青海地區(qū)漢族及藏族胃腺癌中TGFβ 基因甲基化狀態(tài)研究

趙琳，王學紅，郜茜，馬雪芹，綻永華，李源化，李春霞，安琪

(青海大學附屬醫(yī)院，青海 西寧 810001)

0 引言

胃癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，以胃腺癌(Gastric adenocarcinoma)多見，發(fā)病機制尚不明確，目前認為是由遺傳因素、生物因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。遺傳學是腫瘤的研究基礎(chǔ)，表觀遺傳學的提出為腫瘤研究帶來了新的思路。表觀遺傳是沒有DNA 序列變化的可隨細胞分裂而遺傳的基因組修飾或基因表達調(diào)控，包括DNA 甲基化、組蛋白修飾等，這種基因序列不變而基因表達改變的作用機制在多細胞生物的發(fā)育中至關(guān)重要[1]，并能確?；虮磉_發(fā)生在正確的“時間”和“地點”[2]。DNA 甲基化已經(jīng)成為表觀遺傳學重要研究內(nèi)容。大量研究揭示了轉(zhuǎn)化生長因子β 誘導(dǎo)基 因(transforming growth factorβ induced gene，TGFβI) 在 腫瘤發(fā)生中的重要作用[3]。多民族聚居的青海是我國胃癌高發(fā)區(qū)[4]，研究發(fā)現(xiàn)藏族胃癌發(fā)病率高于漢族[5]，但具體機制尚不明確。本研究以青海地區(qū)胃癌高發(fā)和多民族聚居為研究背景，應(yīng)用 MethPrimer 在線平臺預(yù)測TGFβI 基因所富含CpG 島(共計15 個CpG 位點) 的序列；利用亞硫酸氫鹽測序(bisulfite sequencing PCR，BSP)法，對青海地區(qū)漢族及藏族胃腺癌患者TGFβI 基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)進行檢測，初步探討TGFβI 基因啟動子甲基化在不同民族間的狀態(tài)及與青海地區(qū)胃腺癌發(fā)生的關(guān)系。

1 對象及方法

1.1 一般資料

選擇2019 年3 月至11 月期間在青海大學附屬醫(yī)院住院經(jīng)胃鏡及病理首次確診的28 例胃腺癌病例為研究對象，收集患者的一般臨床資料，胃鏡檢查時選取胃癌組織、配對癌旁組織樣本各28 個；漢族患者17 例，藏族患者11 例，不同民族在年齡及性別上無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。

1.2 納入標準

①由胃鏡并黏膜活檢病理確診的胃腺癌患者；②在青海生活逾20 年者；③均未行放化療；④未患有影響本研究結(jié)果的其他疾患；⑤所有研究對象均簽署知情同意書，且通過青海大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準(批準文號：XHK-2017-SKJT-001)。

1.3 研究方法

①胃癌組織及癌旁組織DNA 提?。喊碋zup 柱式組織基因組DNA 抽屜試劑盒(B518251，上海生工) 說明書步驟進行。②DNA 亞硫酸氫鈉修飾：將各標本的DNA 20μL 依照修飾試劑盒說明書進行。③引物設(shè)計、PCR 擴增：應(yīng) 用MethPrimer 在線平臺預(yù)測TGFβ1 基因，序列總長度：2040bp；CpG 島預(yù)測結(jié)果：共發(fā)現(xiàn)1 個CpG 島，長度111 bp，位于1875～ 1985bp。其中包含有15 個CpG 位點。引物由上海生工生物公司設(shè)計，得到PCR 擴增引物序列：上游引物：TAAGGGTTGGGAAAATTGAGTA；下游引物：CCCRAACCAAATTAAATAAACTAC。PCR 反應(yīng)體系模板：DNA(20～50ng/μL)1～2μL。反應(yīng) 條件：在95 ℃下預(yù)變 性3～5 min；在94 ℃下變性30 sec；在55～60 ℃內(nèi)退火25～30 sec；在72 ℃下延伸30～50 sec；2～4 環(huán)節(jié)做35 個循環(huán)；在72 ℃下修復(fù)延伸5～8 min。④電泳檢測條帶：取PCR 產(chǎn)物取5μL 行1%瓊脂糖凝膠電泳(150V，100mA，10～20min)觀察。⑤連接反應(yīng)體系組成：1μL10Ligation Buffer，1μL50%PEG，50ng pUCmT Vector，0.2 pmolPCR Product，xμLH20，2.5U T4 DNA Ligase，F(xiàn)inal Volume 10μL，按試劑盒說明書轉(zhuǎn)化步驟制備感受態(tài)細胞(SK9307)。⑥ 藍白斑篩選：將IPTG/X～gal 平板上的白色菌落在含氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基過夜(37 ℃)。最后采用3%糖凝膠電泳檢測的方法，對目的片段TA 克隆的菌落行PCR 鑒定。⑦ 測序。

