β-甘露聚糖酶的結(jié)構(gòu)、特性及其在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用

殷運(yùn)菊 閆昭明 陳清華* 劉明峰

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128；2.山東隆科特酶制劑有限公司，沂水 276400)

甘露聚糖是存在于植物性飼料中的一類抗?fàn)I養(yǎng)因子，畜禽采食后會(huì)增加消化道內(nèi)食糜黏度，影響畜禽對(duì)飼糧中營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)的消化利用率降低[1]。已知β-甘露聚糖酶由多種細(xì)菌、真菌、放線菌、植物和動(dòng)物產(chǎn)生[2-3]，從微生物中提取的β-甘露聚糖酶因其低成本、易獲得和高活性等特性[1]，受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[4]，目前已在制漿造紙、制藥、食品、石油和紡織工業(yè)中得到廣泛應(yīng)用[1,5-9]。在飼糧中加入β-甘露聚糖酶，可使細(xì)胞壁中甘露聚糖分解，并促進(jìn)被細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)包裹的營養(yǎng)物質(zhì)釋放，降低消化道內(nèi)食糜黏度，增加十二指腸和空腸絨毛的高度，從而使表面積增大，提升動(dòng)物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力[10]，達(dá)到提高植物性原料的消化利用率和改善動(dòng)物生產(chǎn)性能的效果。本文主要從β-甘露聚糖酶的酶學(xué)特性以及其在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，為β-甘露聚糖酶在畜牧業(yè)中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 甘露聚糖與甘露聚糖酶

在植物性原料中，甘露聚糖是高等植物細(xì)胞壁中半纖維素的主要成分之一，它包括由D-甘露糖、D-半乳糖和D-葡萄糖等單糖合成的線性或支鏈聚合物[11]。甘露聚糖可分為線性甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖(圖1)，從結(jié)構(gòu)上看，這些多糖均含有甘露糖或葡萄糖和甘露糖殘基組合而成的β-1,4-主鏈[12]。此外，甘露聚糖主鏈可以被側(cè)鏈的半乳糖α-1,6-連鎖殘基取代[13]。由于甘露聚糖具有黏度、表面活性及持水性等物理特性，因此單胃動(dòng)物采食后會(huì)產(chǎn)生抗?fàn)I養(yǎng)作用。甘露聚糖抗?fàn)I養(yǎng)作用表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：一是在畜禽消化道內(nèi)甘露聚糖溶于水后易形成凝膠狀，增加食糜黏度，造成動(dòng)物飽腹感增加并降低采食量，從而降低生長性能；二是甘露聚糖具有高持水活性，可吸收大量水分，使其物理特性發(fā)生改變，抑制腸道的蠕動(dòng)；三是甘露聚糖的高親水性使其易與腸黏膜上的脂類微團(tuán)及多糖蛋白復(fù)合物產(chǎn)生相互作用，導(dǎo)致腸黏膜表面水層變厚，降低營養(yǎng)物質(zhì)吸收；四是未消化的非淀粉多糖(non-starch polysaccharide，NSP)如甘露聚糖等在消化道內(nèi)沉積，使消化道后段微生物厭氧發(fā)酵，產(chǎn)生大量毒素，引起消化道微生物群落的紊亂并抑制動(dòng)物生長；五是在消化液中甘露聚糖極易與飼糧中帶相反電荷的營養(yǎng)物質(zhì)結(jié)合，從而影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用[14-15]。

圖1 甘露聚糖分類

各種構(gòu)型的甘露聚糖是真菌、細(xì)菌和病毒等許多病原體的表面成分，可以刺激腸道上皮中先天免疫系統(tǒng)的免疫細(xì)胞[1,16]，先天免疫細(xì)胞通過病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)來識(shí)別病原體，并與先天免疫細(xì)胞中的受體結(jié)合激活該類細(xì)胞[17]。因此，飼糧中的甘露聚糖會(huì)發(fā)出腸道中存在病原體的錯(cuò)誤信號(hào)，引發(fā)不合理的免疫激活，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞增殖增加，并由此產(chǎn)生細(xì)胞因子，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)以及降低營養(yǎng)物質(zhì)吸收利用率[18]；同時(shí)，甘露聚糖使葡萄糖吸收利用率降低，抑制了胰島素的分泌及胰島素樣生長因子-Ⅰ的表達(dá)，從而影響動(dòng)物機(jī)體對(duì)能量的利用[18-19]。甘露聚糖的水解可以消除腸道中的這一錯(cuò)誤信號(hào)，使巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和細(xì)胞因子的產(chǎn)生減少，血糖濃度升高[18,20]。

