氣相色譜-氫火焰離子化檢測(cè)器法測(cè)定白酒中50種風(fēng)味物質(zhì)

朱 明，殷 紅，靳喜慶，鄭曉衛(wèi)，姬紅晶，郝賽楠，丁子元，陳曉園*

（1.中糧酒業(yè)有限公司，北京 100005；2.中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院有限公司，北京 102209；3.營(yíng)養(yǎng)健康與食品安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102209；4.中糧生物科技（北京）有限公司，北京 102209）

白酒是中國(guó)傳統(tǒng)蒸餾酒，在酒中具有悠久的歷史，它是以糧食為主要原料通過蒸煮、糖化、發(fā)酵、蒸餾而制成的，具有以酯類、醇類為主體的復(fù)合香味，是世界六大蒸餾酒之一，至今為止中國(guó)白酒已有十二種不同香型[1-3]。白酒的主要成分是乙醇和水，占白酒總量的98%，其余2%含量的微量物質(zhì)主要是一些酯、酸、醇，同時(shí)還含有醛類、芳香族化合物、酚類等[3-5]。這些微量風(fēng)味物質(zhì)是酒體的呈香呈味物質(zhì)，影響著白酒不同的口感和風(fēng)味，決定了不同香型白酒的風(fēng)格和質(zhì)量[6-8]。

白酒中風(fēng)味物質(zhì)的物理性質(zhì)，包括極性、沸點(diǎn)、揮發(fā)性等都不相同，目前白酒中已發(fā)現(xiàn)約1 874種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中醇、酸、酯、醛的含量最高，約占總檢測(cè)成分的90%[9-10]，目前白酒中風(fēng)味成分的揮發(fā)性物質(zhì)分析方法主要有氣相色譜-火焰離子化檢測(cè)器（gas chromatography-flame ionization detector，GC-FID）法、氣相色譜-火焰光度檢測(cè)器（gas chromatography-flame photometric detector，GC-FPD）法、氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜（gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry，GC-O-MS）法、氣相色譜-質(zhì)譜（gaschromatography-mass spectrometry，GC-MS）法等[11-13]，GC-FPD針對(duì)含硫和磷的化合物信號(hào)響應(yīng)較高，GC-O-MS和GC-MS可針對(duì)低含量的化合物進(jìn)行檢測(cè)，但儀器價(jià)格較為昂貴，其中GC-FID法因其對(duì)碳?xì)浠衔镉休^好的響應(yīng)及穩(wěn)定的信號(hào)，且操作簡(jiǎn)單，成本較低，適用于測(cè)定白酒樣品中含量較高的風(fēng)味物質(zhì)，因此廣泛應(yīng)用于白酒行業(yè)風(fēng)味檢測(cè)和分析[14]。風(fēng)味物質(zhì)的含量是白酒品質(zhì)管控關(guān)鍵指標(biāo)之一，因此白酒企業(yè)具有對(duì)多種風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行快速準(zhǔn)確地定量分析的迫切需求。劉莎等[15]利用氣相色譜同時(shí)測(cè)定白酒中風(fēng)味物質(zhì)，張雅琪等[16]利用毛細(xì)管氣相色譜法同時(shí)檢測(cè)白酒中31種微量成分，但目前研究多集中在醇和酯類物質(zhì)分析[17-18]，對(duì)于異丁醛、正丙醛等醛類物質(zhì)及高沸點(diǎn)酸類物質(zhì)尚鮮有進(jìn)行測(cè)定。因此，本研究擬建立氣相火焰離子化檢測(cè)器法，以標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)進(jìn)行定性，內(nèi)標(biāo)（叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸）法定量，同時(shí)分離測(cè)定白酒中50種揮發(fā)性風(fēng)味醇、酸、酯、醛含量，旨在為白酒生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制提供方法支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白酒（馥郁香型50度白酒）：酒鬼酒股份有限公司；叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸（純度均為99%）：德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；乙醛、正丙醛、異丁醛、甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙縮醛、甲醇、異戊醛、2,3-丁二酮、丁酸乙酯、2-丁醇、正丙醇、乙酸丁酯、異丁醇、乙酸異戊酯、戊酸乙酯、2-戊醇、正丁醇、2-甲基丁醇、3-甲基丁醇、己酸乙酯、正戊醇、3-羥基-2丁酮、庚酸乙酯、乳酸乙酯、正己醇、己酸丁酯、辛酸乙酯、己酸異戊酯、糠醛、乙酸、苯甲醛、丙酸、異丁酸、2,3-丁二醇、丙二醇、丁酸、癸酸乙酯、糠醇、苯乙酸乙酯、異戊酸、戊酸、丁二酸二乙酯、月桂酸乙酯、己酸、β-苯乙醇、庚酸、辛酸、正壬酸、油酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品（純度均≥98%）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 7890B氣相色譜儀（配氫火焰離子化檢測(cè)器（FID）、CP-WAX57CB色譜柱（50 m×0.25 mm×0.20 μm））：美國(guó)Agilent 公司；ME204分析天平（感量為0.1 mg）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

