MCM4/PCNA在胃癌組織中的表達(dá)及作為潛在生物標(biāo)志物的可能性研究

李小龍 宋瑞 李思 李曉寧 郭蘭栓

1保定市第一中心醫(yī)院普通外一科 071000；2保定市第一中心醫(yī)院普通外二科 071000

0 引言

胃癌是公認(rèn)的高惡性度、進(jìn)展迅速的消化道癌癥[1]。根據(jù)美國2021年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，導(dǎo)致患者死亡的最常見原因仍然是心血管疾病，其次就是癌癥，但兩者差距正在逐漸縮小[2-3]。胃癌的死亡率很高，美國在2021年約有26 560例新發(fā)病例，包括男性16 160例，女性10 400例；死亡病例11 180例，包括男性6 740例和女性4 440例[4]。由于胃癌的進(jìn)展迅速，許多患者在發(fā)病早期并無明顯癥狀，往往在診斷時(shí)已達(dá)晚期，導(dǎo)致其5年生存率很低。近年來，隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，胃癌患者的預(yù)后已經(jīng)大大改善。以外科手術(shù)為基礎(chǔ)，聯(lián)合化學(xué)治療、放射治療、靶向治療以及內(nèi)分泌治療的治療方法使胃癌患者的5年生存率大大提高，有的患者甚至能完全康復(fù)[5]。但是，目前臨床上對(duì)胃癌的診斷仍然缺乏靈敏的生物標(biāo)志物，大部分胃癌患者是在具有明顯癥狀之后通過胃鏡檢查確診的，極易錯(cuò)過最佳的治療時(shí)機(jī)[6-7]。因此，尋找靈敏且特異性高的胃癌診斷生物標(biāo)志物對(duì)于胃癌的診療具有極其重要的意義。

微小染色體維持蛋白4（mini-chromosome maintenance 4，MCM4）是高度保守的MCM蛋白，其對(duì)于真核生物基因組復(fù)制的啟動(dòng)至關(guān)重要[8]。MCM蛋白形成的六聚體蛋白復(fù)合物是復(fù)制前復(fù)合物(preRC)的關(guān)鍵組成部分，可能參與復(fù)制叉的形成和其他DNA復(fù)制相關(guān)蛋白的募集。由MCM2、4、6和7組成的MCM復(fù)合物具有DNA解旋酶活性，可作為DNA解旋酶[9]。MCM4的紊亂與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展顯著相關(guān)。例如，Issac等[10]發(fā)現(xiàn)MCM4可能是反映乳腺癌診斷和治療效果的一個(gè)良好指標(biāo)；Xie等[11]發(fā)現(xiàn)MCM4在卵巢癌中上調(diào)并與患者的預(yù)后顯著相關(guān)，是卵巢癌的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后因子；Yi等[12]發(fā)現(xiàn)MCM4是非小細(xì)胞肺癌發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)驅(qū)動(dòng)因子。上述研究結(jié)果表明，MCM4與眾多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展顯著相關(guān)，靶向MCM4可能是治療這些癌癥的一個(gè)新的治療方向。但MCM4與胃癌之間的關(guān)系尚不清楚。因此，研究MCM4與胃癌之間的關(guān)系，進(jìn)一步分析MCM4作為胃癌生物標(biāo)志物的可能性具有重要意義。

增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）主要存在于細(xì)胞核中，是DNA聚合酶delta的輔因子[13-14]。其編碼的蛋白質(zhì)充當(dāng)同源三聚體，有助于增加DNA復(fù)制過程中前導(dǎo)鏈合成的持續(xù)合成能力。此外，PCNA還可作為對(duì)DNA損傷的響應(yīng)，被泛素化并參與依賴RAD6的DNA修復(fù)途徑[15]。很多研究結(jié)果證明，PCNA與許多腫瘤細(xì)胞的異常增殖明顯相關(guān)，PCNA的紊亂可能是部分腫瘤發(fā)生的內(nèi)在機(jī)制。Smith等[16]通過研究證明，可通過靶向PCNA抑制胰腺癌的進(jìn)展。Cui等[17]確定PCNA在甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）增高的肝細(xì)胞癌中顯著上調(diào)，并與其發(fā)展演變明顯相關(guān)。Cardano等[18]認(rèn)為靶向PCNA對(duì)于抑制腫瘤細(xì)胞增殖是一個(gè)靈敏而有效的治療策略。He等[19]的研究結(jié)果表明，lncRNA AK027294能通過上調(diào)PCNA的表達(dá)量，從而進(jìn)一步促進(jìn)胃癌的進(jìn)展。這些研究結(jié)果提示，PCNA可促進(jìn)胃癌的發(fā)生和發(fā)展。

