乙醛脫氫酶2(ALDH2)基因多態(tài)性與血尿酸相關(guān)性的臨床觀察

胡晨鳴，余壽益，莫巧璇，賴錦蘭

(佛山市中醫(yī)院，廣東 佛山 528000)

0 引言

根據(jù)2019 年中國(guó)高尿酸血癥與痛風(fēng)診療指南[1]，目前中國(guó)大陸高尿酸血癥的總體患病率13.3%，患病人數(shù)已經(jīng)超過(guò)1.8 億，患病人數(shù)甚至已超過(guò)糖尿病。痛風(fēng)的總體患病率約1.1%，患病人數(shù)超過(guò)1500 萬(wàn)。高尿酸血癥患病率的高低受經(jīng)濟(jì)發(fā)展程度、環(huán)境、飲食習(xí)慣、種族、遺傳等多種因素的影響，呈現(xiàn)一定的特征：年輕化、“重男輕女”、遺傳傾向、地區(qū)與種族差異[2]。臨床診療過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，約90%入院治療的急性痛風(fēng)患者的誘因多是攝入高嘌呤含量的食物、氣候變化、飲酒、果糖攝入過(guò)多、運(yùn)動(dòng)過(guò)度等生活因素，足以看出生活因素對(duì)痛風(fēng)的重大影響。其中，酒精是比食物更重要的危險(xiǎn)因素，血尿酸水平隨著酒精攝入量的增加而增加，多因素分析發(fā)現(xiàn)，日常飲酒中，每增加10g 的酒精，痛風(fēng)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加17%。

乙醇代謝的整個(gè)過(guò)程中有兩個(gè)關(guān)鍵酶：將乙醇氧化為乙醛的乙醇脫氫酶ADH、將乙醛進(jìn)一步氧化為乙酸的乙醛脫氫酶ALDH。ALDH 基因編碼多個(gè)同工酶，乙醛的氧化速度主要受活性最強(qiáng)的ALDH2 調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，ALDH2 基因12 外顯子第1510 位點(diǎn)的鳥(niǎo)嘌呤核苷酸G 被腺嘌呤核苷酸A 替換時(shí)，ALDH2 基因編碼的蛋白質(zhì)第487 位氨基酸發(fā)生Glu 到Lys的變化，進(jìn)而導(dǎo)致其編碼的酶活性喪失或降低，ALDH2 基因A 等位基因是顯性遺傳[3]。相較于野生基因型ALDH2*1/*1，雜合子ALDH2*2/*1 和純合突變基因型ALDH2*2/*2 基因所編碼的酶蛋白都沒(méi)有活性，對(duì)乙醇代謝的影響幾乎相同。

ALDH2*2/*1 和ALDH2*2/*2 基因型個(gè)體飲酒后的表現(xiàn)形式為面紅反應(yīng)，表面上看該位點(diǎn)的多態(tài)性使突變等位基因攜帶者的酒精代謝異常，但另一方面存在該基因多態(tài)性人群由于飲酒后馬上出現(xiàn)的不舒適感受會(huì)減少酒精的攝入，從而使該位點(diǎn)的突變成為飲酒行為的保護(hù)因子，而野生基因型ALDH2*1/*1 個(gè)體飲酒后不會(huì)馬上出現(xiàn)不舒適感，因此飲酒量及次數(shù)往往會(huì)多于ALDH2*2/*1 和ALDH2*2/*2 基因型個(gè)體[4,5]。酒精對(duì)血尿酸的影響不僅取決于飲酒量還與酒精代謝的酶相關(guān)，本研究旨在了解廣東省無(wú)降尿酸治療史、平均每天飲酒量約25mL(隨訪中自報(bào)告飲酒量)人群的不同ALDH基因型(第504 位Glu 突變?yōu)長(zhǎng)ys)與血尿酸的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選自2018 年1 月至2020 年12 月在佛山市中醫(yī)院進(jìn)行ALDH2 基因多態(tài)性檢測(cè)的人群，平均每天飲酒量為白酒25mL，共153 人。

