會仙巖溶濕地古菌和細菌群落的共現(xiàn)性

程躍揚, 靳振江, 袁 武, 賈遠航, 梁錦桃, 邱江梅,潘復(fù)靜, 劉德深

(桂林理工大學(xué) a.環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院; b.巖溶地區(qū)水污染控制與用水安全保障協(xié)同創(chuàng)新中心;c.廣西環(huán)境污染控制理論與技術(shù)重點實驗室, 廣西 桂林 541006)

0 引 言

土壤微生物參與濕地系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán), 對維持濕地生態(tài)系統(tǒng)具有重要作用[1]。古菌和細菌均為土壤中廣泛分布的兩大微生物類群, 二者的群落結(jié)構(gòu)均受到多種因素的影響, 其中, 土地利用變化帶來植被、管理和土壤理化因子等的變化，都會影響到二者的群落結(jié)構(gòu), 進而對土壤中的物質(zhì)循環(huán)產(chǎn)生影響[2]。在濕地生態(tài)系統(tǒng)中, 古菌、細菌群落以及古菌細菌之間存在復(fù)雜的相互作用, 在決定生態(tài)系統(tǒng)功能方面起著至關(guān)重要的作用。高通量測序技術(shù)結(jié)合共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析方法能夠為研究生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)部微生物之間的相互作用提供新的思路。目前, 對濕地微生物之間共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的研究主要集中在近岸海洋線蟲與細菌和古菌[3]、貝加爾湖細菌與真核微生物[4]以及太湖細菌[5]等方面, 這些研究總體上揭示了不同濕地類型不同微生物群落之間的相互作用, 以及微生物在這些生態(tài)系統(tǒng)中生物地球化學(xué)循環(huán)中的潛在重要作用。

桂林會仙濕地是我國最大的低海拔巖溶濕地[6]。會仙濕地不同土地利用和植物根際細菌群落的豐度和多樣性[7-8]及會仙濕地沉積物中甲烷菌的群落結(jié)構(gòu)[9]已有報道, 這些研究表明會仙濕地中細菌和甲烷菌具有較高的多樣性。但是, 相比于微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性, 探究微生物之間的相互作用對了解生態(tài)系統(tǒng)功能更重要, 因此, 需要進一步去探索會仙濕地土壤微生物之間的相互關(guān)系。

本文以會仙濕地的湖泊濕地、稻田和稻田撂荒地土壤為研究對象, 以16S rRNA基因的515F和806R為通用引物[10-11], 利用高通量測序方法, 采用共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)來分析細菌群落、古菌群落以及二者之間的共現(xiàn)性, 探究微生物之間的相互作用和共存機制, 以及共存微生物在濕地土壤生物地球化學(xué)循環(huán)中的重要作用, 更好地理解會仙濕地系統(tǒng)的運行規(guī)律, 為會仙濕地的保護提供科學(xué)的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣點概況與樣品采集

采樣點位于廣西桂林市西南方向30 km的臨桂縣會仙鎮(zhèn)馮家村， 地處亞熱帶季風(fēng)區(qū), 年平均氣溫18.8 ℃、降雨量1 915.2 mm, 地理坐標為25°01′30″—25°11′15″N, 110°08′15″—110°18′00″E, 采樣區(qū)域內(nèi)主要植被有蘆葦(Phragmitescommunis)和華科拉莎草(Cladiumchinense)等[12]。近年來, 由于人為墾殖和破壞(很大部分被開發(fā)為農(nóng)業(yè)用地, 還有一些是經(jīng)過長期耕作后的撂荒地), 巖溶濕地現(xiàn)存面積僅24 km2[13], 2018年7月, 在會仙濕地巖溶試驗場選取湖泊濕地(優(yōu)勢植被為雙穗雀稗草Paspaiumdistichum)、稻田(水稻處于結(jié)實期)和稻田撂荒地(優(yōu)勢植被為稗草Echinochloacrusgalli)3種土地利用方式的樣地, 在每個樣地隨機取3個采樣點混合為一個樣本, 共采集到9個樣本。 樣本土壤采集深度為0～20 cm, 去除植物根系和碎石等雜物, 一部分自然風(fēng)干后研磨，分別過 0.85、0.25和0.15 mm篩, 常溫存儲用于測定理化性質(zhì); 另一部分置于-80 ℃冰箱暫時冷藏, 用來提取土壤微生物的DNA。

