對PCR反應體系和反應程序優(yōu)化，確定不同引物退火溫度，篩選出特異性高、穩(wěn)定性好、PCR產(chǎn)物電泳條帶亮度強的引物。選擇使用退火溫度一致、擴增片段差別較大的引物建立多重PCR，PCR擴增體系為30 μL：模板cDNA 1 μL（50 ng），2×Taq PCR MasterMix（中科瑞泰北京生物科技有限公司）15 μL，第1組上下游引物各1 μL，第2組上下游引物各1 μL，ddH2O 10 μL。PCR反應程序、產(chǎn)物檢測與成像方法同上。

1.2.4? ? RT-PCR產(chǎn)物回收和測序? ? 采用天根Universal DNA 純化回收試劑盒對百合病毒RT-PCR產(chǎn)物進行回收，回收產(chǎn)物與T載體連接、轉化大腸桿菌感受態(tài)，挑取陽性克隆，送金唯智生物科技有限公司進行測序，測序結果采用NCBI Blast軟件進行同源性比較分析。

1.2.5? ? 田間病毒病調(diào)查? ? 在蘭州百合苗期（5月中旬）和植株停止生長期（9月上旬），從百合主栽區(qū)（西果園鄉(xiāng)、園子岔鄉(xiāng)、關山鄉(xiāng)）不同田塊，隨機各選取50株百合采集葉片，保存于液氮中帶回以備檢測。

2? ?結果與分析

2.1? ?百合葉片總RNA提取

百合葉片總RNA提取后，采用超微量分光光度計測定了波長230、260、280 nm下的吸光度，吸光值OD260/OD280在1.8～ 2.1范圍內(nèi)，說明提取的RNA蛋白或其他有機溶劑基本去除干凈;OD260/OD230>2.0，表明無異硫氰酸胍殘留。瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA結果顯示，28S和18S條帶清晰亮度強，5S條帶較弱（圖1），無拖尾現(xiàn)象，表明 RNA完整性較好，符合下一步RNA反轉錄試驗要求。cDNA第一鏈合成后采用超微量分光光度計測定了濃度，濃度范圍800～? ?1 000 ng/uL內(nèi)，完全能夠滿足PCR擴增需求。

2.2? ?百合病毒特異性引物篩選

以百合18S rRNA引物作為內(nèi)參照，對cDNA進行擴增，產(chǎn)物出現(xiàn)了大約300 bp的目標片段（圖2），證明提取的百合RNA質(zhì)量可信。進一步通過采用梯度PCR和調(diào)整反應程序，從設計的百合CMV、LSV、LMoV三種病毒引物中，篩選到了5對目標條帶清晰、重復性好的特異性引物可用于百合病毒檢測（表1）。

2.3? ?百合病毒多重RT-PCR體系建立

以前期建立的單重RT-PCR體系為基礎，綜合考慮各引物退火溫度、目標片段大小和條帶清晰度等因素組配多重PCR，擴大PCR反應體系到30 uL，在退火溫度為58 ℃時引物A1和B2在同一反應體系中擴增，電泳檢測顯示兩條清晰的擴增片段，與預期736 bp的LSV和248 bp 的CMV片段大小相相吻合（圖3），說明該二重PCR具有較高的特異性，可用于蘭州百合CMV、LSV病毒檢測研究。LMoV引物C1擴增產(chǎn)物（252 bp）與CMV（248 bp）、18S rRNA（303 bp）的PCR產(chǎn)物片段大小接近，電泳條帶難以區(qū)分，還需要設計更為理想的引物。

2.4? ?RT-PCR產(chǎn)物序列分析

對百合病毒CMV、LSV、LMoV PCR擴增片段測序，測得全長序列分別為248、736、252 bp，與預期長度一致。采用NCBI Blast軟件進行基因序列比對分析，發(fā)現(xiàn)CMV序列與與已報道的11個百合病毒序列同源性達98%，LSV序列與已報道的14個百合病毒序列同源性達99%，LMoV序列與8個百合病毒序列同源性達97%。序列比對同源性很高，說明本研究設計合成的引物擴增得到的基因片段確為百合CMV、LSV 和LMoV，這些引物可用于百合病毒檢測。