1.2 試劑與儀器

PCR 儀：AB7500 熒光定量PCR 儀(美國(guó)Life Technologies公司)；人類ALDH2 基因檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)?購(gòu)自武漢友芝友醫(yī)療科技股份有限公司；核酸提取儀Smart32購(gòu)自廣州達(dá)安醫(yī)療有限公司；貝克曼庫(kù)爾特AU5831 全自動(dòng)生化儀。

1.3 外周血DNA 提取

取志愿者的EDTA-K 抗凝靜脈血2mL，提取方法參考廣州和實(shí)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的核酸提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作：抗凝全血靜置后會(huì)出現(xiàn)分層現(xiàn)象，提取前應(yīng)反復(fù)混勻后加200uL 全血在96 孔預(yù)裝板的第1 列和第7 列，再加入蛋白酶50uL，在Smart32 核提取酸儀上按照儀器要求的提取程序進(jìn)行自動(dòng)化核酸提取，運(yùn)行結(jié)束后第6 列和第12 列對(duì)應(yīng)槽位為相應(yīng)標(biāo)本提取的DNA。

1.4 熒光定量PCR 擴(kuò)增ALDH2 基因

先將ALDH2*2 反應(yīng)液23μL，加入到200μL PCR 8 聯(lián)管內(nèi)，再依次分別加入基因組DNA、弱陽(yáng)性對(duì)照、空白對(duì)照各2μL 到已裝有PCR 反應(yīng)液的反應(yīng)管中，待測(cè)標(biāo)本基因組DNA推薦的濃度為5-15ng/ul。蓋好反應(yīng)管按如下程序擴(kuò)增：37℃ 10min，95 ℃預(yù)變性5min；擴(kuò)增階 段95 ℃變 性15s，60 ℃延伸60s，共40 個(gè)循環(huán)。熒光信號(hào)的收集定為FAM(ALDH2*2 1502G)，VIC(ALDH2*2 1502A)和ROX(內(nèi)標(biāo))，數(shù)據(jù)的采集定在60℃。

1.5 ALDH2 基因型判定

陽(yáng)性對(duì)照組的FAM、VIC、ROX 通道Ct值≤32，擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期；空白對(duì)照組的FAM、VIC、ROX 通道無(wú)擴(kuò)增曲線，或者擴(kuò)增曲線為直線或輕微斜線，無(wú)明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，無(wú)Ct值或Ct值≥38。樣本組有效性的判定標(biāo)準(zhǔn)為：內(nèi)標(biāo)基因所有樣本中ROX 通道Ct＜38，擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期。

1.6 血尿酸檢測(cè)方法

本研究利用貝克曼庫(kù)爾特AU 生化分析系統(tǒng)中配備的尿酸酶-過(guò)氧化物酶法檢測(cè)血尿酸含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SigmaPlot 12 與Excel 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果

2.1 ALDH2 基因型的檢測(cè)

檢測(cè)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)如下：野生基因型ALDH2*1/*1 的FAM 通道Ct值≤36、VIC 通道Ct值＞36 或無(wú)Ct值，雜合基因型ALDH2*2/*1 的FAM 通道Ct值≤36、VIC 通 道Ct值≤36，純合突變基因型ALDH2*2/*2 的FAM 通道Ct值＞36 或無(wú)Ct值、VIC 通道Ct值≤36，不同基因 型ALDH2的熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果如圖1 所示，上圖為野生基因型ALDH2*1/*1、中圖為雜合基因型ALDH2*2/*1、下圖為純合突變基因型ALDH2*2/*2。