1.2 土壤養(yǎng)分測定

土壤養(yǎng)分測定方法參照文獻[14]進行, 其中土壤pH值的測定采用蒸餾水(無CO2)作為浸提劑, 水土比2.5∶1, 混勻后用pH計(型號: IS128C)測量; 土壤有機碳(SOC)測定采用濃硫酸重鉻酸鉀外加熱法; 土壤全氮(TN)采用濃H2SO4消煮凱氏定氮法; 堿解氮(AN)采用堿解擴散法測定; 總磷(TP)采用碳酸鈉熔融法; 速效磷(AP)采用鹽酸氟化銨法； 可溶性有機碳(DOC)采用水土振蕩提取法。土壤養(yǎng)分含量見表1。

表1 3種土地利用方式土壤的養(yǎng)分含量Table 1 Soil nutrient content in three types of land-use

1.3 土壤DNA提取與高通量測序

用DNA快速提取試劑盒(Power Soil, QIGEN公司)提取土壤的DNA, 提取步驟參照說明書, 使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA。選取引物序列515F(5′-GTG YCA GCM GCC GCG GTA A-3′)和806R(5′-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3′)為通用測序引物對古菌和細菌的16S rDNA V4區(qū)域進行擴增。PCR(Applied Biosystems? Gene Amp? PCR System 9700)擴增程序包括起始 94 ℃ 、1 min, 然后變性設(shè)置為94 ℃、20 s, 退火設(shè)置為54 ℃、30 s, 延伸設(shè)置為72 ℃、30 s, 并將變性、退火和延伸進行30次循環(huán), 最后為72 ℃ 、5 min。將PCR產(chǎn)物與loading buffer 混合, 使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 膠回收試劑盒QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)回收PCR產(chǎn)物, 利用Qubit@2.0 Fluorometer (Thermo Scientific)進行定量, 最后等物質(zhì)的量混合樣本。回收的DNA送到成都羅寧生物科技有限公司, 使用羅寧生物的Hiseq 2500平臺PE250模式測序。

得到原始數(shù)據(jù)后使用Trimmomatic進行質(zhì)量控制, 再使用Uchime 算法去除嵌合體后得到有效數(shù)據(jù)。使用UPARSE 算法在97%的一致性對所有OUT進行劃分并挑選出代表序列, 使用UCLUST分類法與 SILVA 數(shù)據(jù)庫對OTU進行不同分類水平的注釋。利用α多樣性指數(shù)(包括Chao1、ACE、Shannon、Simpson指數(shù))表征古菌和細菌群落的豐富度和多樣性。其中, Chao1和ACE指數(shù)用來表征微生物豐富度, Shannon和Simpson指數(shù)用來表征微生物群落多樣性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本研究用Excel 2010對實驗數(shù)據(jù)進行初步處理, 用SPSS 24.0軟件對α多樣性指數(shù)、門水平豐度進行方差分析, Duncan法用于不同土地利用方式的顯著性檢驗, 顯著性水平為p<0.05, 門水平豐度與環(huán)境因子的相關(guān)性用Pearson法; 利用 Origin 2017繪制古菌和細菌群落在門水平上的相對豐度圖; 使用Cytoscape 3.7.0 軟件中的CoNet插件構(gòu)建古菌細菌共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)圖, 具體操作方法參考顧靜馨等[15]提供的步驟, 使用分子復(fù)合物檢測算法(MCODE)聚類。使用MCODE插件對網(wǎng)絡(luò)進行模塊分析, 所有參數(shù)都采用標準值。利用 Network Analyzer 工具, 獲取網(wǎng)絡(luò)的連接度、節(jié)點數(shù)和連接數(shù)。在PASSaGE軟件中采用 Mantel分析土壤理化因子對共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵物種的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同土地利用方式下古菌和細菌多樣性