β-甘露聚糖酶是一種半纖維素水解酶，能破壞甘露聚糖主鏈的內(nèi)部糖苷鍵，釋放結(jié)構(gòu)較短的1,4-甘露低聚糖。根據(jù)β-甘露聚糖酶的氨基酸序列，將其主要分為糖苷水解酶家族(glycoside hydrolase family，GH)5、26和113。GH5和GH26都屬于最大的糖苷水解酶家族——GH-A。GH-A酶家族具有TIM(α/β)8桶狀結(jié)構(gòu)和保留反應(yīng)機(jī)制[21]，TIM(α/β)8桶狀結(jié)構(gòu)由10股β-鏈和13個(gè)α-螺旋組成，包括3個(gè)310-螺旋(殘基60～62、64～66和289～294)。β-片狀結(jié)構(gòu)由8條位于中部的平行β-鏈(黃色)組成，形成1個(gè)被8個(gè)大小為4.5 nm×4.5 nm×4.0 nm的α-螺旋(紅色)包圍的圓筒(圖2)。β-甘露聚糖酶的活性位點(diǎn)是位于第4個(gè)和第7個(gè)β折疊的C末端的2個(gè)谷氨酸，分別作為酸堿催化位點(diǎn)和親核催化位點(diǎn)，在所有的β-甘露聚糖酶中絕對(duì)保守[21-22]。通常情況下，除了催化模塊之外，β-甘露聚糖酶還攜帶額外的模塊，最常見的是碳水化合物結(jié)合模塊(carbohydrate-binding module，CBM)。CBM根據(jù)序列相似性和三維結(jié)構(gòu)至少被分為53個(gè)家族。一些β-甘露聚糖酶含有甘露聚糖結(jié)合的CBM，對(duì)這些模塊的結(jié)構(gòu)研究為深入了解甘露聚糖主干識(shí)別和側(cè)基調(diào)節(jié)機(jī)制提供了依據(jù)。另一些含有纖維素結(jié)合的CBM，可顯著增加不溶性甘露聚糖纖維素復(fù)合物的水解[1，21]。

圖2 β-甘露聚糖酶的結(jié)構(gòu)

β-甘露聚糖酶在自然界中普遍存在，已從細(xì)菌、真菌、放線菌、植物和動(dòng)物中分離出來(表1)，飼用β-甘露聚糖酶主要來源于微生物[15]，主要原因?yàn)榘饷赶蛋踩雀?、易獲取等；其培養(yǎng)及生產(chǎn)方式主要為深層發(fā)酵(submerged fermentation，SMF)和固態(tài)發(fā)酵(solid-state fermentation，SSF)2種。

表1 β-甘露聚糖酶的來源

2 β-甘露聚糖酶的酶學(xué)特性

國內(nèi)外研究學(xué)者通常采用有機(jī)溶劑沉淀、雙水相萃取、層析和離子交換等方法對(duì)β-甘露聚糖酶進(jìn)行分離純化[34]。β-甘露聚糖酶活性的測(cè)定方法有：黏度法、還原糖法以及色原底物法；其中還原糖法中的二硝基水楊酸(dinitrosalicylic acid，DNS)比色法因其方法成熟、操作簡單和顯色穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，在β-甘露聚糖酶活性測(cè)定中被廣泛使用[35-36]。

不同來源的β-甘露聚糖酶構(gòu)成不同，它們的相對(duì)分子質(zhì)量、酶動(dòng)力學(xué)特性和作用方式也有所不同。β-甘露聚糖酶的最適pH大多數(shù)在4.0～7.0，最適溫度在40～65 ℃，小于或高于最適溫度，大多數(shù)酶不穩(wěn)定。Soni等[37]對(duì)土壤曲霉固態(tài)培養(yǎng)物中提取的β-甘露聚糖酶進(jìn)行研究，結(jié)果表明純化的β-甘露聚糖酶的活性為53.75 U/mg，分子質(zhì)量為49 ku，最佳pH為7.0，最佳溫度為70 ℃。You等[38]對(duì)從腸桿菌屬N18中分離的β-甘露聚糖酶進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)β-甘露聚糖酶分子質(zhì)量為90 ku；以0.5%瓜爾膠、魔芋粉、豆膠(locust bean gum，LBG)、黃原膠和羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethyl cellulose，CMC)作為底物測(cè)定β-甘露聚糖酶活性，結(jié)果顯示LBG作為底物時(shí)，β-甘露聚糖酶活性最高，為(8 132±39) U/mg；β-甘露聚糖酶在最佳溫度50 ℃(pH=7.0)時(shí)超過75%的活性，而在70 ℃時(shí)還保留40%以上的活性；一些因素可影響β-甘露聚糖酶的活性，例如1 mmol/L汞離子(Hg2+)顯著抑制酶活性，1 mmol/L鈣離子(Ca2+)、鎳離子(Ni2+)、銅離子(Cu2+)、鐵離子(Fe3+)、鋅離子(Zn2+)、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)和10%乙醇也可抑制酶活性，而1 mmol/L鈷離子(Co2+)、亞鐵離子(Fe2+)和十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)能顯著提高β-甘露聚糖酶的活性。

