會(huì)仙巖溶濕地古菌和細(xì)菌群落的共現(xiàn)性

程躍揚(yáng), 靳振江, 袁 武, 賈遠(yuǎn)航, 梁錦桃, 邱江梅,潘復(fù)靜, 劉德深

(桂林理工大學(xué) a.環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院; b.巖溶地區(qū)水污染控制與用水安全保障協(xié)同創(chuàng)新中心;c.廣西環(huán)境污染控制理論與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣西 桂林 541006)

0 引 言

土壤微生物參與濕地系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán), 對(duì)維持濕地生態(tài)系統(tǒng)具有重要作用[1]。古菌和細(xì)菌均為土壤中廣泛分布的兩大微生物類(lèi)群, 二者的群落結(jié)構(gòu)均受到多種因素的影響, 其中, 土地利用變化帶來(lái)植被、管理和土壤理化因子等的變化，都會(huì)影響到二者的群落結(jié)構(gòu), 進(jìn)而對(duì)土壤中的物質(zhì)循環(huán)產(chǎn)生影響[2]。在濕地生態(tài)系統(tǒng)中, 古菌、細(xì)菌群落以及古菌細(xì)菌之間存在復(fù)雜的相互作用, 在決定生態(tài)系統(tǒng)功能方面起著至關(guān)重要的作用。高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析方法能夠?yàn)檠芯可鷳B(tài)系統(tǒng)內(nèi)部微生物之間的相互作用提供新的思路。目前, 對(duì)濕地微生物之間共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的研究主要集中在近岸海洋線(xiàn)蟲(chóng)與細(xì)菌和古菌[3]、貝加爾湖細(xì)菌與真核微生物[4]以及太湖細(xì)菌[5]等方面, 這些研究總體上揭示了不同濕地類(lèi)型不同微生物群落之間的相互作用, 以及微生物在這些生態(tài)系統(tǒng)中生物地球化學(xué)循環(huán)中的潛在重要作用。

桂林會(huì)仙濕地是我國(guó)最大的低海拔巖溶濕地[6]。會(huì)仙濕地不同土地利用和植物根際細(xì)菌群落的豐度和多樣性[7-8]及會(huì)仙濕地沉積物中甲烷菌的群落結(jié)構(gòu)[9]已有報(bào)道, 這些研究表明會(huì)仙濕地中細(xì)菌和甲烷菌具有較高的多樣性。但是, 相比于微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性, 探究微生物之間的相互作用對(duì)了解生態(tài)系統(tǒng)功能更重要, 因此, 需要進(jìn)一步去探索會(huì)仙濕地土壤微生物之間的相互關(guān)系。

本文以會(huì)仙濕地的湖泊濕地、稻田和稻田撂荒地土壤為研究對(duì)象, 以16S rRNA基因的515F和806R為通用引物[10-11], 利用高通量測(cè)序方法, 采用共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)來(lái)分析細(xì)菌群落、古菌群落以及二者之間的共現(xiàn)性, 探究微生物之間的相互作用和共存機(jī)制, 以及共存微生物在濕地土壤生物地球化學(xué)循環(huán)中的重要作用, 更好地理解會(huì)仙濕地系統(tǒng)的運(yùn)行規(guī)律, 為會(huì)仙濕地的保護(hù)提供科學(xué)的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣點(diǎn)概況與樣品采集

采樣點(diǎn)位于廣西桂林市西南方向30 km的臨桂縣會(huì)仙鎮(zhèn)馮家村， 地處亞熱帶季風(fēng)區(qū), 年平均氣溫18.8 ℃、降雨量1 915.2 mm, 地理坐標(biāo)為25°01′30″—25°11′15″N, 110°08′15″—110°18′00″E, 采樣區(qū)域內(nèi)主要植被有蘆葦(Phragmitescommunis)和華科拉莎草(Cladiumchinense)等[12]。近年來(lái), 由于人為墾殖和破壞(很大部分被開(kāi)發(fā)為農(nóng)業(yè)用地, 還有一些是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期耕作后的撂荒地), 巖溶濕地現(xiàn)存面積僅24 km2[13], 2018年7月, 在會(huì)仙濕地巖溶試驗(yàn)場(chǎng)選取湖泊濕地(優(yōu)勢(shì)植被為雙穗雀稗草Paspaiumdistichum)、稻田(水稻處于結(jié)實(shí)期)和稻田撂荒地(優(yōu)勢(shì)植被為稗草Echinochloacrusgalli)3種土地利用方式的樣地, 在每個(gè)樣地隨機(jī)取3個(gè)采樣點(diǎn)混合為一個(gè)樣本, 共采集到9個(gè)樣本。 樣本土壤采集深度為0～20 cm, 去除植物根系和碎石等雜物, 一部分自然風(fēng)干后研磨，分別過(guò) 0.85、0.25和0.15 mm篩, 常溫存儲(chǔ)用于測(cè)定理化性質(zhì); 另一部分置于-80 ℃冰箱暫時(shí)冷藏, 用來(lái)提取土壤微生物的DNA。