表2列出了3種土地利用方式下的古菌和細菌多樣性指數(shù), 可以看出, 稻田撂荒地細菌和古菌的Chao1和ACE指數(shù)均低于其他兩種土地利用方式, 古菌的Shannon和Simpson指數(shù)均為湖泊濕地>稻田>稻田撂荒地; 細菌的Shannon和Simpson指數(shù)均為稻田>湖泊濕地>稻田撂荒地, 表明土地利用改變了古菌和細菌的多樣性。

表2 3種土地利用方式下的古菌和細菌α多樣性指數(shù)Table 2 Archaea and bacterial α diversity index in three types of land-use

2.2 不同土地利用方式下古菌和細菌群落特征及與養(yǎng)分含量的相關(guān)性

本研究中所得到的古菌序列歸屬于5個古菌門, 其中, 奇古菌門(Thaumarchaeota)、深古菌門(Bathyarchaeota)和廣古菌門(Euryarchaeota)這3個門占總古菌門的99.33%～99.93%(圖1a), 奇古菌門和深古菌門的豐度在湖泊濕地、稻田、稻田撂荒地的土壤中差異顯著, 分別為68.71%、73.26%、89.71%和23.02%、19.79%、3.67%, Euryarchaeota在3種土地利用方式土壤中的豐度沒有顯著差異。另外, 本研究所得到的細菌序列歸屬于39個菌門, 其中, 綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、Rokubacteria、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、浮游霉菌(Planctomycetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、Latescibacteria、芽單胞菌門(Gemmatimatimonadetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、放線菌門(Actinobacteria)、Epsilonbacteraeota是相對豐度大于1%的細菌門類(圖1b), 占細菌總門的96.73%～98.60%。

圖1 3種土地利用方式古菌(a)和細菌優(yōu)勢門(b)水平相對豐度Fig.1 Relative abundance of dominant phylun levels of archaea(a) and bacteria(b) in three types of land-use

圖2a可以看出, Thaumarchaeota與pH極顯著負相關(guān), 與C/N和DOC顯著正相關(guān); Bathyarchaeota與pH顯著正相關(guān), 與C/N顯著負相關(guān), 與DOC極顯著負相關(guān); 圖2b可以看出, pH與Chloroflexi、Proteobacteria、Nitrospirae和Planctomycetes顯著正相關(guān), 與Acidobacteria、Bacteroidetes和Actinobacteria顯著負相關(guān); C/N與Rokubacteria、Latescibacteria和Actinobacteria顯著正相關(guān)。DOC與Acidobacteria、Bacteroidetes和Actinobacteria顯著正相關(guān), 與Chloroflexi、Proteobacteria、Nitrospirae顯著負相關(guān)。

圖2 養(yǎng)分因子與古菌、細菌群落之間的相關(guān)性熱圖Fig.2 Heat maps of correlation of nutrient factors with archaea and bacterial communities

2.3 濕地古菌和細菌優(yōu)勢OTUs組成特征

在本研究中, 古菌優(yōu)勢OTUs(相對豐度>0.3%)包括Bathyarchaeota(OTU9、OTU38、OTU85、OTU1093、OTU49、OTU155和OTU231)、Thermoplasmataceae

(熱原體科, OTU55、OTU45、OTU227和OTU93)、Ferroplasmaacidarmanusfer1(OTU131)、Methanomassiliicoccales(OTU179)、Methanobacterium(甲烷桿菌屬, OTU415)、Methanobrevibactersp. YE315(甲烷桿菌, OTU219)、CandidatusNitrososphaera(OTU240和OTU11)、Nitrosotaleaceae(OTU5)、Nitrososphaeraceae(OTU1、OTU2、OTU2323、OTU204、OTU59和OTU911)。單因素方差分析表明, 排名前10的OUTs中, Nitrososphaeraceae(OTU1和OTU2323)的豐度在3種土地利用方式中有顯著差異, 呈現(xiàn)為APF>PF>LW(p<0.05), Nitrososphaeraceae(OTU9、OTU2、OTU38、OTU85、OTU1093)的豐度在PF中顯著高于APF(p<0.05), CandidatusNitrososphaera(OTU11)的豐度在LW顯著高于PF和APF(p<0.05), Thermoplasmataceae(OTU55)和Nitrososphaeraceae(OTU204)的豐度在3種土地利用中沒有顯著差異(p<0.05)。