2.5? ?蘭州百合病毒病田間發(fā)生情況

于5月中旬和9月上旬從蘭州百合主栽區(qū)取樣，分別以A1、B2和C1引物進行PCR擴增，結果顯示，CMV、LSV檢出率在兩批樣品之間沒有明顯差異，合計檢出率分別為98%、100%，說明CMV和LSV感染率非常高，是浸染蘭州百合的主要病毒。LMoV在5月中旬的樣品中帶毒率為80%，在9月初已停止生長、近乎枯萎的樣品檢出率為16%，LMoV檢出率在不同時期樣品中存在較大差異（圖4）。

3? ?結論與討論

根據(jù)genbank登錄的百合病毒外殼蛋白基因序列設計新的引物，篩選出重復性好、能特異性檢測CMV的引物2對、LSV引物2對、LMoV引物1對，可用于蘭州百合病毒檢測。優(yōu)化的PCR反應體系和反應條件是保證RT-PCR擴增成功的關鍵。本研究采用2×Taq PCR MasterMix，通過試驗確定模板cDNA和引物濃度，設置溫度梯度篩選適宜的引物退火溫度。在保證每一對單獨引物與模板能夠特異性地產(chǎn)生產(chǎn)物的基礎上，根據(jù)退火溫度接近、具有高度特異性的目標片段，且不同擴增片段能有效區(qū)分的原則建立多重PCR體系。最終CMV引物A1和LSV引物B2在同一PCR反應體系中得到了特異性擴增，取得了與預期片段大小一致的擴增產(chǎn)物。二重RT-PCR技術的建立，可提高蘭州百合CMV和LSV檢測效率、降低試驗成本，具有一定的實際應用價值。

研究結果表明，蘭州百合田間病毒病CMV、LSV檢測結果在2批樣品之間沒有明顯差異，檢出率分別為98%、100%，說明蘭州百合主要感染病毒為CMV和LSV，這與王發(fā)林等[13 ]的研究一致。LMoV檢出率在不同時期樣品中存在較大差異，5月中旬苗期樣品檢出率為80%，9月初已停止生長的樣品檢出率為16%，說明LoMV檢出率與植株發(fā)育時期有關。百合病毒病發(fā)病程度與寄主生長周期呈正相關，其發(fā)生受多種條件影響，如溫度、生長發(fā)育時期、傳毒介體等，如溫度是百合病害病發(fā)生有重要影響的環(huán)境因素之一[14 - 16 ]。有研究認為，氣溫在20 ℃以下時，百合發(fā)病程度較輕，但隨氣溫升高百合發(fā)病程度不斷加重，當氣溫達到35 ℃以上時病情開始減輕，并隨著持續(xù)高溫出現(xiàn)隱癥現(xiàn)象[16 - 17 ]。百合苗期很容易感染病毒病，發(fā)病率和病情指數(shù)不斷升高，在顯蕾期發(fā)病率最高，病情指數(shù)也較高，在花期出現(xiàn)隱癥現(xiàn)象[14 ]。一般植物病毒只有在寄主活體內(nèi)才具有活性，僅少數(shù)植物病毒可在病株殘體中保持活性幾天或幾個月，病毒入侵與植物調(diào)控生長發(fā)育進程以及生物和非生物應激反應的抗病毒機制有關[18 ]。因此，百合病毒檢測率高低與病毒活性及對寄主入侵機制相關。

病毒病是無性繁殖植物的常見病害，其分布廣、危害大， 且多為復合感染，主要通過蚜蟲等昆蟲媒介和土壤、機械損傷傳播，傳播速度快，有日益嚴重的趨勢。植物病毒病防治方法主要有抗病毒育種、使用化學農(nóng)藥和推廣應用脫毒種苗，但抗病育種存在基因資源匱乏、育種周期長、效率低下，使用化學藥劑或生物制劑對植物病毒病尚不能進行直接有效防治[19 ]。因此，生產(chǎn)和種植脫毒種苗，進行“無毒化”栽培成為控制植物病毒病的主要措施，而準確、高效的病毒檢測是把好種源關、實現(xiàn)“無毒化”栽培必不可少的首要環(huán)節(jié)。

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（本文責編：楊? ? 杰）