1.2 土壤養(yǎng)分測(cè)定

土壤養(yǎng)分測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行, 其中土壤pH值的測(cè)定采用蒸餾水(無(wú)CO2)作為浸提劑, 水土比2.5∶1, 混勻后用pH計(jì)(型號(hào): IS128C)測(cè)量; 土壤有機(jī)碳(SOC)測(cè)定采用濃硫酸重鉻酸鉀外加熱法; 土壤全氮(TN)采用濃H2SO4消煮凱氏定氮法; 堿解氮(AN)采用堿解擴(kuò)散法測(cè)定; 總磷(TP)采用碳酸鈉熔融法; 速效磷(AP)采用鹽酸氟化銨法； 可溶性有機(jī)碳(DOC)采用水土振蕩提取法。土壤養(yǎng)分含量見(jiàn)表1。

表1 3種土地利用方式土壤的養(yǎng)分含量Table 1 Soil nutrient content in three types of land-use

1.3 土壤DNA提取與高通量測(cè)序

用DNA快速提取試劑盒(Power Soil, QIGEN公司)提取土壤的DNA, 提取步驟參照說(shuō)明書(shū), 使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA。選取引物序列515F(5′-GTG YCA GCM GCC GCG GTA A-3′)和806R(5′-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3′)為通用測(cè)序引物對(duì)古菌和細(xì)菌的16S rDNA V4區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。PCR(Applied Biosystems? Gene Amp? PCR System 9700)擴(kuò)增程序包括起始 94 ℃ 、1 min, 然后變性設(shè)置為94 ℃、20 s, 退火設(shè)置為54 ℃、30 s, 延伸設(shè)置為72 ℃、30 s, 并將變性、退火和延伸進(jìn)行30次循環(huán), 最后為72 ℃ 、5 min。將PCR產(chǎn)物與loading buffer 混合, 使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 膠回收試劑盒QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)回收PCR產(chǎn)物, 利用Qubit@2.0 Fluorometer (Thermo Scientific)進(jìn)行定量, 最后等物質(zhì)的量混合樣本?；厥盏腄NA送到成都羅寧生物科技有限公司, 使用羅寧生物的Hiseq 2500平臺(tái)PE250模式測(cè)序。

得到原始數(shù)據(jù)后使用Trimmomatic進(jìn)行質(zhì)量控制, 再使用Uchime 算法去除嵌合體后得到有效數(shù)據(jù)。使用UPARSE 算法在97%的一致性對(duì)所有OUT進(jìn)行劃分并挑選出代表序列, 使用UCLUST分類(lèi)法與 SILVA 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU進(jìn)行不同分類(lèi)水平的注釋。利用α多樣性指數(shù)(包括Chao1、ACE、Shannon、Simpson指數(shù))表征古菌和細(xì)菌群落的豐富度和多樣性。其中, Chao1和ACE指數(shù)用來(lái)表征微生物豐富度, Shannon和Simpson指數(shù)用來(lái)表征微生物群落多樣性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本研究用Excel 2010對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理, 用SPSS 24.0軟件對(duì)α多樣性指數(shù)、門(mén)水平豐度進(jìn)行方差分析, Duncan法用于不同土地利用方式的顯著性檢驗(yàn), 顯著性水平為p<0.05, 門(mén)水平豐度與環(huán)境因子的相關(guān)性用Pearson法; 利用 Origin 2017繪制古菌和細(xì)菌群落在門(mén)水平上的相對(duì)豐度圖; 使用Cytoscape 3.7.0 軟件中的CoNet插件構(gòu)建古菌細(xì)菌共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)圖, 具體操作方法參考顧靜馨等[15]提供的步驟, 使用分子復(fù)合物檢測(cè)算法(MCODE)聚類(lèi)。使用MCODE插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊分析, 所有參數(shù)都采用標(biāo)準(zhǔn)值。利用 Network Analyzer 工具, 獲取網(wǎng)絡(luò)的連接度、節(jié)點(diǎn)數(shù)和連接數(shù)。在PASSaGE軟件中采用 Mantel分析土壤理化因子對(duì)共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵物種的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同土地利用方式下古菌和細(xì)菌多樣性

