SPE-HPLC-MS/MS法檢測(cè)動(dòng)物源性運(yùn)動(dòng)食品中喹乙醇及卡巴氧代謝物殘留

徐永麗

（鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校體育教育部，河南 鄭州 450064）

喹乙醇、卡巴氧屬于喹惡啉抗菌藥，因其能夠促進(jìn)畜禽的生長，提高瘦肉率，曾在養(yǎng)殖業(yè)中廣泛應(yīng)用[1-2]。但動(dòng)物基體對(duì)于喹乙醇、卡巴氧有蓄積作用，并且會(huì)引起動(dòng)物產(chǎn)生畸形，人體食用殘留此類藥物的動(dòng)物后也會(huì)造成危害，因此許多國家將喹乙醇及卡巴氧列為禁用藥物[3-5]。但由于該類藥物價(jià)格低廉、應(yīng)用方便，養(yǎng)殖業(yè)仍有違規(guī)添加及超劑量添加的現(xiàn)象存在。動(dòng)物源性運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)品是指以畜禽類的動(dòng)物源性原料制成的針對(duì)運(yùn)動(dòng)人群開發(fā)的一類補(bǔ)充蛋白質(zhì)的食品。因其是針對(duì)特殊人群食用的一種食品，具有一定的特殊性，對(duì)食品的安全性要求高，所以更需要對(duì)這類產(chǎn)品中喹乙醇及卡巴氧代謝物的殘留情況進(jìn)行檢測(cè)和監(jiān)控。

因喹乙醇和卡巴氧原藥在動(dòng)物體內(nèi)代謝迅速，能產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，喹乙醇的主要代謝產(chǎn)物為3-甲基-喹喔啉-2-羧酸（3-methyl-quinoxaline-2-carboxy，MQCA），卡巴氧的主要代謝產(chǎn)物為喹惡啉-2-羧酸（quinoxaline-2-carboxylic acid，QCA），兩者在動(dòng)物體內(nèi)殘留量相對(duì)穩(wěn)定，因此一般將MQCA及QCA分別作為喹乙醇及卡巴氧的殘留標(biāo)示物[6-7]。目前對(duì)MQCA及QCA常用的檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜法和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[8-12]。動(dòng)物源性運(yùn)動(dòng)食品中基質(zhì)復(fù)雜，酶聯(lián)免疫法易出現(xiàn)假陽性；高效液相色譜法檢出限較高，基質(zhì)干嚴(yán)重，前處理復(fù)雜；而高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法抗干擾能力和定性能力較強(qiáng)，可以在降低檢出限的同時(shí)避免假陽性的產(chǎn)生。目前檢測(cè)MQCA及QCA的樣品對(duì)象多局限在豬肉、雞肉、雞蛋等[13-17]。為了使檢測(cè)方法更加適合動(dòng)物源性運(yùn)動(dòng)食品的特性，本研究對(duì)前處理方法進(jìn)行了改進(jìn)，擬采用堿水解的前處理方式提取目標(biāo)物，并優(yōu)化固相萃取柱法凈化提取液，建立動(dòng)物源性運(yùn)動(dòng)食品中MQCA及QCA的固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（solid phase extraction-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，SPE-HPLC-MS/MS）檢測(cè)方法，以期為檢測(cè)和監(jiān)管運(yùn)動(dòng)食品中喹乙醇及卡巴氧代謝物殘留提供技術(shù)保障和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MQCA標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%）、QCA標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%）：中國計(jì)量科學(xué)研究院；動(dòng)物源性運(yùn)動(dòng)食品：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1120型高效液相色譜儀：美國Agilent公司；API 3500 QTrap 超高壓液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國AB公司；Waters Atalantis T3色譜柱（2.1 mm×50 mm，3 μm）、Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）：美國Waters公司；HLB固相萃取柱（60 mg/3 mL）、C18固相萃取柱（60mg/3mL）、PAX固相萃取柱（60mg/3mL）：杭州賽析科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 SPE-HPLC-MS/MS色譜條件

Waters Atalantis T3色譜柱（2.1 mm×50 mm，3 μm）；進(jìn)樣體積5 μL；色譜柱溫度30 ℃；流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液，B為乙腈；梯度洗脫條件如表1所示。

表1 HPLC-MS/MS梯度洗脫條件Table 1 HPLC-MS/MS gradient elution conditions

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子（electrospray ionization，ESI）源正離子模式；監(jiān)測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multi reaction monitoring，MRM）；離子源溫度：105 ℃；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；脫溶劑氣流量：10 L/min；錐孔流量：0.5 L/min；去溶劑溫度：400 ℃。

