狼瘡腎炎患者不典型抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體檢測(cè)的臨床意義

陳惠娟，詹富國(guó)，高麗欽，荀振，梁曉華，歐啟水

(1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科，福州 350005；2.福建醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，福州 350005)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)是臨床常見(jiàn)的自身免疫病，它是一種免疫反應(yīng)介導(dǎo)的，以免疫性炎癥為主要表現(xiàn)的彌漫性結(jié)締組織病[1]。在疾病的發(fā)展過(guò)程中，很多患者會(huì)出現(xiàn)腎臟受累，導(dǎo)致狼瘡腎炎(lupus nephritis，LN)，而腎功能衰竭是SLE患者死亡的主要原因之一?？怪行粤＜?xì)胞胞質(zhì)抗體(antineutrophil cytoplasmic antibody，ANCA)是以中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞胞質(zhì)成分為靶抗原的自身抗體。1982年，Davies等[2]報(bào)道在節(jié)段性壞死性腎小球腎炎患者血清中發(fā)現(xiàn)了ANCA， 以后陸續(xù)在多種疾病(肉芽腫性多血管炎、系統(tǒng)性血管炎和原發(fā)性壞死性新月體性腎小球腎炎)患者中檢測(cè)到ANCA[3-4]。ANCA可以活化補(bǔ)體，通過(guò)該途徑引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致小血管壁炎癥和纖維素樣壞死，損傷腎臟和其他臟器[5]。而也有不少研究報(bào)道SLE患者體內(nèi)也存在ANCA，且ANCA陽(yáng)性的SLE患者發(fā)生LN的可能性更大[6]。目前實(shí)驗(yàn)室的ANCA檢測(cè)方法主要為ELISA和間接免疫熒光法(indirect immunofluorescence assay，IIF)[7]。IIF-ANCA檢測(cè)根據(jù)乙醇和甲醛固定的人中性粒細(xì)胞中ANCA顆粒呈現(xiàn)的熒光染色形態(tài)的不同，可分為陰性、核周型(peripheral ANCA，pANCA)、胞質(zhì)型(cytoplasmic ANCA，cANCA)和不典型(atypical ANCA，aANCA)。一般認(rèn)為，pANCA的靶抗原主要是髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)；cANCA的靶抗原主要是蛋白酶3(proteinase 3，PR3)；aANCA的靶抗原目前尚未確認(rèn)。國(guó)內(nèi)外有不少關(guān)于LN患者血清ANCA的研究，但主要針對(duì)pANCA和cANCA[8-9]，對(duì)aANCA的報(bào)道較少。本研究旨在探究LN患者血清aANCA與實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)的關(guān)系，幫助業(yè)內(nèi)提高對(duì)此類患者的認(rèn)識(shí)，以期為臨床工作提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象收集整理2010年1月至2018年12月于福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科住院治療的aANCA陽(yáng)性LN患者(25例)臨床及實(shí)驗(yàn)室資料。LN患者的納入標(biāo)準(zhǔn)符合1997年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)修訂的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)腎活檢確診為L(zhǎng)N；排除藥物性SLE和藥物導(dǎo)致的ANCA假陽(yáng)性病例。同時(shí)，收集同期ANCA陰性的LN患者(61例)臨床及實(shí)驗(yàn)室資料作為對(duì)照。在LN治療過(guò)程中，部分患者發(fā)生ANCA熒光模型轉(zhuǎn)換，如血清aANCA陽(yáng)性轉(zhuǎn)換為ANCA陰性，或者由ANCA陰性轉(zhuǎn)換為aANCA陽(yáng)性。收集分析aANCA發(fā)生血清轉(zhuǎn)換的LN患者的實(shí)驗(yàn)室資料，進(jìn)行深入比較分析。收集的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)包括ANCA、抗核抗體(antinuclear antibody, ANA)(ELISA法)、抗dsDNA抗體、抗核抗體譜[歐蒙印跡法，包括抗核糖核蛋白(nuclear ribonucleoprotein， nRNP)/Smith(簡(jiǎn)稱Sm)、抗Sm、抗SS-A、抗SS-B、抗Ro-52、抗Scl-70、抗Jo-1、抗CENPB、抗組蛋白、抗核小體、抗核糖體P蛋白抗體]，補(bǔ)體C3、C4，血常規(guī)、總蛋白、血清白蛋白、肌酐、尿素、尿酸、胱抑素C、尿常規(guī)等。研究過(guò)程中患者或其家屬獲得充分告知并簽署知情同意書，研究獲得福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑與儀器6種自身抗體檢測(cè)試劑盒[包括抗MPO IgG抗體(ELISA法)、抗PR3 IgG抗體(ELISA法)、抗dsDNA IgG抗體(ELISA法)、抗核抗體譜IgG(ELISA法)、抗核抗體譜IgG(歐蒙印跡法)、抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)/抗腎小球基底膜IgG抗體(IIF)]，均購(gòu)自歐蒙醫(yī)學(xué)診斷(中國(guó))有限公司；全自動(dòng)ELISA分析儀，來(lái)自TECAN公司；EUROStar Ⅲ Plus熒光光學(xué)顯微鏡、EURO Blot Master Ⅱ型全自動(dòng)免疫印跡儀，來(lái)自歐蒙醫(yī)學(xué)診斷(中國(guó))有限公司；IMMAGE 800特定蛋白分析儀，來(lái)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；Modular P800生化分析儀，來(lái)自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司；ADVIA 2120i血液分析儀，來(lái)自西門子(中國(guó))有限公司；AUTION MAX AX-4280全自動(dòng)尿液分析儀，來(lái)自愛(ài)科來(lái)國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司；UF-1000i全自動(dòng)尿液分析儀，來(lái)自希森美康醫(yī)用電子(上海)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本的采集 采集患者空腹靜脈血，進(jìn)行自身抗體及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的檢測(cè)。同時(shí)收集患者清晨尿液進(jìn)行尿常規(guī)檢測(cè)。