表2列出了3種土地利用方式下的古菌和細(xì)菌多樣性指數(shù), 可以看出, 稻田撂荒地細(xì)菌和古菌的Chao1和ACE指數(shù)均低于其他兩種土地利用方式, 古菌的Shannon和Simpson指數(shù)均為湖泊濕地>稻田>稻田撂荒地; 細(xì)菌的Shannon和Simpson指數(shù)均為稻田>湖泊濕地>稻田撂荒地, 表明土地利用改變了古菌和細(xì)菌的多樣性。

表2 3種土地利用方式下的古菌和細(xì)菌α多樣性指數(shù)Table 2 Archaea and bacterial α diversity index in three types of land-use

2.2 不同土地利用方式下古菌和細(xì)菌群落特征及與養(yǎng)分含量的相關(guān)性

本研究中所得到的古菌序列歸屬于5個(gè)古菌門(mén), 其中, 奇古菌門(mén)(Thaumarchaeota)、深古菌門(mén)(Bathyarchaeota)和廣古菌門(mén)(Euryarchaeota)這3個(gè)門(mén)占總古菌門(mén)的99.33%～99.93%(圖1a), 奇古菌門(mén)和深古菌門(mén)的豐度在湖泊濕地、稻田、稻田撂荒地的土壤中差異顯著, 分別為68.71%、73.26%、89.71%和23.02%、19.79%、3.67%, Euryarchaeota在3種土地利用方式土壤中的豐度沒(méi)有顯著差異。另外, 本研究所得到的細(xì)菌序列歸屬于39個(gè)菌門(mén), 其中, 綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、Rokubacteria、硝化螺旋菌門(mén)(Nitrospirae)、浮游霉菌(Planctomycetes)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、Latescibacteria、芽單胞菌門(mén)(Gemmatimatimonadetes)、疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia)、放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria)、Epsilonbacteraeota是相對(duì)豐度大于1%的細(xì)菌門(mén)類(lèi)(圖1b), 占細(xì)菌總門(mén)的96.73%～98.60%。

圖1 3種土地利用方式古菌(a)和細(xì)菌優(yōu)勢(shì)門(mén)(b)水平相對(duì)豐度Fig.1 Relative abundance of dominant phylun levels of archaea(a) and bacteria(b) in three types of land-use

圖2a可以看出, Thaumarchaeota與pH極顯著負(fù)相關(guān), 與C/N和DOC顯著正相關(guān); Bathyarchaeota與pH顯著正相關(guān), 與C/N顯著負(fù)相關(guān), 與DOC極顯著負(fù)相關(guān); 圖2b可以看出, pH與Chloroflexi、Proteobacteria、Nitrospirae和Planctomycetes顯著正相關(guān), 與Acidobacteria、Bacteroidetes和Actinobacteria顯著負(fù)相關(guān); C/N與Rokubacteria、Latescibacteria和Actinobacteria顯著正相關(guān)。DOC與Acidobacteria、Bacteroidetes和Actinobacteria顯著正相關(guān), 與Chloroflexi、Proteobacteria、Nitrospirae顯著負(fù)相關(guān)。

圖2 養(yǎng)分因子與古菌、細(xì)菌群落之間的相關(guān)性熱圖Fig.2 Heat maps of correlation of nutrient factors with archaea and bacterial communities

2.3 濕地古菌和細(xì)菌優(yōu)勢(shì)OTUs組成特征

在本研究中, 古菌優(yōu)勢(shì)OTUs(相對(duì)豐度>0.3%)包括Bathyarchaeota(OTU9、OTU38、OTU85、OTU1093、OTU49、OTU155和OTU231)、Thermoplasmataceae

(熱原體科, OTU55、OTU45、OTU227和OTU93)、Ferroplasmaacidarmanusfer1(OTU131)、Methanomassiliicoccales(OTU179)、Methanobacterium(甲烷桿菌屬, OTU415)、Methanobrevibactersp. YE315(甲烷桿菌, OTU219)、CandidatusNitrososphaera(OTU240和OTU11)、Nitrosotaleaceae(OTU5)、Nitrososphaeraceae(OTU1、OTU2、OTU2323、OTU204、OTU59和OTU911)。單因素方差分析表明, 排名前10的OUTs中, Nitrososphaeraceae(OTU1和OTU2323)的豐度在3種土地利用方式中有顯著差異, 呈現(xiàn)為APF>PF>LW(p<0.05), Nitrososphaeraceae(OTU9、OTU2、OTU38、OTU85、OTU1093)的豐度在PF中顯著高于APF(p<0.05), CandidatusNitrososphaera(OTU11)的豐度在LW顯著高于PF和APF(p<0.05), Thermoplasmataceae(OTU55)和Nitrososphaeraceae(OTU204)的豐度在3種土地利用中沒(méi)有顯著差異(p<0.05)。

