siRNA干擾URG11表達(dá)對骨肉瘤細(xì)胞系MG63的生物學(xué)功能和Wnt/β-catenin信號通路的影響

董成功 張蔚 劉穎 張明

煙臺市煙臺山醫(yī)院病理科 264002

0 引 言

骨肉瘤是一種高度惡性的成骨性腫瘤，起源于間充質(zhì)細(xì)胞，是腫瘤細(xì)胞直接形成骨樣基質(zhì)的惡性腫瘤。骨肉瘤好發(fā)于青少年，可導(dǎo)致骨痛、肌肉萎縮、病理性骨折等一系列病變，給人體健康和生活質(zhì)量構(gòu)成重大威脅[1]。目前，盡管手術(shù)切除聯(lián)合術(shù)后放化療等治療手段使骨肉瘤患者的生存率有了很大提高，但一些復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移病例的治療效果并不理想[2-3]。隨著分子生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，從細(xì)胞分子水平上研究骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展機(jī)制成為當(dāng)代醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。

上調(diào)基因11（up-regulated gene 11，URG11）可被乙肝病毒HBx蛋白上調(diào)，該基因含有特殊的植物凝集素結(jié)構(gòu)域和血管黏附分子結(jié)構(gòu)域，兩者參與了細(xì)胞黏附、遷移以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)活動的調(diào)節(jié)[4-5]。研究結(jié)果顯示，在肝癌、前列腺癌和腸癌等多種腫瘤的細(xì)胞和組織中，URG11異常高表達(dá)[6-8]。近些年來，有研究結(jié)果證實(shí)，骨肉瘤細(xì)胞也存在URG11表達(dá)上調(diào)，而且URG11高表達(dá)與腫瘤分期、肺轉(zhuǎn)移等臨床特征密切相關(guān)[5]，下調(diào)URG11能抑制細(xì)胞的惡性表型[9]。然而，URG11影響骨肉瘤細(xì)胞惡性表型的具體機(jī)制尚不明確。

Wnt是一類分泌型糖蛋白，通過自分泌或旁分泌途徑發(fā)揮作用。β-catenin是Wnt信號通路中的重要參與者，為多功能蛋白。研究結(jié)果顯示，Wnt/βcatenin參與了機(jī)體諸多生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)，且Wnt/β-catenin信號通路的異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[10]。

本研究以人骨肉瘤細(xì)胞系MG63為研究對象，采用siRNA干擾URG11的表達(dá)，研究URG11對Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)節(jié)與MG63細(xì)胞生物學(xué)功能的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

MG63人骨肉瘤細(xì)胞系（美國ATCC公司），胰蛋白酶、胎牛血清（美國Gibco公司），1640培養(yǎng)基、青鏈霉素雙抗、聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜、TRIZOL和脂質(zhì)體2000（美國Invitrogen公司），通用蛋白裂解液（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），二辛可酸(bicinchoninic acid，BCA)法蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），羊抗兔/鼠二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）多克隆抗體和鼠抗人原癌基因（c-Myc）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）單克隆抗體（美國Santa Cruz公司），兔抗人周期性調(diào)控因子D1（Cyclin D1）、β-catenin、凋亡抑制基因（Survivin）單克隆抗體（美國CST公司），Matrigel基底膠（美國BD公司），Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（北京Solarbio公司），CCK-8試劑盒（日本Dojindo公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連寶生物工程有限公司）。

Transwell小室（美國Costar公司），酶標(biāo)儀、凝膠成像分析儀（美國Bio-Rad公司），恒溫CO2培養(yǎng)箱、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PC R）分析儀（美國Thermo Fisher公司），流式細(xì)胞儀（德國Eppendorf公司），倒置顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組與處理

MG63人骨肉瘤細(xì)胞系采用含10%熱滅活的胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗的1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)（5%CO2、37℃）。實(shí)驗(yàn)分為Control組（未轉(zhuǎn)染）、NC-siRNA組（轉(zhuǎn)染非特性NC-siRNA）和URG11-siRNA組（轉(zhuǎn)染URG11-siRNA）。收集處于對數(shù)生長期的MG63細(xì)胞，接種至24孔板（105個(gè)細(xì)胞/孔），常規(guī)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)70%左右時(shí)，根據(jù)廠商的說明書，采用脂質(zhì)體2000進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染（每組3個(gè)復(fù)孔）。其中URG11-siRNA（5’-CACACCCAUUCCUCUACUU-3’）和NC-siRNA（5’-UUCUCCCAACCUCUCACCU-3’）由上海吉瑪公司合成。轉(zhuǎn)染后5 h，更換新鮮培養(yǎng)液，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集后進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.2.2 URG11 mRNA表達(dá)的檢測

