DRD1基因敲除影響雄鼠生育的分子機(jī)理研究*

龔曉娟 馬 盼 孫 敏 楊婧思 李少卿王興林,2 張 平 閻春霞 張 寶

(1. 西安交通大學(xué)衛(wèi)生部法醫(yī)學(xué)重點實驗室，西安 710061)(2. 西安交通大學(xué)環(huán)境與疾病相關(guān)基因教育部重點實驗室，西安 710061)

動物生殖性狀主要受下丘腦-垂體-性腺軸(HPG軸)的調(diào)控，關(guān)于動物生殖的研究大多是集中在HPG軸分泌的激素及其受體基因上[1]。其中，多巴胺(dopamine，DA)占哺乳動物大腦中兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量的80%，控制著運(yùn)動、認(rèn)知、情感、攝食、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)等多種功能[2-4]。已知的多巴胺受體(DR)有5種(D1～D5)，可分為D1樣家族受體和D2樣家族受體。多巴胺D1受體屬于DR1樣受體，主要表達(dá)于尾殼核(CPu)、伏隔核(Acb)、視束(OT)、腦皮層(Cx)和杏仁核[5]，其功能主要包括影響情感思維及神經(jīng)內(nèi)分泌(帕金森病、精神分裂癥、阿爾茨海默癥)、參與藥物依賴形成、調(diào)控精神分裂癥、認(rèn)知功能、影響學(xué)習(xí)記憶能力、保護(hù)視神經(jīng)等。在小鼠體內(nèi)定向敲除DRD1基因會提供關(guān)于它們生理功能的有研究價值的信息。例如，在各種海馬依賴的空間任務(wù)中，DRD1基因敲除小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力明顯下降[6-7]。一些研究表明DRD1基因在下丘腦和垂體中廣泛表達(dá)，且該基因的表達(dá)參與雞、鴨、鵝等禽類生殖行為的調(diào)節(jié)[8-10]。但是DRD1基因調(diào)控生殖力的作用及其分子機(jī)制尚不清楚。為了進(jìn)一步探究DRD1基因?qū)ι彻δ艿挠绊?，解析我校飼養(yǎng)的DRD1敲除小鼠表現(xiàn)的生殖能力下降，仔鼠成活率低等現(xiàn)象，本研究以DRD1敲除小鼠為研究對象，對DRD1敲除雄性小鼠的生殖性狀進(jìn)行分析，旨在探究DRD1在雄性生殖功能中發(fā)揮的作用，明確DRD1敲除小鼠生殖能力下降的分子機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：DRD1-/-小鼠(KO)、C57BL/6小鼠(WT)購自西安交通大學(xué)實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(陜)2018-001。多巴胺DRD1基因敲除小鼠(KO)，由美國芝加哥大學(xué)(University of Chicago)徐明教授惠贈。

1.1.2試劑儀器： RNA提取試劑盒(上海寶曼生物科技有限公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix Ex TaqⅡ(TaKaRa BIO INC)，PCR儀和qRT-PCR儀(Bio-Rad)，組織切片機(jī)(Leitz)。

1.2 方法

1.2.1飼養(yǎng)條件：實驗動物飼養(yǎng)在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心按照SPF級標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，實驗動物使用許可證號: SYXK(陜)2015-002，溫度控制在18～22 ℃，相對濕度控制在50%～60%，光照明暗交替12 h/12 h。鼠盒、墊料均經(jīng)過高壓消毒(131 ℃、5 min)，飼料用60Co照射滅菌，由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供，動物飲用水為酸化純凈水(pH 2.5～3.0)。飼料、水供給充足，墊料每2～3天更換1次。

1.2.2樣本收集：DRD1-/-純合小鼠經(jīng)過檢驗檢疫、測序鑒定，檢測合格后進(jìn)行分組實驗。取8周齡SPF級DRD1-/-雄性小鼠和WT雄性小鼠各5只。測小鼠體質(zhì)量，取出小鼠雙側(cè)睪丸，稱質(zhì)量，計算睪丸臟器系數(shù)。一側(cè)睪丸在篩網(wǎng)中用TRIzol充分研磨，-80 ℃保存；另一側(cè)睪丸用4%多聚甲醛/PBS固定。