細(xì)菌優(yōu)勢(shì)OTUs(相對(duì)豐度>0.3%)包括Acidobacteria subgroup 6(酸桿菌門(mén)GP6, OTU18、OTU68、OTU116、OTU41、OTU58、OTU28、OTU78、OTU180、OTU48、OTU56和OTU345)、Acidobacteria subgroup 4(酸桿菌門(mén)GP4, OTU21、OTU613和OTU272)、Holophagae subgroup 7(全噬菌綱GP7, OTU14)、Anaerolineae SBR1031(厭氧繩菌綱, OTU4、OTU12、OTU20、OTU15、OTU22、OTU36)、Anaerolineaceae(厭氧繩菌科, OTU 39、OTU27和OTU52)、Roseiflexaceae(OTU10和OTU30)、Dehalococcoidia(脫鹵球菌綱, OTU13)、Chloroflexi(OTU23、OTU66和OTU188)、Helicobactersp. MIT 99-5507(幽門(mén)螺桿菌, OTU47)、Ruminococcaceae UCG-002(瘤胃球菌科, OTU67)、Ruminococcaceae UCG-005(OTU230)、Lactobacillusgasseri(格氏乳桿菌, OTU34)、Lactobacillusacidophilus(嗜酸乳桿菌, OTU94)、Lactobacillusmurinus(鼠乳桿菌, OTU69)、Bacteria(OTU54)、Latescibacteria(OTU114)、Leptospirillumsp. Group II ′5-way CG′(OTU8)、Leptospirillumsp. Group II ′C75′(OTU19)、Deltaproteobacteria MBNT15(δ變形菌, OTU24)、AcidiphiliummultivorumAIU301(OTU17)、Neisseriasp. 104(2012)(奈瑟菌, OTU40)、Thauerasp. SWB20(索氏菌, OTU75)、Escherichia-Shigella(大腸桿菌志賀氏菌, OTU185)、Rokubacteria(棒狀桿菌門(mén))(OTU44、OTU16、OTU7、OTU25、OTU3和OTU63)、Spirochaetaceae GWE2-31-10(螺旋體科, OTU120)、Candidatus udaeobacter(OTU111)。單因素方差分析表明, 排名前10的OUTs中, Anaerolineae SBR1031(OTU4)、Rokubacteriales(OTU3)和Anaerolineaceae(OTU39)的豐度在LW中顯著高于APF(p<0.05), Acidobacteria subgroup 4(OTU21)、Rokubacteriales(OTU16和OTU7)和Acidobacteria subgroup 6(OTU18)的豐度在APF中顯著高于LW和PF(p<0.05), Ruminococcaceae UCG-002(OTU67)、Leptospirillumsp. Group II ′5-way CG′(OTU8)和Lactobacillusgasseri(OTU34)在3種土地利用中沒(méi)有顯著差異(p<0.05)。由此可見(jiàn), 土地利用改變了古菌優(yōu)勢(shì)OTUs和細(xì)菌優(yōu)勢(shì)OTUs的豐度。

2.4 濕地古菌細(xì)菌之間、古菌內(nèi)部和細(xì)菌內(nèi)部和共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析

選擇會(huì)仙濕地土壤優(yōu)勢(shì)古菌與細(xì)菌OTUs(相對(duì)豐度>0.3%), 用于構(gòu)建古菌細(xì)菌之間群落共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)圖(圖3), 然后進(jìn)一步對(duì)古菌內(nèi)部和細(xì)菌內(nèi)部的網(wǎng)絡(luò)分別進(jìn)行模塊化分析(圖4、圖5)。

土壤古菌細(xì)菌之間群落的相互作用從圖3(不同顏色節(jié)點(diǎn)代表古菌或細(xì)菌不同的門(mén), 節(jié)點(diǎn)上的數(shù)值代表古菌或細(xì)菌的OTU編號(hào), 節(jié)點(diǎn)大小與連接度成正比, 綠色連線(xiàn)表示正相關(guān), 紅色連線(xiàn)表示負(fù)相關(guān), 下同)可以看出, 會(huì)仙濕地土壤中, 古菌細(xì)菌共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)包含了66個(gè)顯著相關(guān)節(jié)點(diǎn), 總的連線(xiàn)有468條(315條為正連線(xiàn), 153條為負(fù)連線(xiàn)), 表明古菌細(xì)菌之間群落的相互促進(jìn)作用大于相互抑制作用。