采用逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription PCR，RTPCR）法檢測URG11 mRNA表達(dá)。采用TRIZOL提取Control組、NC-siRNA組和URG11-siRNA組細(xì)胞的總RNA，并參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書合成單鏈cDNA。以1μl cDNA為模板，與各0.5μl正反引物、10μl SYBR Green Master Mix（2×）和8μl雙蒸餾水混合后配制成PCR反應(yīng)體系（體積20μl）。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性處理（95℃，2 min）；變性處理（95℃，20 s）；退火（60℃，30 s）；延伸（72℃，30 s）；共反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。采用比較CT（cycle-threshold）值法對樣品擴(kuò)增進(jìn)行計(jì)算，獲得各組細(xì)胞URG11 mRNA的樣本的相對表達(dá)量（2-ΔΔCT）。以GAPDH作為內(nèi)參。PCR引物由上海生工生物合成，序列見表1，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列

1.2.3 URG11蛋白表達(dá)的檢測

采用Western blot法檢測URG11的蛋白表達(dá)。采用蛋白裂解液提取各組MG63細(xì)胞的總蛋白，以BCA法檢測總蛋白濃度。向蛋白樣品中加入等體積的上樣緩沖液（loading buffer），充分混勻后于沸水中進(jìn)行蛋白變性處理5 min。然后將熱變性后的蛋白樣品加至SDS-PAGE凝膠的齒狀槽中（每孔60μg）行電泳分離。分離結(jié)束后，將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜。PVDF膜經(jīng)5%脫脂奶粉封閉2 h，然后分別采用URG11（1∶1 000稀釋）和GAPDH（1∶1 000稀釋）一抗進(jìn)行孵育（4℃、24 h）。再經(jīng)二抗工作液（1∶2 000稀釋）室溫孵育1 h后，暗室內(nèi)顯影曝光。采用凝膠成像分析儀掃描分析。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖。采用胰蛋白酶消化處理Control組、NC-siRNA組和URG11-siRNA組的細(xì)胞，離心后收集細(xì)胞，進(jìn)而接種至96孔細(xì)胞板（200μl/孔；濃度為104個(gè)細(xì)胞/ml），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)1 d、2 d、3 d和4 d時(shí)，棄培養(yǎng)液，加入CCK-8試劑（10μl/孔）后孵育2 h，采用酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞在490 nm處的吸光度。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

采用Transwell小室檢測細(xì)胞的侵襲性。以50 mg/L的Matrigel稀釋液（1∶8稀釋）包被Transwell小室底部，并在4℃下充分融合。將包被后的小室置于24孔板中，在小室上室中加入經(jīng)無血清培養(yǎng)基重懸后的細(xì)胞（濃度為105個(gè)細(xì)胞/ml，200μl/孔），在下室中加入500μl含血清的培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)24 h后，取出小室，用磷酸緩沖鹽溶液洗滌，以棉簽擦去上室細(xì)胞后分別采用4%多聚甲醛和0.5%結(jié)晶紫進(jìn)行固定和染色。洗去染色液后，在顯微鏡下每孔隨機(jī)選取3個(gè)視野觀察侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)量。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。采用胰蛋白酶消化處理Control組、NC-siRNA組和URG11-siRNA組的細(xì)胞，離心后收集細(xì)胞，以磷酸緩沖鹽溶液洗滌2次后，加入結(jié)合緩沖液600μl調(diào)整細(xì)胞濃度。向105個(gè)細(xì)胞中加入Annexin-V-FITC和PI各5μl，避光反應(yīng)15 min后，補(bǔ)加上樣緩沖液200μl，用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡率。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

收集URG11-siRNA組、NC-siRNA組和Control組細(xì)胞，采用Western blot法檢測Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)分子（β-catenin、c-Myc、Cyclin D1、MMP-2和Survivin）的蛋白表達(dá)。詳細(xì)的檢測步驟參照1.2.3節(jié)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較采用SNKq，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 URG11-siRNA轉(zhuǎn)染后各組MG63細(xì)胞中URG11的表達(dá)

與Control組相比，URG11-siRNA組的MG63細(xì)胞中URG11 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯降低（均P<0.05），而轉(zhuǎn)染NC-siRNA對MG63細(xì)胞的URG11表達(dá)的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。（圖1）

圖1 URG11-siRNA轉(zhuǎn)染對MG63細(xì)胞的上調(diào)基因11（URG11）蛋白和mRNA表達(dá)的影響

2.2 URG11-siRNA對MG63細(xì)胞增殖的影響

與Control組相比，URG11-siRNA組的細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后2 d，細(xì)胞增殖開始明顯下調(diào)（P＜0.05）；而NC-siRNA組的MG63細(xì)胞在轉(zhuǎn)染1～4 d后，細(xì)胞的增殖活性與Control組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

表2 URG11-siRNA轉(zhuǎn)染對MG63細(xì)胞增殖的影響（Mean±SD）

2.3 URG11-siRNA轉(zhuǎn)染對MG63細(xì)胞凋亡和侵襲的影響

URG11-siRNA轉(zhuǎn)染后，MG63細(xì)胞的凋亡率較Control組明顯升高，說明URG11-siRNA轉(zhuǎn)染明顯增強(qiáng)了MG63細(xì)胞的凋亡（P＜0.05）。但是Control組與NC-siRNA組的MG63細(xì)胞的凋亡率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（圖2A和圖2B）