細菌優(yōu)勢OTUs(相對豐度>0.3%)包括Acidobacteria subgroup 6(酸桿菌門GP6, OTU18、OTU68、OTU116、OTU41、OTU58、OTU28、OTU78、OTU180、OTU48、OTU56和OTU345)、Acidobacteria subgroup 4(酸桿菌門GP4, OTU21、OTU613和OTU272)、Holophagae subgroup 7(全噬菌綱GP7, OTU14)、Anaerolineae SBR1031(厭氧繩菌綱, OTU4、OTU12、OTU20、OTU15、OTU22、OTU36)、Anaerolineaceae(厭氧繩菌科, OTU 39、OTU27和OTU52)、Roseiflexaceae(OTU10和OTU30)、Dehalococcoidia(脫鹵球菌綱, OTU13)、Chloroflexi(OTU23、OTU66和OTU188)、Helicobactersp. MIT 99-5507(幽門螺桿菌, OTU47)、Ruminococcaceae UCG-002(瘤胃球菌科, OTU67)、Ruminococcaceae UCG-005(OTU230)、Lactobacillusgasseri(格氏乳桿菌, OTU34)、Lactobacillusacidophilus(嗜酸乳桿菌, OTU94)、Lactobacillusmurinus(鼠乳桿菌, OTU69)、Bacteria(OTU54)、Latescibacteria(OTU114)、Leptospirillumsp. Group II ′5-way CG′(OTU8)、Leptospirillumsp. Group II ′C75′(OTU19)、Deltaproteobacteria MBNT15(δ變形菌, OTU24)、AcidiphiliummultivorumAIU301(OTU17)、Neisseriasp. 104(2012)(奈瑟菌, OTU40)、Thauerasp. SWB20(索氏菌, OTU75)、Escherichia-Shigella(大腸桿菌志賀氏菌, OTU185)、Rokubacteria(棒狀桿菌門)(OTU44、OTU16、OTU7、OTU25、OTU3和OTU63)、Spirochaetaceae GWE2-31-10(螺旋體科, OTU120)、Candidatus udaeobacter(OTU111)。單因素方差分析表明, 排名前10的OUTs中, Anaerolineae SBR1031(OTU4)、Rokubacteriales(OTU3)和Anaerolineaceae(OTU39)的豐度在LW中顯著高于APF(p<0.05), Acidobacteria subgroup 4(OTU21)、Rokubacteriales(OTU16和OTU7)和Acidobacteria subgroup 6(OTU18)的豐度在APF中顯著高于LW和PF(p<0.05), Ruminococcaceae UCG-002(OTU67)、Leptospirillumsp. Group II ′5-way CG′(OTU8)和Lactobacillusgasseri(OTU34)在3種土地利用中沒有顯著差異(p<0.05)。由此可見, 土地利用改變了古菌優(yōu)勢OTUs和細菌優(yōu)勢OTUs的豐度。

2.4 濕地古菌細菌之間、古菌內(nèi)部和細菌內(nèi)部和共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析

選擇會仙濕地土壤優(yōu)勢古菌與細菌OTUs(相對豐度>0.3%), 用于構(gòu)建古菌細菌之間群落共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)圖(圖3), 然后進一步對古菌內(nèi)部和細菌內(nèi)部的網(wǎng)絡(luò)分別進行模塊化分析(圖4、圖5)。