圖3 古菌細(xì)菌優(yōu)勢(shì)OTUs共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Co-occurance network of archaea-bacteria dominant OTUs

本研究選取連接度排名前3的OTUs為關(guān)鍵類(lèi)群, 這些OTUs是OTU9(Bathyarchaeia)、OTU38(Bathyarchaeia)和OTU2(Nitrososphaeraceae)(連接度為27), OTU39(Anaerolineae)(連接度25), OTU85(Bathyarchaeota)、OTU14(Holophagae subgroup 7)和OTU21(Acidobacteria subgroup 4)(連接度24)。為了研究環(huán)境因子與共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵物種的相關(guān)性, 進(jìn)行了Mantel test分析(表3), 結(jié)果表明, 關(guān)鍵物種與pH極顯著正相關(guān), 與C/N和DOC顯著正相關(guān)。

表3 土壤理化因子與古菌細(xì)菌共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵物種的相關(guān)性Table 3 Correlation between nutrient factors and key taxa in archaeal-bacteria co-occurrence network

從圖4看出, 古菌內(nèi)部群落的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)由18個(gè)節(jié)點(diǎn)和37條連線(xiàn)(31條正相關(guān), 6條負(fù)相關(guān))構(gòu)成。在模塊1中共同出現(xiàn)了隸屬于Bathyarchaeota(OTU85、OTU9、OTU1093、OTU38和OTU155)與Nitrososphaeraceae(OTU2和OTU59)的7個(gè)OTUs, 且這些OTUs之間均呈顯著正相關(guān)關(guān)系, 表明它們之間存在相當(dāng)密切的生態(tài)關(guān)聯(lián)。另外OTU2(Nitrososphaeraceae)、OTU38(Bathyarchaeota)、OTU1093(Bathyarchaeota)、OTU9(Bathyarchaeota)、OTU85(Bathyarchaeota)、OTU231(Bathyarchaeota)和OTU155(Bathyarchaeota)是古菌關(guān)鍵類(lèi)群。MCODE分析古菌相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)得到模塊的網(wǎng)絡(luò)分?jǐn)?shù)分別為6.00和3.33, 并且關(guān)鍵類(lèi)群均出現(xiàn)在了分?jǐn)?shù)高的模塊1中。

圖4 古菌優(yōu)勢(shì)OTUs共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)及模塊Fig.4 Co-occurance network and module of archaea dominant OTUs

從圖5看出, 細(xì)菌共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)由45個(gè)節(jié)點(diǎn)和227條連線(xiàn)組成(149條正相關(guān), 78條負(fù)相關(guān))構(gòu)成。從細(xì)菌內(nèi)部網(wǎng)絡(luò)的模塊1可以看出OTU613 、OTU21和OTU272(Acidobacteria GP4)與OTU52、OTU12、OTU27、OTU66、OTU13、OTU23和OTU188(Chloroflexi)呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系, 說(shuō)明這兩類(lèi)菌可能存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。此外, 除了OTU613、OTU21和OTU272外, 模塊1中的其它微生物之間均呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)關(guān)系, 說(shuō)明這些微生物可能存在共存關(guān)系。而細(xì)菌內(nèi)部共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵類(lèi)群是OTU21(Pyrinomonadaceae RB41)、OTU48(Acidobacteria subgroup 6)和OTU44(Rokubacteria)。MCODE分析古菌相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)得到的子網(wǎng)絡(luò)的網(wǎng)絡(luò)分?jǐn)?shù)分別為10.76和3.00; 模塊1中的互作關(guān)系最為緊密, 且關(guān)鍵類(lèi)群均出現(xiàn)在模塊1中。

圖5 優(yōu)勢(shì)細(xì)菌OTUs共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)圖及模塊Fig.5 Co-occurance network and module of bacteria dominant OTUs