1.2.3組織學(xué)分析：4%多聚甲醛溶液固定的睪丸組織常規(guī)石蠟包埋、組織切片、HE染色、中性樹膠封片、制作成睪丸組織病理切片，光學(xué)顯微鏡下觀察。對每個睪丸組織切片，選取 10 個圓形生精小管上皮，觀察生精小管的直徑及精原細(xì)胞，各級生精母細(xì)胞的分布及形態(tài)，睪丸間質(zhì)的疏密程度及分布情況。

1.2.4基因表達(dá)差異分析:查閱文獻(xiàn)，選擇在睪丸組織中顯著表達(dá)并與生殖密切相關(guān)的8個候選基因：Spem1、Tex12、Spata19、Tnp2、CDY、CFTR、DAZ、SMCY以及內(nèi)參基因GAPDH。利用TRIzol法提取睪丸組織RNA，經(jīng)gDNA Eraser酶參照說明去除基因組DNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。結(jié)果分析采用相對定量法，根據(jù)2-ΔΔCt數(shù)值判斷實驗組某基因相對于對照組的表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參。ΔCt=目標(biāo)基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值；ΔΔCt=實驗ΔCt-對照ΔCt；相對表達(dá)量=2-ΔΔCt。一般認(rèn)為2-ΔΔCt數(shù)值大于2表達(dá)上調(diào)具有顯著意義，小于0.5表達(dá)下調(diào)具有顯著意義[11]。

1.3 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量及臟器系數(shù)計算

KO雄鼠體質(zhì)量與WT雄鼠體質(zhì)量相比具有顯著差異(P<0.05)；KO 鼠睪丸質(zhì)量與WT鼠睪丸質(zhì)量相比，未發(fā)現(xiàn)顯著差異(P>0.05)；KO 鼠睪丸系數(shù)與WT鼠睪丸系數(shù)相比，也未發(fā)現(xiàn)顯著差異(P>0.05)(表1)。

表1 KO與WT小鼠體質(zhì)量及睪丸系數(shù)比較Table 1 Weight and testicularcoefficient in KO and WT

2.2 睪丸組織病理切片

肉眼觀察，睪丸組織未發(fā)現(xiàn)顯著差異。光學(xué)顯微鏡下觀察睪丸組織病理切片，與 WT 小鼠相比，發(fā)現(xiàn)KO 小鼠生精小管排列疏松紊亂，生殖細(xì)胞層數(shù)少。雖可見圓形精子，但精細(xì)胞與帶尾精子數(shù)量較少，提示精子形態(tài)及功能可能存在異常(圖1)。

圖1 WT與KO小鼠睪丸組織病理切片比較Fig.1 Comparison of pathological sectionsof testis tissue between WT and KO

2.3 qRT-PCR分析結(jié)果

KO小鼠相對WT小鼠，CFTR表達(dá)上調(diào)2.32倍，Spata19上調(diào)4.58倍，SMCY下調(diào)5.25倍，DAZ下調(diào)3.14倍，Tex12、CDY、Spem1和Tnp2未見明顯差異(圖2)。

圖2 WT與KO小鼠基因表達(dá)差異倍數(shù)Fig.2 Fold change in differential gene expressionbetween WT and KO mice

3 討論

多巴胺DRD1基因被認(rèn)為與精神分裂癥、藥物依賴、孤獨(dú)癥等多種精神類疾病相關(guān)，在下丘腦和垂體中有著廣泛分布，DRD1-/-小鼠，作為多巴胺受體介導(dǎo)的神經(jīng)及生理活動動物模型被廣泛應(yīng)用于藥物成癮、精神分裂等的研究[12-15]。本實驗室在對該動物模型進(jìn)行飼養(yǎng)的過程中，發(fā)現(xiàn)DRD1-/-小鼠出現(xiàn)生殖能力下降、仔鼠成活率低等現(xiàn)象。由于動物生殖主要受下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)控，而DRD1基因在下丘腦和垂體中廣泛表達(dá)，推測DRD1基因可能通過下丘腦-垂體-性腺軸參與小鼠生殖的調(diào)控。故本研究從病理生理學(xué)指標(biāo)及基因表達(dá)水平對DRD1-/-雄性小鼠睪丸生殖功能進(jìn)行分析，以期為生殖生理的研究提供新的思路。