土壤古菌細菌之間群落的相互作用從圖3(不同顏色節(jié)點代表古菌或細菌不同的門, 節(jié)點上的數(shù)值代表古菌或細菌的OTU編號, 節(jié)點大小與連接度成正比, 綠色連線表示正相關(guān), 紅色連線表示負相關(guān), 下同)可以看出, 會仙濕地土壤中, 古菌細菌共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)包含了66個顯著相關(guān)節(jié)點, 總的連線有468條(315條為正連線, 153條為負連線), 表明古菌細菌之間群落的相互促進作用大于相互抑制作用。

圖3 古菌細菌優(yōu)勢OTUs共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Co-occurance network of archaea-bacteria dominant OTUs

本研究選取連接度排名前3的OTUs為關(guān)鍵類群, 這些OTUs是OTU9(Bathyarchaeia)、OTU38(Bathyarchaeia)和OTU2(Nitrososphaeraceae)(連接度為27), OTU39(Anaerolineae)(連接度25), OTU85(Bathyarchaeota)、OTU14(Holophagae subgroup 7)和OTU21(Acidobacteria subgroup 4)(連接度24)。為了研究環(huán)境因子與共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵物種的相關(guān)性, 進行了Mantel test分析(表3), 結(jié)果表明, 關(guān)鍵物種與pH極顯著正相關(guān), 與C/N和DOC顯著正相關(guān)。

表3 土壤理化因子與古菌細菌共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵物種的相關(guān)性Table 3 Correlation between nutrient factors and key taxa in archaeal-bacteria co-occurrence network

從圖4看出, 古菌內(nèi)部群落的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)由18個節(jié)點和37條連線(31條正相關(guān), 6條負相關(guān))構(gòu)成。在模塊1中共同出現(xiàn)了隸屬于Bathyarchaeota(OTU85、OTU9、OTU1093、OTU38和OTU155)與Nitrososphaeraceae(OTU2和OTU59)的7個OTUs, 且這些OTUs之間均呈顯著正相關(guān)關(guān)系, 表明它們之間存在相當密切的生態(tài)關(guān)聯(lián)。另外OTU2(Nitrososphaeraceae)、OTU38(Bathyarchaeota)、OTU1093(Bathyarchaeota)、OTU9(Bathyarchaeota)、OTU85(Bathyarchaeota)、OTU231(Bathyarchaeota)和OTU155(Bathyarchaeota)是古菌關(guān)鍵類群。MCODE分析古菌相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)得到模塊的網(wǎng)絡(luò)分數(shù)分別為6.00和3.33, 并且關(guān)鍵類群均出現(xiàn)在了分數(shù)高的模塊1中。

圖4 古菌優(yōu)勢OTUs共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)及模塊Fig.4 Co-occurance network and module of archaea dominant OTUs

從圖5看出, 細菌共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)由45個節(jié)點和227條連線組成(149條正相關(guān), 78條負相關(guān))構(gòu)成。從細菌內(nèi)部網(wǎng)絡(luò)的模塊1可以看出OTU613 、OTU21和OTU272(Acidobacteria GP4)與OTU52、OTU12、OTU27、OTU66、OTU13、OTU23和OTU188(Chloroflexi)呈顯著的負相關(guān)關(guān)系, 說明這兩類菌可能存在競爭關(guān)系。此外, 除了OTU613、OTU21和OTU272外, 模塊1中的其它微生物之間均呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)關(guān)系, 說明這些微生物可能存在共存關(guān)系。而細菌內(nèi)部共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵類群是OTU21(Pyrinomonadaceae RB41)、OTU48(Acidobacteria subgroup 6)和OTU44(Rokubacteria)。MCODE分析古菌相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)得到的子網(wǎng)絡(luò)的網(wǎng)絡(luò)分數(shù)分別為10.76和3.00; 模塊1中的互作關(guān)系最為緊密, 且關(guān)鍵類群均出現(xiàn)在模塊1中。

圖5 優(yōu)勢細菌OTUs共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)圖及模塊Fig.5 Co-occurance network and module of bacteria dominant OTUs