1.4 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0 分析。兩樣本率的比較、分析采用χ2檢驗或Fisher 確切概率法，視P＜0.05 為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 胃腺癌患者癌及癌旁組織中TGFβI 基因啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)

檢測28 例胃腺癌及其配對癌旁組織TGFβI 基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)，總克隆數(shù)8385 個CpG 位點(癌組織：4185；癌旁組織：4200)，甲基化陽性克隆總數(shù)771 個(癌組織：478；癌旁組織293)。癌組織中平均甲基化率為11.42%，配對癌旁組織中平均甲基化率為6.98%，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)(見表1)。

表1 胃腺癌患者癌及癌旁組織中TGFβI 基因啟動子區(qū)域甲基化率

2.2 兩個民族胃腺癌患者癌組織中TGFβI 基因啟動子區(qū)域甲基化率

漢族癌組織得到甲基化克隆數(shù)299 個，平均甲基化率11.73%；藏族癌組織得到甲基化克隆數(shù)179 個，平均甲基化率10.95%。兩個民族癌組織中TGFβI 基因啟動子甲基化率不具有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)(見表2)。

表2 兩個民族癌組織中TGFβI 基因啟動子區(qū)域甲基化率

2.3 兩個民族癌旁組織中TGFβI 基因啟動子區(qū)域甲基化率

漢族癌旁組織得到甲基化克隆數(shù)208 個，平均甲基化率8.16%；藏族癌旁組織得到甲基化克隆總數(shù)85 個，平均甲基化率5.15%。漢族高于藏族，兩個民族間癌旁組織中TGFβI 基因啟動子區(qū)域甲基化差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(見表3)。

表3 兩個民族癌旁組織中TGFβI 基因啟動子區(qū)域甲基化率

2.4 同一民族癌組織及癌旁組織TGFβI 基因啟動子區(qū)域甲基化率

癌組織及癌旁組織中TGFβI 基因啟動子區(qū)域甲基化率在漢族中分別為11.73%和8.16%，藏族中分別為10.95%和5.15%，癌組織均高于癌旁組織(P＜0.001)(見表4)。

表4 同一民族GC 患者癌組織中及癌旁TGFβ1 甲基化率

3 討論

胃癌的發(fā)生是多因素、多步驟進行性發(fā)展的過程。在正常情況下，胃黏膜上皮細胞的增值和凋亡之間保持動態(tài)平衡，這種平衡的維持有賴于癌基因、抑癌基因及一些生長因子的共同調(diào)控，當癌基因被激活，抑癌基因被抑制，使胃上皮細胞過度增值又不能啟動凋亡信號，則可能逐漸進展為胃癌。隨著對腫瘤機制研究的不斷深入，人們認識到腫瘤基因表達模式的改變不僅包含遺傳學改變而且包含了更多的表觀遺傳學改變，表觀遺傳學改變在腫瘤的啟動和進展中發(fā)揮著比遺傳學更為重要的作用[1]。Feinberg 和Vogelstein 發(fā)現(xiàn)[6]，在腫瘤中同時存在兩個互相矛盾的表觀遺傳現(xiàn)象，即全基因組低甲基化和局部高甲基化。有研究認為[7-8]，全基因組的低甲基化可以導(dǎo)致ras、c-myc 等原癌基因激活，而DNA 啟動子區(qū)CpG 的高甲基化可以導(dǎo)致p16、APC 等抑癌基因失活，兩者協(xié)同作用，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。TGFβI 基因，最早是從由TGFβI 刺激的A549 肺腺癌細胞中克隆得到的基因，TGFβI基因存在廣泛，它可由多種類型的細胞產(chǎn)生，如人膀胱平滑肌(SMC)和成纖維細胞中表達[9]，也可以在腎近端小管細胞中表達[10]。作為細胞外基質(zhì)分子之一，最先被關(guān)注的是其調(diào)節(jié)細胞黏附和遷移的功能，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)TGFβ1 基因在多種腫瘤中均有表達，但有關(guān)其作用的報道不一致，有研究認為[11]在前列腺癌、腎癌中TGFβI 基因呈現(xiàn)高表達，并可誘導(dǎo)、增強腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的能力；與其相反的是[12-13]，在肺癌、乳腺癌細胞中TGFβI 表達水平明顯下降或表達缺失。DNA 甲基化，作為最熱門的表觀遺傳學修飾方式之一，在細胞生物學中有著十分重要的作用。DNA 甲基化是在DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)的作用下，于胞嘧啶堿(5-甲基胞嘧啶)的碳-5 位置加入一個甲基[14]。研究證明基因的表達結(jié)果會因為DNA 甲基化而導(dǎo)致基因沉默致使該基因的表達降低，亦或是DNA 甲基化反而導(dǎo)致基因過度表達[3]，而這些過度表達的癌基因可促進腫瘤的發(fā)生[15]。因此，頻繁、連鎖性的DNA高甲基化和DNA 低甲基化與腫瘤的產(chǎn)生和進一步發(fā)展可能有著密不可分的關(guān)系。