為解決β-甘露聚糖酶在生產(chǎn)應(yīng)用中存在的問題，大量內(nèi)源β-甘露聚糖酶基因已被克隆并在外源宿主中表達(dá)，主要以原核和真核2種外源表達(dá)系統(tǒng)為主[39]。源自細(xì)菌的內(nèi)源β-甘露聚糖酶的基因通常在大腸桿菌表達(dá)[40]，而真菌來源的β-甘露聚糖酶基因常在帕斯氏酵母和曲霉中表達(dá)[41]。原核和真核生物中的內(nèi)源β-甘露聚糖酶基因大小在978～2 010 kb。完全成熟的重組內(nèi)源β-甘露聚糖酶蛋白含有326～669個(gè)氨基酸殘基。從芽孢桿菌屬和曲霉真菌屬中獲得的內(nèi)源β-甘露聚糖酶，克隆和表達(dá)后獲得最高酶活性為1 575 U/mL[16]。對(duì)枯草桿菌MA139的β-甘露聚糖酶基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，得到的重組酶具有較高的酶活性[42]。

3 β-甘露聚糖酶在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用

3.1 在家禽生產(chǎn)上的應(yīng)用

研究表明，在家禽飼糧中添加β-甘露聚糖酶可以提高家禽生長性能和免疫力[43-44]。Jackson等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加80或110 MU/t的β-甘露聚糖酶時(shí)，肉雞的增重和飼料效率都有所提高，而添加50 MU/t的β-甘露聚糖酶沒有顯著效果。Zheng等[45]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加β-甘露聚糖酶可提高蛋雞產(chǎn)蛋前期的采食量、產(chǎn)蛋率以及雞蛋質(zhì)量；同時(shí)，飼糧添加β-甘露聚糖酶還可增加蛋雞盲腸中乳酸菌數(shù)量，降低氨濃度。β-甘露聚糖酶提高免疫力的一個(gè)可能原因是甘露聚糖被降解為甘露寡糖(mannan oligosaccharide，MOS)[43]。研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加β-甘露聚糖酶可降低胸腺和法氏囊相對(duì)權(quán)重以及血清免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)和免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM)含量，β-甘露聚糖酶可抑制由甘露聚糖引起的動(dòng)物免疫反應(yīng)，從而減少動(dòng)物機(jī)體免疫反應(yīng)[46]。也有研究表明，在肉雞飼糧中添加β-甘露聚糖酶增加了淋巴細(xì)胞數(shù)量，降低了異核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞比(H∶L)，從而改善雞的免疫系統(tǒng)能力[47]。

甘露聚糖具有黏度，可通過減慢胃腸排空、削弱底物與消化酶的結(jié)合以及降低營養(yǎng)物質(zhì)與小腸上皮的接觸速率造成營養(yǎng)物質(zhì)吸收和利用減少[48]。Mehri等[47]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加900 g/t的β-甘露聚糖酶可顯著提高小腸絨毛高度、杯狀細(xì)胞數(shù)量、小腸不同部位的隱窩深度和上皮厚度。研究表明，β-甘露聚糖酶提高飼料利用率主要通過3個(gè)途徑來實(shí)現(xiàn)：一是β-甘露聚糖酶分解細(xì)胞壁基質(zhì)，促進(jìn)被細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)包裹營養(yǎng)物質(zhì)的釋放；二是降低食糜黏度，提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化率；三是促進(jìn)十二指腸和空腸絨毛高度的增加，增大吸收表面積，改善腸對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收效率[10]。