3 討 論

3.1 土地利用方式對古菌和細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響

有研究發(fā)現(xiàn)古菌多樣性在稻田土壤顯著高于稻田撂荒地(表2), 養(yǎng)分含量與古菌數(shù)量和多樣性呈顯著正相關(guān)關(guān)系[16-17]。 在本研究中, 與稻田撂荒地相比, 稻田施肥提高了碳、氮和磷等營養(yǎng)物質(zhì), 促進了古菌的生長和代謝, 古菌多樣性提高。3種土地利用方式的優(yōu)勢古菌均為Thaumarchaeota、Bathyarchaeota和Euryarchaeota, 表明濕地系統(tǒng)的微生物群落在門水平上具有一定的穩(wěn)定性, 這樣有利于保證濕地系統(tǒng)服務(wù)功能的相對穩(wěn)定。Thaumarchaeota和Bathyarchaeota的古菌相對豐度在不同土地利用類型之間存在差異。稻田撂荒地的最優(yōu)勢菌門是Thaumarchaeota, 該門中檢測出的微生物均為氨氧化古菌(Candidatusnitrososphaera、Candidatusnitrosotenuis), 這是因為本研究設(shè)計的撂荒地的pH值較低, 大量氨分子轉(zhuǎn)化為銨根離子, 而氨氧化古菌長期適應(yīng)低氨環(huán)境, 高效地把環(huán)境中較低濃度的氨分子氧化[18]。Thaumarchaeota喜好低氮和高碳環(huán)境[19], 稻田撂荒地的碳氮比和DOC較高, 為該菌提供了適宜的生長環(huán)境, 所以稻田撂荒地的Thaumarchaeota豐度較高; 另外, 深古菌門的豐度也占了較大比例, 這與吳麒等[9]對會仙濕地深古菌的豐度較高的研究結(jié)果一致。有研究發(fā)現(xiàn), 該門的古菌能利用二氧化碳和氫氣作為能源物質(zhì)進行自養(yǎng)合成乙酸[20], 同時還能降解芳香烴和纖維素等有機化合物進行異養(yǎng)代謝產(chǎn)生乙酸, 由此推測該古菌群落屬于既能自養(yǎng)又能異養(yǎng)的產(chǎn)乙酸菌[21], 因此在土壤有機質(zhì)的轉(zhuǎn)化中具有重要的作用。該菌為厭氧微生物群落的主要組成部分[22], 湖泊濕地和稻田的厭氧條件為此類菌提供適宜的生存環(huán)境, 以至于深古菌豐度高于稻田撂荒地。此外, Euryarchaeota的豐度在3種土地利用方式下沒有顯著差異, 且該菌門水平下包含了大量厭氧產(chǎn)甲烷菌, 厭氧產(chǎn)甲烷菌屬于Euryarchaeota, 主要存在濕地、海洋、湖泊沉積物和動物糞便等環(huán)境中[23-25]。而本研究區(qū)域附近村民散養(yǎng)的鴨子活動較多, 帶入的糞便可能對該菌豐度提高有促進作用。

稻田的細菌多樣性比湖泊濕地和稻田撂荒地高， 與賈遠航等[7]對會仙濕地的研究結(jié)果基本一致, 表明濕地土壤經(jīng)過多年的稻作以后, 稻田土壤有機碳和總氮量逐漸提高, 促進了細菌多樣性的提高, 而撂荒以后稻田土壤養(yǎng)分下降, 細菌多樣性降低。進一步分析發(fā)現(xiàn), 3種土地利用方式的優(yōu)勢菌在門水平上均為Chloroflexi、Acidobacteria和Proteobacteria。這與文獻[26]報道的會仙濕地細菌群落優(yōu)勢門的研究結(jié)果一致， 也與來自全國42個濕地土壤大樣本細菌的研究結(jié)果一致[27], 說明這3個門的細菌群落對濕地環(huán)境的高度適應(yīng)性, 在濕地土壤生物地球化學(xué)循環(huán)中具有潛在的重要作用, 從而可能維持了濕地土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定。