本研究中，主要探討MCM4與胃癌的關(guān)系，以及MCM4與PCNA的關(guān)系，以期為胃癌診療提供一個(gè)新的方向和有效的生物標(biāo)志物或靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2011年5月至2021年5月，保定市第一中心醫(yī)院收治的經(jīng)手術(shù)治療的胃癌患者69例。其中，男性35例，女性34例，年齡56.3歲±5.72歲。全部病例均經(jīng)過臨床病理證實(shí)，并具有完整的病例資料。收集患者的胃癌組織與癌旁正常組織的石蠟標(biāo)本，并收集患者的相關(guān)臨床資料，包括年齡、性別、腫瘤分級(jí)、腫瘤大小。本研究中對(duì)所有患者標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)研究均得到了患者的知情同意。此外，本研究基于1964年赫爾辛基宣言和隨后所有修訂案中規(guī)定的道德標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 主要材料與儀器

Anti-MCM4抗體、Anti-PCNA抗體（英國Abcom公司），3,3’-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）。RM2235型石蠟切片機(jī)、光學(xué)顯微鏡（德國徠卡公司）。

1.2.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

根據(jù)免疫組織化學(xué)染色試劑盒的說明書進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。將石蠟標(biāo)本用切片機(jī)切片（厚度為4～5μm），將切片放入65℃的烤箱中烤片約45 min，以便于進(jìn)一步脫蠟；水化處理時(shí)，將切片用二甲苯Ⅰ處理10 min，用二甲苯Ⅱ處理10 min，用無水乙醇處理5 min，用無水乙醇處理5 min，用95%的乙醇處理5 min，用85%的乙醇處理5 min，用75%的乙醇處理5 min；水化處理后，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌切片3次，每次約3 min；洗滌結(jié)束后，將切片置于裝有枸櫞酸鹽緩沖液的修復(fù)盒中，在微波爐中高火加熱5 min后斷電，再次以中低火加熱8～10 min，進(jìn)行抗原修復(fù)；將修復(fù)盒取出，在室溫下冷卻至常溫，整個(gè)過程中保持玻片被修復(fù)液浸泡；繼續(xù)用PBS洗滌切片3次，每次3 min；將切片周圍多余的水分用濾紙吸干，再在標(biāo)本上滴加過氧化物；將切片放于濕盒中，室溫孵育約15 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶；擦干切片周圍多余的液體后，用PBS洗滌3次，每次約3 min；稍微用力甩干多余液體，滴加特異性一抗并均勻涂布，然后置于濕盒中在4℃冰箱中孵育過夜；次日，將濕盒取出復(fù)溫，用PBS洗滌3次，每次約5 min；用濾紙擦干切片上的多余水分，然后在標(biāo)本上滴加IgG二抗工作液，均勻涂布后置于濕盒中，于室溫下孵育25 min左右，再以PBS洗滌3次，每次約3 min；滴加事先配制的DAB染色液，于室溫下顯色，控制反應(yīng)時(shí)間在5～8 min，用自來水沖洗以終止染色；用濾紙吸干切片上的多余水分，滴加蘇木素工作液，進(jìn)一步復(fù)染細(xì)胞核，控制染色時(shí)間為5～10 s；用自來水再次終止染色，隨后進(jìn)行梯度脫水[75%乙醇10 s→85%乙醇10 s→95%乙醇10 s→無水乙醇10 s→無水乙醇5 min→二甲苯（Ⅲ）5 m in→二甲苯（Ⅳ）5 min]；最后用中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察。

1.2.3 臨床樣本生物信息學(xué)分析

通過基因表達(dá)譜交互分析（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA）數(shù)據(jù)庫，驗(yàn)證胃癌組織中MCM4 mRNA的表達(dá)水平（http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php?gene=MCM4）和PCNA mRNA的表達(dá)水平（http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php?gene=PCNA），并分析胃癌組織中MCM4與PCNA之間的關(guān)系。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。定量數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。比較臨床病理特征與MCM4和PCNA表達(dá)間的關(guān)系時(shí)，采用χ2檢驗(yàn)；兩組間進(jìn)行比較時(shí)使用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MCM4在各種腫瘤組織中的表達(dá)