3.2 在豬生產(chǎn)上的應(yīng)用

研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加β-甘露聚糖酶可以提高生長豬和育肥豬的生長性能[49-50]，還可以提高哺乳母豬乳脂水平及乳糖含量[51]。Kim等[52]研究發(fā)現(xiàn)，在生長豬飼糧中添加400 U/kg的β-甘露聚糖酶能提高其對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)消化率以及血糖濃度，營養(yǎng)物質(zhì)消化率提高可能是由于β-甘露聚糖酶的水解作用增加了細(xì)胞壁的通透性，切斷了長鏈多糖，從而加速了營養(yǎng)物質(zhì)的消化。血糖濃度的提高是由于NSP在后腸被β-甘露聚糖酶分解發(fā)酵產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸，而揮發(fā)性脂肪酸可代替葡萄糖發(fā)揮能源作用。Jeon等[53]研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加0.5 g/kg的β-甘露聚糖酶可提高生長豬平均日增重(ADG)以及標(biāo)準(zhǔn)回腸氨基酸消化率，因而降低豬糞便氨濃度。Upadhaya等[54]在飼糧中添加0.05%的β-甘露聚糖酶，可減少生長豬腸道中大腸桿菌數(shù)量。而消化道中微生物的種類和數(shù)量是影響營養(yǎng)物質(zhì)消化率和腸道健康狀況的重要因素，乳酸菌被認(rèn)為是有益于腸道的細(xì)菌，而大腸菌則被認(rèn)為可以引起腹瀉等腸道健康問題[54]，因此β-甘露聚糖酶可以改善動(dòng)物腸道健康。丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量是衡量機(jī)體氧化應(yīng)激的重要指標(biāo)，β-甘露聚糖酶在仔豬生產(chǎn)中的應(yīng)用有助于提高仔豬機(jī)體抗氧化能力，其主要原因是補(bǔ)充β-甘露聚糖酶降低了空腸中MDA的含量[55]。

3.3 在反芻動(dòng)物生產(chǎn)上的應(yīng)用

研究表明，β-甘露聚糖酶可以提高反芻動(dòng)物的生產(chǎn)性能和免疫力。Lee等[56]在山羊飼糧中添加0.1%的β-甘露聚糖酶可以提高其飼料轉(zhuǎn)化率及ADG。Azevedo等[57]研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，飼糧添加0.1%β-甘露聚糖酶可降低奶牛血清結(jié)合珠蛋白濃度。結(jié)合珠蛋白作為反芻動(dòng)物主要的急性期蛋白(acute phase protein，APP)，可用于檢測(cè)全身性炎癥的發(fā)作，包括乳腺炎、子宮內(nèi)膜炎和肺炎。因此，補(bǔ)充β-甘露聚糖酶可能通過減少急性期反應(yīng)而發(fā)揮抗炎作用。奶牛飼喂β-甘露聚糖酶后，對(duì)其血清進(jìn)行生化分析發(fā)現(xiàn)：血清中IgG含量和CD4/CD8值在數(shù)值上較高；因此，飼糧添加β-甘露聚糖酶有提高泌乳奶牛免疫力的潛力。Roque等[20]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加0.1%β-甘露聚糖酶不僅能發(fā)揮抗炎作用，降低潛在的免疫激活，改善奶牛的能量平衡，還能減少奶牛每次成功受孕所需的授精次數(shù)。

4 小 結(jié)

β-甘露聚糖酶作為一種環(huán)保的飼料添加劑已經(jīng)應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖中。β-甘露聚糖酶通過水解NSP中的甘露聚糖，使植物性飼料中的營養(yǎng)成分充分釋放，有利于動(dòng)物消化吸收。同時(shí)，補(bǔ)充β-甘露聚糖酶還能消除飼糧中甘露聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用，降低消化道食糜黏性，從而提高飼糧營養(yǎng)物質(zhì)消化率，并達(dá)到保護(hù)環(huán)境的目的。目前，我國在β-甘露聚糖酶的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)研究中已獲得重大突破和進(jìn)展，但其生產(chǎn)和穩(wěn)定化技術(shù)還未發(fā)展成熟，從而限制其在畜牧業(yè)中的應(yīng)用。因此，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)β-甘露聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)及菌種改良的研究。除通過蛋白質(zhì)工程改造β-甘露聚糖酶制劑性能，如提高酶活力、耐溫和耐酸性等；還應(yīng)繼續(xù)從動(dòng)物、植物及微生物中尋找更多優(yōu)質(zhì)β-甘露聚糖酶來源，同時(shí)加深對(duì)其結(jié)構(gòu)、功能及作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)，推動(dòng)其在畜牧業(yè)中的應(yīng)用。