常用組織材料脫細胞試劑殘留量與細胞毒性相關性研究

周建偉 白玉龍 李淼 沈亞俊 李矛

1首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院骨科，北京100730；2蘇州微創(chuàng)再生醫(yī)學科技有限公司215000；3上海亞朋生物技術有限公司201201；4首都醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院北京口腔醫(yī)學研究所，北京100050

0 引 言

近年來脫細胞基質一直是研究的焦點和熱點。動物源性組織如同種異體或異種骨、皮膚、肌腱、小腸黏膜等組織材料經脫細胞處理后可得到一種生物相容性優(yōu)良、免疫原性低的支架材料[1-3]。較之大部分合成材料，其具有無法比擬的天然結構，在去除了抗原成分的同時保留了一些對細胞增殖、分化有利的因子，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白、轉化生長因子β、血管內皮生長因子等，是一種較為理想的生物支架材料。在組織工程研究領域，脫細胞基質也表現(xiàn)出顯著的應用價值[4-5]。

常用的組織脫細胞試劑以十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate,SDS）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）和硫代甜菜堿10（sulfobetaine 10,SB-10）等表面活性劑為主，其不僅具有清潔組織的作用，對細胞的去除效果也得到了廣泛認可[1,6-7]。但上述表面活性劑均具有不同程度的毒性，若清洗不干凈，則殘留于脫細胞基質中的試劑會對機體造成不同程度的毒副作用[8]。在生物醫(yī)用材料轉化為醫(yī)療器械產品的過程中，對于試劑殘留也提出了控制要求，應明確試劑殘留限度值且試劑殘留不應導致細胞毒性。目前，尚未有人系統(tǒng)研究過常用組織脫細胞試劑SDS、Triton X-100和SB-10中一種或多種試劑殘留造成細胞毒性的臨界濃度。本研究即參照國標GB/T 16886.5中的細胞毒性檢測方法，探究不同脫細胞試劑單獨或混合使用對小鼠成纖維細胞L-929和小鼠胚胎成骨細胞MC3T3-E1兩種細胞系的細胞毒性。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

離子型表面活性劑SDS、非離子型表面活性劑Triton X-100（西安天正藥用輔料有限公司），兩性離子型表面活性劑SB-10（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），噻唑藍（上海碧云天生物技術有限公司），α-MEM培養(yǎng)基、質量濃度為2.5 g/L的胰蛋白酶（美國HyClone公司），青鏈霉素雙抗溶液（美國Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青生物有限公司），異丙醇（上海凌峰化學試劑有限公司），無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）（武漢賽維爾生物科技有限公司），L-929細胞、MC3T3-E1細胞（上海生命科學研究院細胞中心）。

ECLIPSE Ts2倒置顯微鏡（日本Nikon公司），QP-160 CO2培養(yǎng)箱（濟南鑫貝西生物技術有限公司），INFINITE 200 PRO多功能酶標儀（瑞士Tecan公司），H-1650R臺式高速冷凍離心機（湘儀離心機儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

L-929細胞和MC3T3-E1細胞均采用含體積分數(shù)為10%胎牛血清和1%青鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔1 d換液1次，細胞融合率達約90%時進行細胞傳代，采用質量濃度為2.5 g/L的胰蛋白酶溶液消化細胞。

1.2.2 噻唑藍實驗

分別取對數(shù)生長期的L-929細胞和MC3T3-E1細胞，消化制成單細胞懸液后計數(shù)，調整細胞濃度為1.0×105個/ml，按每孔100μl接種于96孔板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；吸棄培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，分別加入不同質量濃度的脫細胞試劑液，陰性對照組加入不含脫細胞試劑的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；吸棄培養(yǎng)液，每孔加入50μl質量濃度為1 g/L的噻唑藍溶液共培養(yǎng)4 h；吸棄噻唑藍溶液，每孔加入100μl異丙醇，采用酶標儀檢測各孔于570 nm處的吸光度值，計算細胞存活率。

細胞毒性判定：細胞活性下降大于30%認為有細胞毒性（定量）；可觀察到超過50%的細胞生長抑制現(xiàn)象，即超過50%的細胞呈圓縮狀、無胞質內顆粒，大范圍溶解（定性）。