生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，MCM4在結(jié)直腸癌、乳腺癌、前列腺癌和肺癌組織中免疫組化染色呈陽性（圖1）；MCM4在多數(shù)腫瘤中呈現(xiàn)中高度表達(dá)，尤其是膠質(zhì)細(xì)胞瘤，而在肝細(xì)胞癌、前列腺癌以及子宮內(nèi)膜癌中呈低表達(dá)（圖2）。

圖1 微小染色體維持蛋白4（MCM4）在幾種常見腫瘤中的免疫組化結(jié)果（×200）

圖2 微小染色體維持蛋白4（MCM4）在部分腫瘤中的表達(dá)情況

2.2 MCM4在胃癌組織中的表達(dá)情況

通過GPEIA數(shù)據(jù)庫分析MCM4 mRNA在胃癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)情況，共分析胃癌組織408例及癌旁正常組織211例。結(jié)果表明，MCM4在胃癌組織中高表達(dá)（P＜0.05）（圖3）。該結(jié)果提示，MCM4可能是胃癌的一個(gè)獨(dú)立生物標(biāo)志物，可通過檢測(cè)MCM4的表達(dá)量來預(yù)測(cè)胃癌的發(fā)生，還可進(jìn)一步探索是否可通過靶向MCM4來治療胃癌。

圖3 微小染色體維持蛋白4（MCM4）的mRNA在胃癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)情況

為了進(jìn)一步驗(yàn)證生物信息學(xué)分析結(jié)果，共對(duì)69例胃癌組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，并分析MCM4的表達(dá)量。結(jié)果表明，MCM4在胃癌組織中的表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織（圖4），這與生物信息學(xué)分析結(jié)果一致。為了進(jìn)一步探討MCM4的表達(dá)量與胃癌進(jìn)展之間的關(guān)系，將69例胃癌組織標(biāo)本根據(jù)染色強(qiáng)度分為高、低兩組，分析比較MCM4高表達(dá)組和MCM4低表達(dá)組患者的臨床病理特征差異，包括年齡、性別、腫瘤分級(jí)和腫瘤大小。表1中的數(shù)據(jù)表明，MCM4的表達(dá)與胃癌腫瘤大小明顯相關(guān)（P=0.037），而與患者年齡、性別和腫瘤分級(jí)的關(guān)系無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

圖4 胃癌組織和癌旁正常組織中微小染色體維持蛋白4（MCM4）的免疫組化結(jié)果

表1 微小染色體維持蛋白4（MCM4）的表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的相關(guān)性分析（例）

2.3 MCM4與PCNA的關(guān)系

前文中的研究結(jié)果已經(jīng)證實(shí)MCM4可促進(jìn)胃癌的發(fā)生和發(fā)展。為了進(jìn)一步探討MCM4影響PCNA的方式，通過在線數(shù)據(jù)庫分析了與MCM4相關(guān)的一系列因子。結(jié)果表明，MCM4與許多重要的蛋白和因子相關(guān)，如PCNA、細(xì)胞周期素A1（Cyclin A1）和細(xì)胞分化周期蛋白6（cell division cycle 6，CDC6）（圖5）。PCNA是一個(gè)重要的增長相關(guān)因子，其紊亂會(huì)明顯影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。在本研究中，通過在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)了MCM4與PCNA的關(guān)聯(lián)性，發(fā)現(xiàn)MCM4的表達(dá)量與PCNA表達(dá)量顯著正相關(guān)（R=0.54，P<0.01；圖6）。因此，利用GEPIA數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步分析PCNA在胃癌組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，在胃癌組織中，PCNA mRNA的表達(dá)量也明顯高于癌旁正常組織（圖7），進(jìn)一步說明MCM4和PCNA具有密切的關(guān)系，MCM4表達(dá)上調(diào)可能通過進(jìn)一步調(diào)節(jié)胃癌組織中PCNA的表達(dá)量，進(jìn)而促進(jìn)胃癌的發(fā)生、發(fā)展。但是，具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

圖5 與微小染色體維持蛋白4（MCM4）相關(guān)的蛋白和因子的網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

圖6 微小染色體維持蛋白4（MCM4）與增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的相關(guān)性