圖1 不同基因型ALDH2 的熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果

2.2 不同ALDH2 基因型的人數(shù)及血尿酸

在檢測(cè)人群中，野生基因型ALDH2*1/*1 個(gè)體共62 人，其中女性2 人、男性60 人；雜合基因型ALDH2*2/*1 個(gè)體共61 人，女性7 人、男性54 人；純合突變基因型ALDH2*2/*2個(gè)體共30 人，女性8 人、男性22 人。不同基因型人群的血尿酸如表1 所示。

表1 不同基因型人群的血尿酸(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)

2.3 野生基因型ALDH2＊1/＊1 人群的血尿酸分布

根據(jù)本醫(yī)院血尿酸的檢測(cè)方法，血尿酸的參考范圍：男性為208-428 μmol/L，女性為155-357 μmol/L。在此基礎(chǔ)上，野生基因型ALDH2*1/*1 人群的血尿酸分布如圖2 所示，血尿酸在正產(chǎn)范圍內(nèi)的共0 人；血尿酸超出上限0～50 μmol/L 的共24 人，比例約為38.71%，血尿酸平均值為443.63±23.23 μmol/L；血尿酸超出上限50～100 μmol/L 的共15 人，比例約為24.19%，平均值為498.69±14.52 μmol/L；血尿酸超出上限100～150 μmol/L 的共10 人，比例約為16.13%，平均值為550.76±12.93 μmol/L；血尿酸超出上限150～200 μmol/L 的共7 人，比例約為11.29%，平均值為598.54±4.76 μmol/L；血尿酸超出上限200 μmol/L 的共6 人，比例約為9.7%，平均值為714.78±75.01 μmol/L。

圖2 野生基因型ALDH2＊1/＊1 人群的血尿酸分布

2.4 雜合基因型ALDH2＊2/＊1 人群的血尿酸分布

ALDH2*2/*1 人群的血尿酸分布如圖3 所示，血尿酸在正產(chǎn)范圍內(nèi)的共0 人；血尿酸超出上限0～50 μmol/L 的共19 人，比例約為31.15%，血尿酸平均值為437.29±33.99 μmol/L；血尿酸超出上限50～100 μmol/L 的共22 人，比例約為36.07%，平均值為496.82±21.91 μmol/L；血尿酸超出上限100～150 μmol/L 的共13 人，比例約為21.31%，平均值為552.08±16.32 μmol/L；血尿酸超出上限150～200 μmol/L 的共4 人，比例約為6.56%，平均值為604.15±7.83 μmol/L；血尿酸超出上限200 μmol/L 的共3人，比例約為4.92%，平均值為636.97±4.34 μmol/L。

圖3 雜合基因型ALDH2＊2/＊1 人群的血尿酸分布

2.5 純合突變基因型ALDH2＊2/＊2 人群的血尿酸分布

ALDH2*2/*2 人群的血尿酸分布如圖4 所示，血尿酸在正產(chǎn)范圍內(nèi)的共13 人，比例約為43.33%，血尿酸平均值為347.19±37.48 μmol/L；血尿酸超出上限0～50 μmol/L 的共7 人，比例約為23.33%，血尿酸平均值為427.46±28.44 μmol/L；血尿酸超出上限50～100 μmol/L 的共3 人，比例約為10.00%，平均值為459.63±24.25 μmol/L；血尿酸超出上限100～150 μmol/L 的共7 人，比例約為23.33%，平均值為508.51±24.18 μmol/L；血尿酸超出上限150 μmol/L 的共0 人。