2 結果

2.1 不同質量濃度脫細胞試劑對L-929細胞的細胞毒性

由圖1～3可知，3種脫細胞試劑（SDS、Triton X-100和SB-10）對L-929細胞的細胞毒性與其質量濃度呈依賴性關系，隨著脫細胞試劑質量濃度的增加，毒性也依次增大。當SDS質量濃度為1×10-3mg/ml時，細胞存活率為88.2%，表現(xiàn)出明顯的細胞毒性；當質量濃度增至1×10-2mg/ml時，細胞存活率降為45.7%，細胞毒性反應明顯；進一步稀釋檢測得出SDS無細胞毒性的臨界濃度為4×10-3mg/ml，高于該值則表現(xiàn)出顯著的細胞毒性。當Triton X-100質量濃度為1×10-2mg/ml時無細胞毒性，當質量濃度達1×10-1mg/ml時則表現(xiàn)為顯著的細胞毒性，進一步檢測得出Triton X-100無細胞毒性的臨界濃度為2×10-2mg/ml。當SB-10質量濃度為1×10-1mg/ml時無細胞毒性，當質量濃度為1 mg/ml時具有顯著的細胞毒性，進而檢測出其臨界濃度為6×10-1mg/ml。上述3種脫細胞試劑對L-929細胞產生毒性的臨界濃度大小依次為SB-10＞Triton X-100＞SDS。將上述臨界濃度的3種脫細胞試劑兩兩混合或3種共混加入L-929細胞培養(yǎng)24 h后，均未觀察到細胞毒性，表明這3種脫細胞試劑無毒性疊加效應（圖4）。

圖1 噻唑藍實驗檢測不同質量濃度的SDS對小鼠成纖維細胞L-929的細胞毒性

圖2 噻唑藍實驗檢測不同質量濃度的Triton X-100對小鼠成纖維細胞L-929的細胞毒性

圖3 噻唑藍實驗檢測不同質量濃度的SB-10對小鼠成纖維細胞L-929的細胞毒性

圖4 噻唑藍實驗檢測SDS、Triton X-100和SB-10混合對小鼠成纖維細胞L-929的細胞毒性

2.2 不同質量濃度脫細胞試劑對MC3T3-E1細胞的細胞毒性

由圖5～7可知，3種脫細胞試劑（SDS、Triton X-100和SB-10）對MC3T3-E1細胞的細胞毒性趨勢與L-929細胞大致相同，表現(xiàn)為SDS毒性最大（臨界濃度最?。?，Triton X-100次之，SB-10最小。當SDS質量濃度為1×10-3mg/ml時，細胞存活率為94.6%；質量濃度增至1×10-2mg/ml時，細胞存活率降至65.4%，且超過50%的細胞呈圓縮狀。當Triton X-100質量濃度為1×10-2mg/ml時，細胞存活率為77.2%；質量濃度增至1×10-1mg/ml時，細胞存活率降為32.1%，且大部分細胞呈死亡狀態(tài)。當SB-10質量濃度為1 mg/ml時，細胞存活率為79.6%；質量濃度增至10 mg/ml時，大部分細胞呈死亡狀態(tài)，細胞存活率為32.8%。進一步檢測得出SDS、Triton X-100和SB-10試劑對MC3T3-E1細胞產生毒性的臨界濃度分別為6×10-3、4×10-2、2 mg/ml，均高于對L-929細胞的臨界濃度。將上述臨界濃度的3種脫細胞試劑兩兩混合或3種共混加入MC3T3-E1細胞培養(yǎng)24 h后，均未觀察到細胞毒性，表明這3種脫細胞試劑無毒性疊加效應（圖8）。

圖5 噻唑藍實驗檢測不同質量濃度的SDS對小鼠胚胎成骨細胞MC3T3-E1的細胞毒性

圖8 噻唑藍實驗檢測SDS、Triton X-100和SB-10混合對小鼠胚胎成骨細胞MC3T3-E1的細胞毒性

3 討論與結論

圖6 噻唑藍實驗檢測不同質量濃度的Triton X-100對小鼠胚胎成骨細胞MC3T3-E1的細胞毒性

圖7 噻唑藍實驗檢測不同質量濃度的SB-10對小鼠胚胎成骨細胞MC3T3-E1的細胞毒性

表面活性劑在生活中極為常見，其分子結構一端為極性親水基團，另一端為非極性疏水基團。根據(jù)親水性頭部的帶電性質，表面活性劑可分為離子型、非離子型和兩性離子型。離子型表面活性劑又因所帶電荷不同，分為陽離子型和陰離子型。表面活性劑的獨特理化性質使其具有洗滌、分散、乳化、防腐、殺菌等作用，在民用、工業(yè)以及生物醫(yī)藥領域應用非常廣泛[9]。常見的表面活性劑有季銨化物、硬脂酸、SDS、甜菜堿、聚山梨酯和Triton X-100等。