1.3.2 血清抗體的檢測(cè) 按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)血清ANCA水平，于熒光顯微鏡下觀察ANCA的熒光模型。其余自身抗體根據(jù)說(shuō)明書分別在全自動(dòng)ELISA分析儀和全自動(dòng)免疫印跡儀上檢測(cè)。

1.3.3 外周血樣本實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的檢測(cè) 補(bǔ)體C3、C4水平于IMMAGE 800特定蛋白分析儀上檢測(cè)；血清生化指標(biāo)于Modular P800生化分析儀上檢測(cè)；血常規(guī)分析于ADVIA 2120i血液分析儀上檢測(cè)。

1.3.4 尿液樣本的檢測(cè) 于AUTION MAX AX-4280全自動(dòng)尿液分析儀上檢測(cè)尿液，得到尿隱血、尿蛋白結(jié)果；于UF-1000i全自動(dòng)尿液分析儀上檢測(cè)尿沉渣結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的一般資料比較患者的一般情況如下(表1)，其中15例LN患者發(fā)生aANCA轉(zhuǎn)換，9例由aANCA陽(yáng)性轉(zhuǎn)換為ANCA陰性，6例由ANCA陰性轉(zhuǎn)換為aANCA陽(yáng)性；其中男性2例，女性13例。

表1 LN患者的一般情況

2.2 兩組患者自身抗體水平檢測(cè)結(jié)果的比較兩組患者抗MPO抗體和抗PR3抗體均呈陰性(表2)。aANCA陽(yáng)性組抗dsDNA抗體水平[(465.7±267.3) IU/mL]較ANCA陰性組[(252.9±258.0) IU/mL]顯著升高(P=0.001)，同時(shí)aANCA陽(yáng)性組抗核小體抗體陽(yáng)性率(59.09%)也顯著高于ANCA陰性組(26.23%)(P=0.010)，而其余抗體水平在兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)(表2)。就aANCA發(fā)生轉(zhuǎn)換的LN患者而言，aANCA陽(yáng)性和ANCA陰性患者的抗MPO抗體和抗PR3抗體也均呈陰性(表3)。aANCA陽(yáng)性組抗dsDNA抗體水平、抗組蛋白抗體和抗核小體抗體陽(yáng)性率較ANCA陰性組顯著升高[(465.7±287.7) IU/mLvs(246.8±230.2) IU/mL、60.00%vs20.00%、46.67%vs6.67%，P值分別為0.029、0.025和0.013]，而其余自身抗體陽(yáng)性率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)(表3)。