圖4 純合突變基因型ALDH2＊2/＊2 人群的血尿酸分布

3 討論

在我們調(diào)查的153 名廣東人中，野生基因型ALDH2*1/*1共62 人，約占40.52%，雜合基因型ALDH2*2/*1 共61 人，約占39.87%，純合突變基因型ALDH2*2/*2 共30 人，約占19.61%。本研究納入的患者人數(shù)偏少，雖然不能表明當(dāng)?shù)厝说腁LDH2 基因多態(tài)性比例，但對(duì)于分析血尿酸與ALDH2 基因多態(tài)性的相關(guān)性的分析結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究顯示，野生基因型ALDH2*1/*1 與雜合基因型ALDH2*2/*1 的血尿酸差異并不顯著，尤其是在正常范圍內(nèi)的血尿酸分布和血尿酸超出上限0～150 μmol/L 范圍內(nèi)。僅在血尿酸超出參考值上限150～200 μmol/L 和200 μmol/L 以上范圍內(nèi)，二者的血尿酸分布存在著較大的差異，兩種基因型在上述范圍內(nèi)的占比分別為11.29%和9.7%、6.56%和4.92%。然而，純合突變型ALDH2*2/*2 的血尿酸分布與基因型ALDH2*1/*1 和ALDH2*2/*1 存在著顯著差異，其血尿酸平均值顯著較低。

除了上述ALDH2 基因變異造成的潛在飲酒量的差異外，基因型ALDH2*2/*1 與ALDH2*2/*2 的血尿酸分布的顯著差異，也充分體現(xiàn)了ALDH2 基因多態(tài)性與血尿酸關(guān)系的復(fù)雜性。在這方面已有多項(xiàng)研究被報(bào)道，Yamanaka 等[6]發(fā)現(xiàn)當(dāng)攝入60mL 威士忌后雜合子ALDH2*1/*2 基因個(gè)體的血液和尿液的次黃嘌呤濃度明顯低于野生型ALDH2*1/*1 個(gè)體，而ALDH2*2/*2 個(gè)體的血液和尿液次黃嘌呤濃度并不升高；同時(shí)發(fā)現(xiàn)在痛風(fēng)患者野生型ALDH2*1/*1 分布率要高于正常對(duì)照，而攜帶突變型ALDH2*2/*2 個(gè)體的痛風(fēng)患者卻少于正常對(duì)照者，因此得出結(jié)論日本大部分痛風(fēng)患者飲酒后無(wú)不適反應(yīng)，可能更易形成飲酒的習(xí)慣，加劇痛風(fēng)病情。Hashimoto[7]等的研究未發(fā)現(xiàn)ALDH2*2/*1、ALDH2*2/*2 基因型個(gè)體與ALDH2*1/*1 基因型個(gè)體血液尿酸濃度存在差異性。Sakiyama 等的研究發(fā)現(xiàn)野生型 ALDH2*1/*1 痛風(fēng)發(fā)作風(fēng)險(xiǎn)顯著高于ALDH2*2/*1、ALDH2*2/*2 基因型人群[8]。Suwa研究團(tuán)隊(duì)與Yamamoto 研究團(tuán)隊(duì)均發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)乙醇通過(guò)肝臟的氧化代謝過(guò)程，通過(guò)增加NADH/NAD 比值，加速丙酮酸向乳酸的轉(zhuǎn)化，從而使血液乳酸濃度升高競(jìng)爭(zhēng)性抑制尿酸的排泄。同時(shí)，通過(guò)酒精代謝消耗ATP，加速腺嘌呤核苷酸的降解，從而導(dǎo)致AMP 的形成，從而增加尿酸的產(chǎn)生[9,10]。Yokoyama 等的研究發(fā)現(xiàn)，在日本人中ALDH2*1/*1 基因型對(duì)乙醇和乙醛的快速代謝和較高的酮癥水平與酗酒者較高的血尿酸水平有關(guān)[11]。

本研究表明，在一定的飲酒量的情況下，血尿酸與ALDH2 基因多態(tài)性存在著顯著的相關(guān)性，而基因型ALDH2*2/*2 和ALDH2*2/*1 人群的血尿酸分布的顯著差異，也說(shuō)明二者的血尿酸與ALDH2 基因的相關(guān)性不僅與其活性相關(guān)，可能也與ALDH2 的其他功能相關(guān)，這一結(jié)果值得我們后續(xù)進(jìn)一步深入研究。