乙醇溶液（50%vol）：量取50 mL乙醇，用水定容至100 mL，混勻。

內(nèi)標(biāo)溶液（2%）配制：在50 mL容量瓶中加入一定量的50%vol乙醇溶液，依次分別加入1 mL叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸內(nèi)標(biāo)，并稱質(zhì)量（精確至0.001 g），用50%vol乙醇溶液定容至刻度，混勻備用。各內(nèi)標(biāo)定量測(cè)定組分見表1。

表1 不同內(nèi)標(biāo)物質(zhì)測(cè)定的不同組分Table 1 Different components determined by different internal standard substances

50種風(fēng)味物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液：準(zhǔn)確稱取各風(fēng)味物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品2 g于10 mL容量瓶中，用50%vol乙醇溶液定容，配制成質(zhì)量濃度約為200 g/L母液。準(zhǔn)確分別吸取一定體積母液，按表1濃度配制3個(gè)組分混合標(biāo)液，用50%vol乙醇溶液定容。準(zhǔn)確分別吸取2 mL 3個(gè)組分混合標(biāo)液于10 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇溶液定容，配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液中間液。準(zhǔn)確分別移取0.25 mL、0.50 mL、1.25 mL、2.50 mL、5.00 mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液于10 mL容量瓶中，準(zhǔn)確吸取0.1 mL內(nèi)標(biāo)溶液（2%），用50%vol乙醇溶液定容，依次配制成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 樣品的前處理

準(zhǔn)確吸取待測(cè)白酒樣品5 mL，加0.1 mL內(nèi)標(biāo)溶液（2%），混勻，經(jīng)0.45 μm的有機(jī)濾膜過濾后供氣相色譜儀測(cè)定。

1.3.3 氣相色譜條件

CP-WAX57CB色譜柱（50 m×0.25 mm×0.20 μm），色譜柱溫度：初溫35 ℃，保持1 min，以3.0 ℃/min升至70 ℃，然后以3.5 ℃/min升至180 ℃，再以15 ℃/min升至210 ℃，保持5～15 min；檢測(cè)器溫度250 ℃；進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣為高純氮?dú)猓∟2）（純度99.999 9%），流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量1.0 μL；分流比20∶1。

1.3.4 定性定量方法

根據(jù)50種風(fēng)味物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品在色譜圖上的保留時(shí)間對(duì)白酒中的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定性分析，同時(shí)以標(biāo)液濃度與樣品峰面積的比值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到試樣中各物質(zhì)的濃度。風(fēng)味物質(zhì)含量計(jì)算參考文獻(xiàn)[18]的計(jì)算方法，校正因子（f值）計(jì)算按公式如下：

式中：f為各物質(zhì)的相對(duì)校正因子；A1為內(nèi)標(biāo)物的峰面積；A2為被測(cè)組分標(biāo)樣的峰面積；C1為內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度，mg/L；C2為被測(cè)組分標(biāo)樣的質(zhì)量濃度，mg/L。

樣品中各物質(zhì)含量計(jì)算公式如下：

式中：X為樣品中各物質(zhì)的質(zhì)量濃度，mg/L；A3為樣品中被測(cè)組分的峰面積；A4為添加于樣品中的內(nèi)標(biāo)物的峰面積；C4為添加于樣品中的內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度，mg/L。

1.3.5 方法學(xué)考察

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與檢出限

將配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液按最佳色譜條件進(jìn)樣分析，以標(biāo)準(zhǔn)溶液各組分質(zhì)量濃度與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度的比值（x）為橫坐標(biāo)，各組分峰面積與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積比值（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

檢出限參照GB/T 5009.1—2003《食品衛(wèi)生檢驗(yàn)方法理化部分總則》[19]的方法。將50種風(fēng)味物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液，按方法1.3.3進(jìn)行氣相色譜分析，以3倍信噪比（S/N）計(jì)算出檢出限（limit of detection，LOD）。

（2）加標(biāo)樣品回收率試驗(yàn)和精密度試驗(yàn)

回收率和精密度試驗(yàn)參照GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》[20]方法。

精密度試驗(yàn)：稱取同一份白酒樣品6份，依照1.3.2前處理方法及1.3.3儀器方法對(duì)其風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定各化合物峰面積，計(jì)算結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

加標(biāo)樣品的回收率試驗(yàn)：根據(jù)白酒中各種化合物含量高低，分別準(zhǔn)確稱取高和低兩種質(zhì)量濃度的50種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于100 mL容量瓶中，用白酒樣品定容。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)分析

利用儀器自帶的ChemStation軟件用于查看色譜圖、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用Excel 2016處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 定性分析結(jié)果