Han[16]等在對胃癌、肝癌等消化系統(tǒng)腫瘤的研究中用ELISA 法測定胃癌患者血清中TGFβI 水平，得到患者血清TGFβI 水平明顯升高的結(jié)論，考慮異常過量表達的TGFβI 基因可能來源于腫瘤本身，且TGFβI 基因過表達導(dǎo)致自發(fā)性腫瘤發(fā)生率增加，提示在胃癌中TGFβI 基因可能扮演的是“癌基因”角色。同時Kiichi Sugimoto[17]等的研究，收集了原發(fā)性胃癌(primarygastriccancers，PGC) 及殘胃癌(remnantgastriccancers，RGC) 的病例樣本，對全基因組DNA 啟動子進行甲基化分析證實了在基因普遍高甲基化組中PGC 的貢獻顯著，表明PGC 的啟動子甲基化狀態(tài)高于RGC(P=0.004)，這也進一步闡明了PGC 與甲基化的關(guān)系。

我們的研究應(yīng)用BSP 法，檢測青海地區(qū)漢族及藏族胃腺癌患者TGFβI 基因啟動子區(qū)域的甲基化情況，探討不同民族間TGFβI 基因甲基化狀態(tài)有無差異及甲基化與青海地區(qū)胃腺癌發(fā)生的關(guān)系。研究結(jié)果顯示，胃腺癌患者癌組織中TGFβI基因啟動子甲基化程度明顯高于癌旁組織(P＜0.001)，相同民族TGFβI 甲基化率癌組織均高于癌旁組織(P＜0.001)，與Kiichi Sugimoto 的研究結(jié)果一致，提示TGFβI 基因在胃腺癌中可能作為“癌基因”存在，高甲基化會上調(diào)基因表達，從而參與胃癌的發(fā)生。

青海為少數(shù)民族聚居地，在一項時間跨度近30 年的回顧性研究中發(fā)現(xiàn)，青海地區(qū)少數(shù)民族胃癌檢出率高于漢族(P＜0.01)[4]。在一項有關(guān)藏族胃癌患者危險因素的研究結(jié)果顯示，高原地區(qū)藏族人群患GC 的危險因素有作息不規(guī)律、喜食干硬食物、高鹽飲食、慢性及反復(fù)發(fā)作的胃部疾病、腫瘤家族史等[18]。藏族群眾因其祖輩長期居住的地理環(huán)境、游牧生活等因素導(dǎo)致了其無論從飲食習慣、生活習性都具有獨特的特點，但關(guān)于表觀遺傳學方面尚無研究報道。為進一步探討基因表觀遺傳學在民族間的差異，我們進行了漢族及藏族胃腺癌中TGFβI 基因啟動子甲基化狀態(tài)研究，實驗結(jié)果顯示TGFβI 基因啟動子甲基化率漢族為11.73%，藏族為10.95%，統(tǒng)計結(jié)果顯示兩個民族間無差異(P=0.440)。Shah[11]等已證實基因甲基化與腫瘤的局部侵襲呈正相關(guān)，結(jié)合本研究結(jié)果分析，考慮隨著甲基化程度不斷提高，局部組織細胞惡變程度加重呈現(xiàn)均質(zhì)化，而本實驗兩民族均選用晚期癌組織，故兩塊惡變完全的癌組織間基因甲基化均較為充分，此時差異便不再顯著。而在癌旁組織中，漢族組甲基化率8.16%，藏族組為5.15%，兩個民族間有差異(P＜0.05)，考慮癌旁組織為非癌或部分惡變組織[17]，甲基化程度不完全，結(jié)合Shah[11]等已證實基因甲基化與腫瘤的局部侵襲呈正相關(guān)的報道，推測漢族和藏族在遺傳學上有不同。本研究為表觀遺傳學在不同民族間腫瘤發(fā)病的研究提供一定參考數(shù)據(jù)。但本研究樣本數(shù)有限，需進一步擴大樣本研究。

TGFβI 基因啟動子區(qū)高甲基化狀態(tài)可能與青海地區(qū)胃癌高發(fā)有關(guān)，并可能扮演癌基因的角色。漢族和藏族癌組織中TGFβI 基因啟動子高甲基化狀態(tài)無差異，但在癌旁組織中有差異，推測漢族和藏族遺傳學上有不同，也提示甲基化可能在胃腺癌的早期發(fā)展階段起到更重要的作用，并在不同民族的胃腺癌發(fā)生過程中均扮演腫瘤啟動因子的角色。