表2 aANCA陽(yáng)性和ANCA陰性組患者血清自身抗體水平的比較

表3 aANCA發(fā)生轉(zhuǎn)換的患者血清自身抗體水平比較

2.3 兩組患者的血常規(guī)結(jié)果比較兩組患者在白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)、血紅蛋白濃度、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值、血小板/淋巴細(xì)胞比值、血小板體積分布寬度上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05，表4)。就aANCA發(fā)生轉(zhuǎn)換的LN患者而言，兩組患者的血常規(guī)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05，表5)。

表4 aANCA陽(yáng)性和ANCA陰性組患者血常規(guī)比較

表5 aANCA發(fā)生轉(zhuǎn)換的患者血常規(guī)結(jié)果比較

2.4 兩組患者的血清生化及免疫學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較aANCA陽(yáng)性和ANCA陰性組患者在總蛋白、白蛋白、尿素、尿酸、肌酐、胱抑素C、估算腎小球?yàn)V過(guò)率 [estimated glomerular filtration rate, eGFR; (采用)慢性腎臟病流行病學(xué)合作研究組公式(the Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration equation, CKD-EPI公式)]等指標(biāo)上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05，表6)。aANCA陽(yáng)性組補(bǔ)體C3、C4水平顯著低于ANCA陰性組[(0.45±0.22) g/Lvs(0.58±0.25) g/L、(0.08±0.05) g/Lvs(0.12±0.07) g/L，P值分別為0.022、0.022，表6]。就aANCA發(fā)生轉(zhuǎn)換的LN患者而言，兩組患者的上述生化及免疫指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05，表7)。

表6 aANCA陽(yáng)性和ANCA陰性組患者血清生化及免疫學(xué)指標(biāo)比較

表7 aANCA發(fā)生轉(zhuǎn)換的患者血清生化及免疫學(xué)指標(biāo)比較

2.5 兩組患者的尿常規(guī)檢測(cè)結(jié)果比較與ANCA陰性組相比，aANCA陽(yáng)性組患者的尿隱血發(fā)生率顯著升高(96.00%vs75.41%，P=0.026，表8)；而尿紅細(xì)胞含量、白細(xì)胞含量、尿蛋白、尿液管型等指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05， 表8)。就aANCA發(fā)生轉(zhuǎn)換的LN患者而言，兩組患者的上述尿常規(guī)檢測(cè)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表9)。

表8 aANCA陽(yáng)性和ANCA陰性組患者尿常規(guī)檢測(cè)結(jié)果比較

表9 aANCA發(fā)生轉(zhuǎn)換的患者尿常規(guī)檢測(cè)結(jié)果比較

3 討論

SLE病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，可累及全身多個(gè)系統(tǒng)、器官，患者出現(xiàn)蝶形紅斑、發(fā)熱、尿血等癥狀。于SLE患者體內(nèi)可檢測(cè)到包括ANCA在內(nèi)的多種自身抗體。IIF和ELISA是ANCA推薦的檢測(cè)方法。