按照1.3.3色譜條件下，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)性測(cè)定，用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)照保留時(shí)間定性，得到白酒中50種風(fēng)味物質(zhì)的色譜圖見圖1。由圖1可知，白酒樣品中乙醛、正丙醛、異丁醛、甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙縮醛、甲醇、異戊醛、2,3-丁二酮、丁酸乙酯、2-丁醇、正丙醇、乙酸丁酯、異丁醇、乙酸異戊酯、戊酸乙酯、2-戊醇、正丁醇、2-甲基丁醇、3-甲基丁醇、己酸乙酯、正戊醇、3-羥基-2丁酮、庚酸乙酯、乳酸乙酯、正己醇、己酸丁酯、辛酸乙酯、己酸異戊酯、糠醛、乙酸、苯甲醛、丙酸、異丁酸、2,3-丁二醇、丙二醇、丁酸、癸酸乙酯、糠醇、苯乙酸乙酯、異戊酸、戊酸、丁二酸二乙酯、月桂酸乙酯、己酸、β-苯乙醇、庚酸、辛酸、正壬酸、油酸乙酯等50種成分均能檢出，該檢測(cè)方法靈敏度高，檢測(cè)組分都實(shí)現(xiàn)基線分離和自動(dòng)積分，并且分析時(shí)間較短，約50 min，并且操作簡(jiǎn)便，快速準(zhǔn)確。

圖1 白酒中50種風(fēng)味物質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of mixed standard of 50 flavor compounds in Baijiu

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將配制的白酒50種風(fēng)味物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液用內(nèi)標(biāo)法在上述色譜條件下進(jìn)樣，分別測(cè)定其與內(nèi)標(biāo)溶液的峰面積比，以標(biāo)準(zhǔn)溶液中各物質(zhì)與正丁醇的質(zhì)量比（x）為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液與內(nèi)標(biāo)溶液的峰面積比（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、相關(guān)系數(shù)（R2）、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保留時(shí)間和檢出限結(jié)果見表2。白酒樣品中50種風(fēng)味物質(zhì)的平均加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表2 50種風(fēng)味物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、相關(guān)系數(shù)、保留時(shí)間和檢出限Table 2 Standard curve,regression equation,correlation coefficient,retention time and detection limit of 50 flavor substances

續(xù)表

由表2可知，50種風(fēng)味物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為5.475～50.597 min，相關(guān)系數(shù)R2均＞0.995，檢出限在0.34～25.62 mg/L之間，滿足白酒中風(fēng)味物質(zhì)分析方法要求。對(duì)于乙醛、乙酸乙酯和甲醇等沸點(diǎn)較低的風(fēng)味物質(zhì)檢出限較低，與文獻(xiàn)中報(bào)道GC-FID法測(cè)定22種白酒風(fēng)味物質(zhì)檢出限0.1～1.5 mg/L一致[15]，但保留時(shí)間較后的高沸點(diǎn)物質(zhì)如苯乙酸乙酯、月桂酸乙酯、庚酸和辛酸檢出限較高。

由表3可知，白酒樣品中50種風(fēng)味物質(zhì)平均加標(biāo)回收率在90.06%～106.30%之間，精密度試驗(yàn)結(jié)果RSD在0.05%～4.89%之間，結(jié)果表明，該檢測(cè)方法精密度及準(zhǔn)確性良好，基本可以滿足對(duì)日常酒樣風(fēng)味組分分析。其中極性較強(qiáng)有機(jī)酸（如庚酸和辛酸）精密度較低（RSD＞3.0%），可能由于極性較強(qiáng)且沸點(diǎn)較高，容易被襯管吸附，從而導(dǎo)致結(jié)果重現(xiàn)性較差[21-25]。

表3 樣品中50種風(fēng)味物質(zhì)的平均加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)Table 3 Average recovery rates and precision tests of 50 flavor substances in Baijiu samples

續(xù)表

3 結(jié)論

本研究利用GC-FID法同時(shí)測(cè)定了白酒中50種風(fēng)味物質(zhì)，建立了一個(gè)快速、穩(wěn)定、靈敏的可有效分離檢測(cè)白酒中50種風(fēng)味物質(zhì)含量的分析檢測(cè)方法。該方法使分離物的保留時(shí)間在5.475～50.597 min之間，50種風(fēng)味物質(zhì)在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均＞0.995，樣品平均加標(biāo)回收率在90.06%～106.30%之間，精密度試驗(yàn)結(jié)果RSD在0.05%～4.89%之間，最低檢出限在0.34～25.62 mg/L之間。該方法簡(jiǎn)單，精密度及準(zhǔn)確度良好，后期可利用該方法對(duì)不同質(zhì)量級(jí)別白酒樣品的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，并利用統(tǒng)計(jì)學(xué)手段建立風(fēng)味化學(xué)與感官分級(jí)之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系與模型，建立科學(xué)的白酒質(zhì)量分級(jí)體系。