3.2 濕地古菌細菌、古菌和細菌的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析

在自然界中, 微生物群落形成了復(fù)雜的生態(tài)網(wǎng)絡(luò), 基于生態(tài)網(wǎng)絡(luò), 可以推測物種間的相互作用。處于互利共生、共棲和共聚集等的微生物呈正相關(guān)關(guān)系, 而處于競爭、偏害共生和捕食等關(guān)系的微生物為負相關(guān)[28]。圖2表明, 會仙濕地的古菌細菌共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中的正相關(guān)連線多于負相關(guān)連線， 其原因有: ①在長期的進化過程中, 二者對氧的需求條件不同。 細菌大多屬于好氧菌或兼性厭氧菌, 而古菌大多為厭氧菌。二者占據(jù)不同的生態(tài)位, 生態(tài)位之間的互補關(guān)系有利于整個濕地微生物群落之間的共生。如綠彎菌等類群是需氧或兼性厭氧菌, 它們在分解有機物的過程中消耗了大量的氧氣[29], 降低了土壤中的氧分壓, 從而有利于深古菌等在厭氧環(huán)境中占優(yōu)勢的古菌的生存[30]。②不同微生物對有機化合物(或無機物)的利用不同, 如深古菌和變形菌等可以把高分子化合物降解為低分子的有機物, 這些低分子量的有機物為酸桿菌等的生長提供了可利用的碳源[21-31]。因此, 這些微生物群落之間的協(xié)同作用, 共同維護了濕地生態(tài)系統(tǒng)微生物群落的多樣性, 在濕地土壤的生物地球化學(xué)循環(huán)過程中協(xié)同發(fā)揮作用, 進而維持了濕地生態(tài)系統(tǒng)的功能穩(wěn)定。碳和氮等能源物質(zhì)的減少會導(dǎo)致微生物之間的競爭關(guān)系大于協(xié)同關(guān)系[32-33], 說明能源物質(zhì)豐富的環(huán)境有利于微生物的繁殖和物質(zhì)交換, 進而減少微生物之間的負相互作用[34]。關(guān)鍵類群是微生物群落里具有高度連接的物種, 這些物種的增加或減少都會引起整個生態(tài)網(wǎng)絡(luò)相互作用的變化[35-36]。本文把連接度排名前3的OTUs定義為關(guān)鍵類群， 通過Mantel分析發(fā)現(xiàn), 影響這些關(guān)鍵類群的因子是pH、C/N和DOC, 這與古菌和細菌優(yōu)勢門的影響因子一樣, 說明這3個環(huán)境因子不僅影響古菌和細菌的群落結(jié)構(gòu), 還影響古菌細菌的互作關(guān)系及生態(tài)網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定。

進一步對古菌細菌共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)里的古菌內(nèi)部網(wǎng)絡(luò)(圖3)研究發(fā)現(xiàn), 古菌群落也是相互促進作用大于相互抑制作用。深古菌門與奇古菌門在節(jié)點、連接度和模塊中占主導(dǎo)地位, 說明這兩個門的古菌在會仙濕地古菌所參與的生物地球化學(xué)循環(huán)中可能具有潛在的重要作用。此外, 在模塊1中共同出現(xiàn)了分屬Bathyarchaeota與Nitrososphaeraceae的OTUs, 且這些OTUs之間均呈顯著的正相關(guān)關(guān)系, 表明它們之間相互合作來共同適應(yīng)濕地環(huán)境。在Nitrososphaeraceae中, 草酰乙酸可促進Nitrosotalea的生長, 低濃度的丙酮酸也能夠促進NitrososphaeraviennensisEN76的快速生長，說明Nitrososphaeraceae中不同的微生物對不同有機物的響應(yīng)不同[37]。 盡管3種土地利用方式下土壤pH、總有機碳和溶解性有機碳在不同程度上有所差異, 但這些小分子有機物與氨氧化古菌之間的關(guān)系值得進一步研究。隸屬于深古菌門的微生物能把高分子有機化合物芳香烴和纖維素降解為乙酸[21], 這為氨氧化古菌提供了可利用的碳源, 促進了氨氧化古菌群落生長, 因此Nitrososphaeraceae的豐度提高。