對(duì)aANCA的認(rèn)識(shí)晚于pANCA和cANCA。有報(bào)道在急性瘧疾[10]、慢性炎癥性腸病和自身免疫性肝病[11-12]及各種結(jié)締組織病[13](SLE、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等)患者血清中檢測(cè)到aANCA。Yahya等[10]發(fā)現(xiàn)急性瘧疾患者中49.50%呈aANCA陽(yáng)性，這部分患者中抗蛋白酶G抗體陽(yáng)性的占93.00%，抗MPO抗體陽(yáng)性的占2.00%，而抗PR3、人白細(xì)胞彈性蛋白酶、乳鐵蛋白酶等抗體檢出率均為0。Terjung等[11]也發(fā)現(xiàn)在慢性炎癥性腸病和自身免疫性肝病患者血清中aANCA呈陽(yáng)性。上海瑞金醫(yī)院腎內(nèi)科曾報(bào)道aANCA陽(yáng)性的結(jié)締組織病患者以肝臟、腎間質(zhì)病變較為突出[13]。本研究中，aANCA陽(yáng)性的LN患者的抗MPO抗體、抗PR3抗體均為陰性，這與此研究中aANCA陽(yáng)性的LN患者檢測(cè)結(jié)果一致。ANCA可引起中性粒細(xì)胞脫顆粒，產(chǎn)生具有致病作用的氧自由基，同時(shí)釋放出的中性粒細(xì)胞顆粒中的各種蛋白酶具有引起炎癥、組織破壞等作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，aANCA陽(yáng)性組的LN患者體內(nèi)抗dsDNA抗體滴度較ANCA陰性組更高(P=0.001)?？筪sDNA抗體與疾病活動(dòng)度有關(guān)，這預(yù)示著aANCA陽(yáng)性組的LN患者疾病活動(dòng)度較ANCA陰性組更高?；颊唧w內(nèi)持續(xù)存在的dsDNA-抗dsDNA抗體復(fù)合物沉積于腎小球、關(guān)節(jié)或血管基底膜，導(dǎo)致腎小球腎炎、關(guān)節(jié)炎等器官損害。循環(huán)免疫復(fù)合物是引起組織損傷的觸發(fā)因素，而非引起組織損傷的直接原因。LN患者體內(nèi)的循環(huán)免疫復(fù)合物可以通過(guò)補(bǔ)體的經(jīng)典激活途徑激活補(bǔ)體，在這過(guò)程中消耗補(bǔ)體C3、C4，使得血清中的C3、C4水平降低。本研究中aANCA陽(yáng)性組的LN患者體內(nèi)C3、C4含量均顯著低于ANCA陰性組(P值分別為0.022、0.022)，這與徐兆珍等[14]的報(bào)道一致。就aANCA發(fā)生轉(zhuǎn)換的LN患者而言，aANCA陽(yáng)性組C3、C4較ANCA陰性組降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，推測(cè)原因可能是樣本較少，今后可擴(kuò)大樣本量加以觀察比較。本研究還發(fā)現(xiàn)aANCA陽(yáng)性患者的抗核小體抗體陽(yáng)性率顯著高于ANCA陰性組(P=0.010)，這與鄭朝暉等[15]的報(bào)道一致。研究發(fā)現(xiàn)，抗核小體抗體參與了LN增生性病變的發(fā)生發(fā)展，可能與核小體-抗核小體抗體形成的抗原抗體復(fù)合物在腎小球基底膜沉積有關(guān)。他們還發(fā)現(xiàn)，抗核小體抗體陽(yáng)性可能預(yù)示著不良預(yù)后，因此aANCA陽(yáng)性合并抗核小體抗體陽(yáng)性的患者應(yīng)得到足夠的重視[15]。ANCA是小血管炎的生物標(biāo)志物，ANCA相關(guān)性血管炎(ANCA-associated vasculitis， AAV)具有非免疫復(fù)合物性小血管炎的病理特征。研究認(rèn)為SLE患者ANCA陽(yáng)性支持SLE與AAV重疊綜合征的學(xué)說(shuō)[16]。因此，臨床上ANCA陽(yáng)性的LN患者或許需要更積極有效的免疫抑制治療。

本研究未發(fā)現(xiàn)aANCA陽(yáng)性組與ANCA陰性組的血常規(guī)有明顯差異，這與王淵等[17]的報(bào)道一致。SLE患者發(fā)生LN時(shí)，腎功能已明顯受損。本研究顯示aANCA陽(yáng)性患者發(fā)生尿隱血的百分比更高，但其尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、尿蛋白、尿液管型與ANCA陰性患者相比并無(wú)顯著升高(P>0.05)。兩者血清中的尿素、肌酐、胱抑素C、eGFR-EPI等也沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。這與MPO-ANCA陽(yáng)性的LN病例相關(guān)報(bào)道不一致[17]。這可能是因?yàn)閍ANCA陽(yáng)性LN患者的靶抗原為MPO以外的某種或某些物質(zhì)，其致病機(jī)制或許與MPO陽(yáng)性組不同。

目前對(duì)aANCA陽(yáng)性LN患者的靶抗原尚未有統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)。本研究中所有aANCA陽(yáng)性患者的抗MPO抗體、抗PR3抗體均為陰性，以后需要對(duì)aANCA靶抗原做更多的探究。aANCA是否參與腎病致病過(guò)程抑或僅是機(jī)體免疫調(diào)節(jié)紊亂所產(chǎn)生的多克隆自身抗體之一仍有待深入探討。

綜上所述，aANCA陽(yáng)性LN患者體內(nèi)某些自身抗體水平異常升高，炎癥水平升高，提示aANCA可能參與LN的疾病發(fā)生發(fā)展。