1.3.3 樣品的提取與凈化

稱取5 g（精確至0.01 g）動(dòng)物源性運(yùn)動(dòng)食品樣品至50 mL離心管中，加入25 mL的2 mol/L NaOH溶液，混合均勻，50 ℃水浴條件下水解60 min。然后再加入HCl溶液將水解液調(diào)至pH值7.0后，5 000 r/min離心5 min。取上清液加入PAX陰離子固相萃取柱，分別用6 mL甲醇和水依次活化后上樣，首先棄去流出液，然后用6 mL水洗滌，棄去流出液，用3 mL 1%的氨水甲醇溶液洗脫，收集洗脫液并于40 ℃氮?dú)獯蹈伞堄鄻悠酚?.0 mL流動(dòng)相溶解混勻，用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，供液相串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別稱量10 mg MQCA和QCA標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備液，再稀釋成質(zhì)量濃度均為1μg/mL的中間標(biāo)準(zhǔn)溶液。臨用前，將0.1%甲酸水溶液配制成質(zhì)量濃度為0.1～50.0 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 方法學(xué)考察

以未檢出MQCA和QCA的動(dòng)物源性運(yùn)動(dòng)食品為空白基質(zhì)，加入3個(gè)梯度的混合標(biāo)液，堿水解提取后使用固相萃取柱凈化和富集后，上機(jī)檢測(cè)MQCA和QCA的含量，計(jì)算回收率，并對(duì)每個(gè)結(jié)果測(cè)定6次，進(jìn)行精密度與重復(fù)性的測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的選擇

由于MQCA和QCA為極性化合物[18]，實(shí)驗(yàn)考察了Waters AtalantisT3色譜柱（2.1mm×50mm，3μm）和WatersACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）對(duì)MQCA和QCA分離效果的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 不同色譜柱條件下MQCA及QCA的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of MQCA and QCA under different chromatographic column conditions

由圖1可知，Waters Atalantis T3色譜柱具有明顯的優(yōu)勢(shì)，對(duì)極性化合物具有較好的保留效果，MQCA及QCA的峰形得到改善，與基質(zhì)中的雜質(zhì)也有較好的分離度，峰型尖銳，整個(gè)分離過程可以在5 min內(nèi)完成。因此，本試驗(yàn)選擇Waters Atalantis T3色譜柱。

2.2 流動(dòng)相體系的選擇

流動(dòng)相的不同組成會(huì)影響MQCA及QCA的分離和離子化效率，從而影響到目標(biāo)物的檢測(cè)靈敏度[19-20]。在流動(dòng)相選擇中，比較了甲醇、乙腈、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.1%甲酸、甲醇-0.1%氨水、乙腈-0.1%氨水作為流動(dòng)相時(shí)MQCA及QCA檢測(cè)靈敏度及出峰情況。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相體系中含有乙腈會(huì)改善起到目標(biāo)物峰形的作用，乙腈-0.10%甲酸及乙腈-0.1%氨水均能分離測(cè)定MQCA及QCA。但乙腈-0.1%氨水流動(dòng)相體系下，MQCA響應(yīng)低且QCA峰形拖尾展寬嚴(yán)重；乙腈-0.1%甲酸體系下，兩個(gè)目標(biāo)物均有較高響應(yīng)，峰形窄，這是因?yàn)樵贓SI+模式下流動(dòng)相中加入了0.1%的甲酸，提供質(zhì)子來源，顯著提高了目標(biāo)物離子化效率。

2.3 質(zhì)譜條件的選擇

用質(zhì)量濃度為20 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，對(duì)MQCA及QCA進(jìn)行一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜掃描，并優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)，具體質(zhì)譜分析參數(shù)見表2。

表2 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下MQCA及QCA的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 MS parameters of MQCA and QCA under multi reaction monitoring mode

2.4 方法的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

在乙腈-0.1%甲酸流動(dòng)相體系中，以表1梯度洗脫的步驟檢測(cè)，繪制MQCA及QCA的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限見表3。由表3可知，MQCA及QCA在0.1～50 ng/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）均＞0.999。檢出限均為0.05 μg/kg，定量限均為0.20 μg/kg。結(jié)果表明，方法的靈敏度能滿足檢測(cè)要求。

表3 MQCA及QCA的出峰時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Table 3 Peak time,standard curve regression equation,correlation coefficient,detection limit and quantitative limit of MQCA and QCA