3 討 論

3.1 土地利用方式對(duì)古菌和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響

有研究發(fā)現(xiàn)古菌多樣性在稻田土壤顯著高于稻田撂荒地(表2), 養(yǎng)分含量與古菌數(shù)量和多樣性呈顯著正相關(guān)關(guān)系[16-17]。 在本研究中, 與稻田撂荒地相比, 稻田施肥提高了碳、氮和磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì), 促進(jìn)了古菌的生長(zhǎng)和代謝, 古菌多樣性提高。3種土地利用方式的優(yōu)勢(shì)古菌均為T(mén)haumarchaeota、Bathyarchaeota和Euryarchaeota, 表明濕地系統(tǒng)的微生物群落在門(mén)水平上具有一定的穩(wěn)定性, 這樣有利于保證濕地系統(tǒng)服務(wù)功能的相對(duì)穩(wěn)定。Thaumarchaeota和Bathyarchaeota的古菌相對(duì)豐度在不同土地利用類(lèi)型之間存在差異。稻田撂荒地的最優(yōu)勢(shì)菌門(mén)是Thaumarchaeota, 該門(mén)中檢測(cè)出的微生物均為氨氧化古菌(Candidatusnitrososphaera、Candidatusnitrosotenuis), 這是因?yàn)楸狙芯吭O(shè)計(jì)的撂荒地的pH值較低, 大量氨分子轉(zhuǎn)化為銨根離子, 而氨氧化古菌長(zhǎng)期適應(yīng)低氨環(huán)境, 高效地把環(huán)境中較低濃度的氨分子氧化[18]。Thaumarchaeota喜好低氮和高碳環(huán)境[19], 稻田撂荒地的碳氮比和DOC較高, 為該菌提供了適宜的生長(zhǎng)環(huán)境, 所以稻田撂荒地的Thaumarchaeota豐度較高; 另外, 深古菌門(mén)的豐度也占了較大比例, 這與吳麒等[9]對(duì)會(huì)仙濕地深古菌的豐度較高的研究結(jié)果一致。有研究發(fā)現(xiàn), 該門(mén)的古菌能利用二氧化碳和氫氣作為能源物質(zhì)進(jìn)行自養(yǎng)合成乙酸[20], 同時(shí)還能降解芳香烴和纖維素等有機(jī)化合物進(jìn)行異養(yǎng)代謝產(chǎn)生乙酸, 由此推測(cè)該古菌群落屬于既能自養(yǎng)又能異養(yǎng)的產(chǎn)乙酸菌[21], 因此在土壤有機(jī)質(zhì)的轉(zhuǎn)化中具有重要的作用。該菌為厭氧微生物群落的主要組成部分[22], 湖泊濕地和稻田的厭氧條件為此類(lèi)菌提供適宜的生存環(huán)境, 以至于深古菌豐度高于稻田撂荒地。此外, Euryarchaeota的豐度在3種土地利用方式下沒(méi)有顯著差異, 且該菌門(mén)水平下包含了大量厭氧產(chǎn)甲烷菌, 厭氧產(chǎn)甲烷菌屬于Euryarchaeota, 主要存在濕地、海洋、湖泊沉積物和動(dòng)物糞便等環(huán)境中[23-25]。而本研究區(qū)域附近村民散養(yǎng)的鴨子活動(dòng)較多, 帶入的糞便可能對(duì)該菌豐度提高有促進(jìn)作用。

稻田的細(xì)菌多樣性比湖泊濕地和稻田撂荒地高， 與賈遠(yuǎn)航等[7]對(duì)會(huì)仙濕地的研究結(jié)果基本一致, 表明濕地土壤經(jīng)過(guò)多年的稻作以后, 稻田土壤有機(jī)碳和總氮量逐漸提高, 促進(jìn)了細(xì)菌多樣性的提高, 而撂荒以后稻田土壤養(yǎng)分下降, 細(xì)菌多樣性降低。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn), 3種土地利用方式的優(yōu)勢(shì)菌在門(mén)水平上均為Chloroflexi、Acidobacteria和Proteobacteria。這與文獻(xiàn)[26]報(bào)道的會(huì)仙濕地細(xì)菌群落優(yōu)勢(shì)門(mén)的研究結(jié)果一致， 也與來(lái)自全國(guó)42個(gè)濕地土壤大樣本細(xì)菌的研究結(jié)果一致[27], 說(shuō)明這3個(gè)門(mén)的細(xì)菌群落對(duì)濕地環(huán)境的高度適應(yīng)性, 在濕地土壤生物地球化學(xué)循環(huán)中具有潛在的重要作用, 從而可能維持了濕地土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定。