URG11-siRNA組的穿膜細(xì)胞數(shù)明顯少于Control組（P＜0.05），說明URG11-siRNA轉(zhuǎn)染使MG63細(xì)胞的侵襲能力明顯減弱。NC-siRNA組和Control組之間，穿膜細(xì)胞數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明細(xì)胞的侵襲能力未明顯改變。（圖2C）

圖2 URG11-siRNA轉(zhuǎn)染對MG63細(xì)胞的侵襲和凋亡的影響

2.4 URG11-siRNA轉(zhuǎn)染對MG63細(xì)胞內(nèi)的Wnt/β-catenin信號通路的影響

與Control組相比，URG11-siRNA轉(zhuǎn)染后，MG63細(xì)胞內(nèi)的Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵調(diào)控因子β-catenin及其下游靶基因c-Myc、Cyclin D1、MMP-2和Survivin的蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（均P＜0.05），而NC-siRNA組的MG63細(xì)胞內(nèi)的β-catenin、c-Myc、Cyclin D1、MMP-2和Survivin的蛋白表達(dá)的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。（圖3）

圖3 Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白的Western blot檢測結(jié)果

3 討論與結(jié)論

URG11基因位于人類11號染色體長臂，編碼70 ku的URG11蛋白。作為乙肝病毒HBx蛋白的效應(yīng)器，URG11能促進(jìn)肝癌細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加快肝癌細(xì)胞的生長，促進(jìn)肝癌的發(fā)展[4，6]。隨著分子生物學(xué)研究的深入，多項(xiàng)研究結(jié)果表明，除了肝癌，URG11在其他腫瘤中的表達(dá)也存在上調(diào)。URG11在胰腺癌、乳腺癌中異常高表達(dá)，且與腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良等臨床病理現(xiàn)象相關(guān)[11]。研究者也在其他腫瘤中發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)URG11可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，并抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[12-14]。研究結(jié)果顯示，骨肉瘤組織中，URG11表達(dá)上調(diào)，且URG11的高表達(dá)與腫瘤的分期、增殖能力和預(yù)后有密切相關(guān)性[5]，而下調(diào)URG11能抑制細(xì)胞的惡性表型[9]。本研究結(jié)果顯示，用siRNA干擾URG11表達(dá)可降低骨肉瘤MG63細(xì)胞的增殖、侵襲能力，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這些結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致，但URG11參與腫瘤細(xì)胞生物行為學(xué)調(diào)節(jié)的具體機(jī)制尚不明晰。

Wnt/β-catenin信號通路參與了機(jī)體內(nèi)諸多生物學(xué)過程的調(diào)節(jié)。Wnt/β-catenin信號通路是細(xì)胞內(nèi)進(jìn)化上高度保守的Wnt通路的經(jīng)典途徑，β-catenin是該通路的關(guān)鍵因子。β-catenin在胞漿中過度表達(dá)可進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)一系列腫瘤靶基因的表達(dá)，包括Cyclin D1、c-Myc、轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MMP-2和Survivin等，從而影響腫瘤細(xì)胞的生長、遷移和凋亡等，與骨肉瘤等其他多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[15]。研究結(jié)果顯示，Wnt配體和受體在骨肉瘤中表達(dá)增加，而Wnt拮抗分子在骨肉瘤中表達(dá)減少，這表明Wnt通路的激活與骨肉瘤密切相關(guān)[10]。靶向Wnt/β-catenin信號通路，有可能成為骨肉瘤的一種治療策略[16]。針對前列腺癌的研究結(jié)果顯示，抑制Wnt/β-catenin信號通路活化，可以減弱URG11的致癌作用[13]。針對肝癌的研究結(jié)果顯示，過度表達(dá)URG11可以促進(jìn)Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵因子β-catenin的轉(zhuǎn)錄，使β-catenin蛋白表達(dá)增加，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖[14]。為了探討URG11在骨肉瘤細(xì)胞系中的致癌分子機(jī)制，本研究中進(jìn)一步研究了干擾URG11表達(dá)后，骨肉瘤MG63細(xì)胞系中Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白（β-catenin、c-Myc、Cyclin D1、MMP-2和Survivin）的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，采用siRNA干擾URG11表達(dá)后，β-catenin、c-Myc、Cyclin D1、MMP-2和Survivin蛋白表達(dá)顯著降低，提示URG11在骨肉瘤細(xì)胞系中的致癌機(jī)制可能與調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。

綜上所述，URG11在骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用，下調(diào)URG11表達(dá)，可抑制骨肉瘤MG63細(xì)胞增殖和侵襲，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，其分子機(jī)制可能與抑制Wnt/β-catenin信號通路的活化有關(guān)。因此，調(diào)節(jié)URG11的表達(dá)有可能成為骨肉瘤基因治療的一個(gè)重要方向，但臨床療效和具體生物學(xué)機(jī)制，還有待更多的研究來證實(shí)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突