2.5 前處理方式的優(yōu)化

2.5.1 堿水解條件的選擇優(yōu)化

MQCA及QCA在動(dòng)物源性樣品中與基質(zhì)一般以共價(jià)鍵結(jié)合，需對(duì)樣品進(jìn)行水解，常用的有酶水解、酸水解、堿水解3種方法[21-22]。其中酶解法耗時(shí)長，酸解法提取效率不高，后續(xù)凈化效果不理想。本試驗(yàn)采用強(qiáng)堿水解的方式短時(shí)間內(nèi)將目標(biāo)物從基質(zhì)中解離出來[23-25]。

通過比較不同的堿水解時(shí)間以及NaOH堿溶液的濃度，以水解液狀況評(píng)價(jià)水解效果，優(yōu)化堿水解條件。選擇水解時(shí)間分別為20 min、40 min、60 min、80 min、100 min、120 min，NaOH溶液濃度分別采用0.2 mol/L、0.5 mol/L、1.0mol/L、2.0 mol/L、5.0 mol/L、10.0 mol/L，在60 ℃條件下對(duì)樣品進(jìn)行水解。結(jié)果表明，NaOH堿溶液濃度在0.2～1.0 mol/L時(shí)，水解過程耗時(shí)較長，120 min后水解液中有樣品基質(zhì)殘?jiān)Ｓ?，水解不完全；NaOH堿溶液濃度在5.0～10.0 mol/L時(shí)，水解液變得濃稠，不利于后續(xù)的提取凈化步驟。選擇2.0 mol/L NaOH堿溶液水解60 min時(shí)，樣品被完全水解，沒有樣品基質(zhì)殘?jiān)Ｓ啵琈QCA及QCA能從樣品中被完全釋放出來。因此，選擇2.0 mol/L NaOH堿溶液水解60 min為最佳條件。

2.5.2 SPE柱的選擇優(yōu)化

由于MQCA及QCA的化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有喹喔啉-1,4-二氮氧結(jié)構(gòu)，其在弱堿或者酸性條件下能離子化成為分子，實(shí)驗(yàn)對(duì)已經(jīng)商品化的HLB、C18以及PAX共3種固相萃取小柱的凈化效果進(jìn)行對(duì)比，記錄目標(biāo)物峰面積，分析不同類型的SPE柱對(duì)MQCA及QCA提取的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 MQCA及QCA經(jīng)不同SPE柱處理后的回收率Fig.2 Recovery rate of MQCA and QCA treated by different SPE columns

由圖2可知，PAX固相萃取柱回收率最好（MQCA回收率88.5%，QCA回收率94.2%），兩個(gè)目標(biāo)組分的回收率最高，且不同類型SPE柱間目標(biāo)組分的回收率差異顯著（P＜0.05）。因此選擇PAX固相萃取柱進(jìn)行固相萃取凈化，且對(duì)60 mg/3 mL和150 mg/6 mL兩種規(guī)格的PAX固相萃取柱進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)對(duì)MQCA及QCA都有非常好的保留，回收率沒有明顯差異，從節(jié)省成本的角度考慮，PAX固相萃取柱（60 mg/3 mL）更為合適。

2.6 方法的精密度與加標(biāo)回收率

在加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)中，分別選用蛋奶類動(dòng)物源性基質(zhì)和肉類動(dòng)物源性基質(zhì)2種動(dòng)物源性基質(zhì)的樣品，分別添加2倍限量（低）、5倍限量（中）和10倍限量（高）（0.4 μg/kg、1.0 μg/kg和2.0 μg/kg）的3個(gè)水平混合標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)結(jié)果測(cè)定6次，進(jìn)行精密度及加標(biāo)回收率的試驗(yàn)，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）結(jié)果見表4。

表4 加標(biāo)回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Standard recovery rate and precision test results

由表4可知，在兩種不同的種類基質(zhì)樣品中，MQCA及QCA的平均回收率為83.67%～96.08%，在80%～120%范圍內(nèi)；精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為1.75%～3.10%，RSD均＜5%，說明本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度和精密度良好。

3 結(jié)論

本研究通過在堿性環(huán)境下水解提取樣品中的MQCA及QCA，經(jīng)PAX固相萃取柱（60 mg/3 mL）凈化處理后，建立了一種快速、準(zhǔn)確檢測(cè)MQCA及QCA在動(dòng)物源性運(yùn)動(dòng)食品中殘留量的SPE-HPLC-MS/MS方法。在蛋奶類動(dòng)物源性基質(zhì)和肉類動(dòng)物源性基質(zhì)中的加標(biāo)回收率為83.67%～96.08%，精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.75%～3.10%（n=6）。該方法具有可靠的準(zhǔn)確度和精密度，能準(zhǔn)確快速有效地檢測(cè)動(dòng)物源性運(yùn)動(dòng)食品中的MQCA及QCA的殘留量，可為該方面的分析和監(jiān)控提供技術(shù)支持。