3.2 濕地古菌細(xì)菌、古菌和細(xì)菌的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析

在自然界中, 微生物群落形成了復(fù)雜的生態(tài)網(wǎng)絡(luò), 基于生態(tài)網(wǎng)絡(luò), 可以推測(cè)物種間的相互作用。處于互利共生、共棲和共聚集等的微生物呈正相關(guān)關(guān)系, 而處于競(jìng)爭(zhēng)、偏害共生和捕食等關(guān)系的微生物為負(fù)相關(guān)[28]。圖2表明, 會(huì)仙濕地的古菌細(xì)菌共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中的正相關(guān)連線(xiàn)多于負(fù)相關(guān)連線(xiàn)， 其原因有: ①在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中, 二者對(duì)氧的需求條件不同。 細(xì)菌大多屬于好氧菌或兼性厭氧菌, 而古菌大多為厭氧菌。二者占據(jù)不同的生態(tài)位, 生態(tài)位之間的互補(bǔ)關(guān)系有利于整個(gè)濕地微生物群落之間的共生。如綠彎菌等類(lèi)群是需氧或兼性厭氧菌, 它們?cè)诜纸庥袡C(jī)物的過(guò)程中消耗了大量的氧氣[29], 降低了土壤中的氧分壓, 從而有利于深古菌等在厭氧環(huán)境中占優(yōu)勢(shì)的古菌的生存[30]。②不同微生物對(duì)有機(jī)化合物(或無(wú)機(jī)物)的利用不同, 如深古菌和變形菌等可以把高分子化合物降解為低分子的有機(jī)物, 這些低分子量的有機(jī)物為酸桿菌等的生長(zhǎng)提供了可利用的碳源[21-31]。因此, 這些微生物群落之間的協(xié)同作用, 共同維護(hù)了濕地生態(tài)系統(tǒng)微生物群落的多樣性, 在濕地土壤的生物地球化學(xué)循環(huán)過(guò)程中協(xié)同發(fā)揮作用, 進(jìn)而維持了濕地生態(tài)系統(tǒng)的功能穩(wěn)定。碳和氮等能源物質(zhì)的減少會(huì)導(dǎo)致微生物之間的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系大于協(xié)同關(guān)系[32-33], 說(shuō)明能源物質(zhì)豐富的環(huán)境有利于微生物的繁殖和物質(zhì)交換, 進(jìn)而減少微生物之間的負(fù)相互作用[34]。關(guān)鍵類(lèi)群是微生物群落里具有高度連接的物種, 這些物種的增加或減少都會(huì)引起整個(gè)生態(tài)網(wǎng)絡(luò)相互作用的變化[35-36]。本文把連接度排名前3的OTUs定義為關(guān)鍵類(lèi)群， 通過(guò)Mantel分析發(fā)現(xiàn), 影響這些關(guān)鍵類(lèi)群的因子是pH、C/N和DOC, 這與古菌和細(xì)菌優(yōu)勢(shì)門(mén)的影響因子一樣, 說(shuō)明這3個(gè)環(huán)境因子不僅影響古菌和細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu), 還影響古菌細(xì)菌的互作關(guān)系及生態(tài)網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定。

進(jìn)一步對(duì)古菌細(xì)菌共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)里的古菌內(nèi)部網(wǎng)絡(luò)(圖3)研究發(fā)現(xiàn), 古菌群落也是相互促進(jìn)作用大于相互抑制作用。深古菌門(mén)與奇古菌門(mén)在節(jié)點(diǎn)、連接度和模塊中占主導(dǎo)地位, 說(shuō)明這兩個(gè)門(mén)的古菌在會(huì)仙濕地古菌所參與的生物地球化學(xué)循環(huán)中可能具有潛在的重要作用。此外, 在模塊1中共同出現(xiàn)了分屬Bathyarchaeota與Nitrososphaeraceae的OTUs, 且這些OTUs之間均呈顯著的正相關(guān)關(guān)系, 表明它們之間相互合作來(lái)共同適應(yīng)濕地環(huán)境。在Nitrososphaeraceae中, 草酰乙酸可促進(jìn)Nitrosotalea的生長(zhǎng), 低濃度的丙酮酸也能夠促進(jìn)NitrososphaeraviennensisEN76的快速生長(zhǎng)，說(shuō)明Nitrososphaeraceae中不同的微生物對(duì)不同有機(jī)物的響應(yīng)不同[37]。 盡管3種土地利用方式下土壤pH、總有機(jī)碳和溶解性有機(jī)碳在不同程度上有所差異, 但這些小分子有機(jī)物與氨氧化古菌之間的關(guān)系值得進(jìn)一步研究。隸屬于深古菌門(mén)的微生物能把高分子有機(jī)化合物芳香烴和纖維素降解為乙酸[21], 這為氨氧化古菌提供了可利用的碳源, 促進(jìn)了氨氧化古菌群落生長(zhǎng), 因此Nitrososphaeraceae的豐度提高。