在組織工程材料研究領域，脫細胞組織/器官因具有天然組織/器官的結構、較好的生物相容性、能為細胞和組織生長提供良好的生物學環(huán)境而被廣泛應用。表面活性劑則是最常用的脫細胞試劑，其可溶解細胞膜，使DNA與蛋白質分離，有效去除組織中的細胞成分，降低免疫原性，故被廣泛應用于同種或異種組織/器官的脫細胞過程[10]。但表面活性劑廣泛應用的同時也帶來了另一個問題：試劑殘留。筆者注意到研究者在使用表面活性劑制備脫細胞支架后，通常使用大量的水或PBS長時間清洗脫細胞支架，以求降低試劑殘留量。但卻很少有研究討論常用脫細胞試劑殘留量的限度值應為多少，而盲目清洗會造成時間和資源的浪費，甚至對脫細胞支架的性能造成不利影響[1,11]。因此，研究確定表面活性劑的安全濃度值，制定其殘留量控制標準顯得尤其重要。本研究即選擇常用的具有代表性的離子型表面活性劑SDS、非離子型表面活性劑Triton X-100以及兩性離子型表面活性劑SB-10，參照國標GB/T 16886.5細胞毒性檢測方法，以L-929細胞和MC3T3-E1細胞為模型，探究了上述3種表面活性劑單獨或混合使用的細胞毒性臨界濃度。

對于L-929細胞，SDS、Triton X-100和SB-10的細胞毒性臨界濃度分別為4×10-3、2×10-2和6×10-1mg/ml，毒性大小依次為SDS＞Triton X-100＞SB-10。這與表面活性劑本身的作用強弱有一定關聯(lián)，SDS是一種比較強力的表面活性劑，不僅可溶解細胞膜，還可能打破蛋白質分子內和分子間的相互作用，致使蛋白質變性[12]，故SDS表現(xiàn)出較強的細胞毒性。Triton X-100相對于SDS屬于較溫和的表面活性劑，其細胞毒性臨界濃度略低于SDS。兩性離子型表面活性劑SB-10最為溫和，其細胞毒性臨界濃度最大，分別為SDS和Triton X-100臨界濃度的150倍和30倍，表明其毒性最小。MC3T3-E1細胞呈現(xiàn)出與L-929細胞相似的趨勢，SDS、Triton X-100以及SB-10的臨界濃度分別為6×10-3、4×10-2和2 mg/ml。這與以往報道的其他離子型和非離子型表面活性劑細胞毒性數(shù)據(jù)基本一致，即毒性大小趨勢為陽離子型表面活性劑＞陰離子型表面活性劑＞非離子型表面活性劑[13-14]。本研究結果顯示，3種表面活性劑（SDS、Triton X-100和SB-10）對L-929、MC3T3-E1細胞產生毒性的臨界濃度不同，對MC3T3-E1細胞的臨界濃度大于對L-929細胞，提示表面活性劑對不同細胞的毒性作用/濃度可能存在差異。將上述臨界濃度的3種試劑兩兩混合或3種共混加入L-929、MC3T3-E1細胞培養(yǎng)后，均未觀察到細胞毒性，表明這3種試劑無毒性疊加效應。

雖然直接采用不同濃度的試劑進行細胞毒性實驗不能完全替代脫細胞支架試劑殘留的真實情況，但對于脫細胞支架而言，組織中的試劑殘留量應低于組織浸提、洗脫、消解后的試劑殘留量。本研究結果可為研究人員采用上述表面活性劑制備脫細胞支架提供一些安全性證據(jù)，以便在了解臨界濃度后采用多種試劑清洗工序高效清洗組織，使試劑殘留量低于臨界值，確保脫細胞支架的生物安全性。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突