從細菌內(nèi)部網(wǎng)絡(luò)的模塊1(圖4)可以看出, Acidobacteria GP4與Chloroflexi之間為顯著的負相關(guān)關(guān)系, 說明這兩類細菌可能生態(tài)位相似, 因而存在競爭關(guān)系。 相似的是, Acidobacteria GP4與Chloroflexi呈顯著的負相關(guān)關(guān)系也出現(xiàn)在玉米輪作的土壤中[38], 這是因為Acidobacteria GP4等通過產(chǎn)生抗菌劑或增強了植物內(nèi)生細菌對植物病原體的拮抗作用成為益生菌, Chloroflexi不能固定氮, 與植物爭奪氮資源成為病原菌。而植物的發(fā)病機制是病原菌和益生菌相互競爭的過程[39], 因此, 二者之間的競爭關(guān)系可能在一定程度上決定著會仙巖溶濕地植被的健康程度。此外, 除OTU613 、OTU21和OTU272外, 模塊1中的其他微生物之間均為正相關(guān)關(guān)系， 如Proteobacteria(OTU17)與Acidobacteria GP6(OTU48、OTU58和OTU56)呈顯著正相關(guān)關(guān)系。Proteobacteria的細菌在有機物分解過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用, 該類菌能利用纖維素酶、幾丁質(zhì)酶和淀粉酶等產(chǎn)生大量低聚糖和芳香醇, 而這些低聚糖和芳香醇可以被Acidobacteria的細菌作為碳源[31], 表明Proteobacteria與Acidobacteria GP6這兩類微生物可能協(xié)同作用, 促進了土壤中大分子有機物的降解。

3.3 濕地系統(tǒng)關(guān)鍵微生物及其對模塊化的影響

古菌內(nèi)部群落的關(guān)鍵類群是隸屬于Bathyarchaeota和Nitrososphaeraceae的7個OTUs, 細菌內(nèi)部群落共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵類群隸屬于Pyrinomonadaceae、Acidobacteria subgroup 6和Methylomirabilaceae的3個OTUs。這些關(guān)鍵類群對于維持會仙濕地微生物生態(tài)網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定具有重要作用。另外, 本文研究發(fā)現(xiàn)古菌內(nèi)部和細菌內(nèi)部的關(guān)鍵類群均出現(xiàn)在各自得分較高的模塊中, 這與馬泊泊等[40]的關(guān)鍵類群出現(xiàn)在得分較高的模塊中的結(jié)論一致。這是因為微生物的聚集是以功能決定的, 關(guān)鍵類群在決定微生物群落功能上也有重要作用, 因此功能微生物之間共存網(wǎng)絡(luò)值得進一步研究。

4 結(jié) 論

(1)會仙濕地系統(tǒng)土壤的優(yōu)勢古菌門為Thaumarchaeota、Bathyarchaeota和Euryarchaeota, 但Thaumarchaeota在稻田撂荒地豐度較高, Bathyarchaeota在湖泊濕地豐度較高。另外, 濕地系統(tǒng)土壤的優(yōu)勢細菌門為Chloroflexi、Acidobacteria和Proteobacteria。影響古菌群落的主要環(huán)境因子是pH、C/N和DOC。

(2)關(guān)鍵的古菌隸屬于Bathyarchaeota和Nitrososphaeraceae, 關(guān)鍵的細菌隸屬于Pyrinomonadaceae、Acidobacteria subgroup 6和Rokubacteria, 影響古菌細菌之間相互作用的關(guān)鍵微生物隸屬于Bathyarchaeota、Nitrososphaeraceae、Anaerolineaceae、Holophagae Subgroup 7和Pyrinomonadaceae。

(3)古菌細菌、古菌和細菌的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)均表明古菌細菌、古菌和細菌的相互促進作用大于相互抑制作用。影響古菌細菌共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵類群的主要環(huán)境因子是pH、C/N和DOC。