CFTR編碼囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)因子，在呼吸道、腸道、生殖道等腔上皮細(xì)胞內(nèi)多有表達(dá)，其突變可以導(dǎo)致多種發(fā)育缺陷的發(fā)生。大量研究表明，CFTR的突變和蛋白表達(dá)異常是男性生殖道中先天性輸精管缺如[16]、男性梗阻性無精子癥及不育的重要因素[17]。但關(guān)于CFTR對生精功能是否造成影響，學(xué)術(shù)界一直存在爭議，CFTR在睪丸上的表達(dá)分布情況也鮮有報道。有研究表明先天性雙側(cè)輸精管缺如患者睪丸組織的CFTR表達(dá)以陽性和弱陽性為主，也可見強(qiáng)陽性和少部分的陰性[18]。本研究發(fā)現(xiàn)DRD1-/-小鼠CFTR睪丸上表達(dá)上調(diào)2.32倍，推測DRD1基因敲除損傷睪丸生精功能可能與CFTR表達(dá)異常有關(guān)。Spata19是與生殖相關(guān)的一個重要的基因，已被鑒定與精子發(fā)生及前列腺癌等其他重要生殖疾病有關(guān)。Spata19通過調(diào)控線粒體功能影響精子活動性[17]，可影響精子頭部的形狀[19]，在精子的發(fā)生過程中起重要的作用[20]。本研究檢測到DRD1-/-小鼠的Spata19基因表達(dá)上調(diào)4.58倍，劉若巖[21]研究表明該基因表達(dá)水平的增加可能會影響精子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，也可能使精子提前獲能，從而影響雄性小鼠的生殖功能。

與之相反的是，本研究中KO小鼠的SMCY基因與DAZ基因較WT小鼠表達(dá)顯著下調(diào)，SMCY下調(diào)5.25倍，DAZ下調(diào)3.14倍，這與組織學(xué)水平發(fā)現(xiàn)精細(xì)胞及帶尾精子數(shù)量少相一致。SMCY編碼一種男性特有的組織相容性抗原，其突變或缺失與無精或少精相關(guān)，是一種生精因子[22-23]，DRD1-/-小鼠睪丸組織中SMCY基因表達(dá)的下調(diào)，證明DRD1基因的敲除影響了睪丸生精功能，損害小鼠的生殖功能?；駾AZ編碼在精原細(xì)胞和減數(shù)分裂早期生精細(xì)胞中特異性RNA結(jié)合蛋白，是激活精子和保持種族 Y 染色體功能的重要基因[24-26]。DRD1-/-小鼠睪丸組織中DAZ基因表達(dá)的下調(diào)，會導(dǎo)致精子發(fā)生過程中聯(lián)會的失敗，從而致使DRD1-/-小鼠的生精功能低下、生殖功能下降。

以上基因的差異表達(dá)對精子的發(fā)生發(fā)展，睪丸組織的形態(tài)具有顯著影響。敲除小鼠DRD1基因后，與生殖相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生相應(yīng)的上調(diào)或下調(diào)，從而影響生殖器官及精子生成，導(dǎo)致生殖能力下降。由此推測，DRD1基因可能通過影響雄鼠體內(nèi)與生殖密切相關(guān)基因的表達(dá)情況，間接影響精子的發(fā)生、睪丸組織的形態(tài)，進(jìn)而影響生殖。但其明確的關(guān)系，仍需進(jìn)一步研究。為了明確DRD1基因與小鼠生殖性狀及生殖力之間的關(guān)系，下一步具體可從KO與WT雄性小鼠的生殖行為學(xué)、性激素測定、蛋白組學(xué)和高通量分析技術(shù)(如基因芯片)等幾方面進(jìn)行深層次研究。本研究從組織學(xué)水平，基因水平對小鼠生殖性狀的影響進(jìn)行了初步探討。DRD1基因如何調(diào)控生殖通路的具體靶點，有待進(jìn)一步探究。