圖7 增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的mRNA在胃癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)情況

2.4 MCM4與PCNA的免疫組化結(jié)果比較

為了進(jìn)一步驗(yàn)證MCM4和PCNA的關(guān)系，將69例胃癌組織切片進(jìn)行MCM4和PCNA的免疫組化染色。結(jié)果表明，胃癌組織中MCM4和PCNA蛋白均高表達(dá)（圖8）。該結(jié)果與生物信息學(xué)分析結(jié)果一致，進(jìn)一步說明二者之間存在緊密聯(lián)系，并可能協(xié)同促進(jìn)胃癌的發(fā)生和發(fā)展。

圖8 胃癌組織中微小染色體維持蛋白4（MCM4）與增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的免疫組化結(jié)果

3 討論與結(jié)論

胃癌是一種具有高致死率的惡性消化道腫瘤，其早期一般無明顯癥狀，很多患者在確診之時(shí)即為晚期，導(dǎo)致5年生存率很低。能誘發(fā)胃癌的因素很多，其中研究得比較多的是吸煙[20]、家族史[21]和不良飲食習(xí)慣[22]，其中飲食中的各種毒素是顯著因素。隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，胃癌患者的生存率已經(jīng)大大得到提升，但發(fā)病人數(shù)不斷增長，這與逐漸精密的檢測(cè)儀器和不健康的生活方式明顯相關(guān)[23]。

早期診斷和有效治療是降低胃癌死亡率的最根本要素。因此尋找一種靈敏且有效的生物標(biāo)志物對(duì)于提升胃癌的診療水平至關(guān)重要。研究結(jié)果表明，MCM4與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[24-25]，靶向MCM4可抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展[26]。本研究結(jié)果表明，MCM4在很多腫瘤中顯著上調(diào)，且MCM4在胃癌組織中的表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織，進(jìn)一步分析患者的臨床資料發(fā)現(xiàn)，MCM4的表達(dá)與胃癌腫瘤大小相關(guān)（P<0.05），而與患者性別、年齡及腫瘤分級(jí)的相關(guān)性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。上述結(jié)果提示，MCM4可能是胃癌的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后因子。

此外，很多研究結(jié)果表明，PCNA與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)，靶向PCNA能有效抑制腫瘤的進(jìn)展。Li等[27]發(fā)現(xiàn)MicroRNA-204能有效通過靶向PCNA來抑制肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲；Hou等[28]發(fā)現(xiàn)食管癌相關(guān)基因2（es ophageal cancer related gene 2，ECRG2）能通過上調(diào)p53和下調(diào)PCNA來增強(qiáng)順鉑對(duì)順鉑耐藥食管癌細(xì)胞的作用；還有研究者發(fā)現(xiàn)PCNA與胃癌的發(fā)生、發(fā)展具有明顯的關(guān)聯(lián)性。在本研究中，通過GEPIA數(shù)據(jù)庫證實(shí)MCM4與PCNA顯著相關(guān)。此外，PCNA在胃癌組織中的表達(dá)量也明顯高于癌旁正常組織，該結(jié)果與MCM4在胃癌組織中的表達(dá)情況一致。69例胃癌組織的MCM4與PCNA的免疫組化結(jié)果表明，在胃癌患者中，MCM4的表達(dá)情況與PCNA的表達(dá)情況一致，進(jìn)一步證明了二者具有顯著的相關(guān)性，二者可能協(xié)同促進(jìn)胃癌的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，MCM4可能通過調(diào)節(jié)PCNA促進(jìn)胃癌的發(fā)生、發(fā)展，MCM4和PCNA可能是胃癌的潛在生物標(biāo)志物。本研究結(jié)果為研究靶向MCM4治療胃癌提供了新的方向和思路。但由于本研究屬于單中心小樣本研究，在樣本量方面存在不足。未來將進(jìn)一步探究MCM4與胃癌之間的關(guān)系，通過基因操作技術(shù)構(gòu)建MCM4表達(dá)載體，通過過表達(dá)或者敲低來改變MCM4的表達(dá)量，分析其對(duì)胃癌細(xì)胞的功能學(xué)影響。此外，將構(gòu)建小鼠模型對(duì)本研究結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證，以進(jìn)一步揭示MCM4與PCNA的相互作用和MCM4、PCNA對(duì)于胃癌的具體作用機(jī)制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突