從細(xì)菌內(nèi)部網(wǎng)絡(luò)的模塊1(圖4)可以看出, Acidobacteria GP4與Chloroflexi之間為顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系, 說(shuō)明這兩類(lèi)細(xì)菌可能生態(tài)位相似, 因而存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。 相似的是, Acidobacteria GP4與Chloroflexi呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系也出現(xiàn)在玉米輪作的土壤中[38], 這是因?yàn)锳cidobacteria GP4等通過(guò)產(chǎn)生抗菌劑或增強(qiáng)了植物內(nèi)生細(xì)菌對(duì)植物病原體的拮抗作用成為益生菌, Chloroflexi不能固定氮, 與植物爭(zhēng)奪氮資源成為病原菌。而植物的發(fā)病機(jī)制是病原菌和益生菌相互競(jìng)爭(zhēng)的過(guò)程[39], 因此, 二者之間的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系可能在一定程度上決定著會(huì)仙巖溶濕地植被的健康程度。此外, 除OTU613 、OTU21和OTU272外, 模塊1中的其他微生物之間均為正相關(guān)關(guān)系， 如Proteobacteria(OTU17)與Acidobacteria GP6(OTU48、OTU58和OTU56)呈顯著正相關(guān)關(guān)系。Proteobacteria的細(xì)菌在有機(jī)物分解過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用, 該類(lèi)菌能利用纖維素酶、幾丁質(zhì)酶和淀粉酶等產(chǎn)生大量低聚糖和芳香醇, 而這些低聚糖和芳香醇可以被Acidobacteria的細(xì)菌作為碳源[31], 表明Proteobacteria與Acidobacteria GP6這兩類(lèi)微生物可能協(xié)同作用, 促進(jìn)了土壤中大分子有機(jī)物的降解。

3.3 濕地系統(tǒng)關(guān)鍵微生物及其對(duì)模塊化的影響

古菌內(nèi)部群落的關(guān)鍵類(lèi)群是隸屬于Bathyarchaeota和Nitrososphaeraceae的7個(gè)OTUs, 細(xì)菌內(nèi)部群落共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵類(lèi)群隸屬于Pyrinomonadaceae、Acidobacteria subgroup 6和Methylomirabilaceae的3個(gè)OTUs。這些關(guān)鍵類(lèi)群對(duì)于維持會(huì)仙濕地微生物生態(tài)網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定具有重要作用。另外, 本文研究發(fā)現(xiàn)古菌內(nèi)部和細(xì)菌內(nèi)部的關(guān)鍵類(lèi)群均出現(xiàn)在各自得分較高的模塊中, 這與馬泊泊等[40]的關(guān)鍵類(lèi)群出現(xiàn)在得分較高的模塊中的結(jié)論一致。這是因?yàn)槲⑸锏木奂且怨δ軟Q定的, 關(guān)鍵類(lèi)群在決定微生物群落功能上也有重要作用, 因此功能微生物之間共存網(wǎng)絡(luò)值得進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

(1)會(huì)仙濕地系統(tǒng)土壤的優(yōu)勢(shì)古菌門(mén)為T(mén)haumarchaeota、Bathyarchaeota和Euryarchaeota, 但Thaumarchaeota在稻田撂荒地豐度較高, Bathyarchaeota在湖泊濕地豐度較高。另外, 濕地系統(tǒng)土壤的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)為Chloroflexi、Acidobacteria和Proteobacteria。影響古菌群落的主要環(huán)境因子是pH、C/N和DOC。

(2)關(guān)鍵的古菌隸屬于Bathyarchaeota和Nitrososphaeraceae, 關(guān)鍵的細(xì)菌隸屬于Pyrinomonadaceae、Acidobacteria subgroup 6和Rokubacteria, 影響古菌細(xì)菌之間相互作用的關(guān)鍵微生物隸屬于Bathyarchaeota、Nitrososphaeraceae、Anaerolineaceae、Holophagae Subgroup 7和Pyrinomonadaceae。

(3)古菌細(xì)菌、古菌和細(xì)菌的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)均表明古菌細(xì)菌、古菌和細(xì)菌的相互促進(jìn)作用大于相互抑制作用。影響古菌細(xì)菌共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵類(lèi)群的主要環(huán)境因子是pH、C/N和DOC。