窖池微生態(tài)調(diào)控對(duì)窖泥馴化及酒質(zhì)影響的研究

施 思，喬宗偉，2*，羅青春，劉多濤

（1.宜賓五糧液股份有限公司，四川 宜賓 644007；2.固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓 644007）

泥窖是釀造濃香型白酒的關(guān)鍵設(shè)備，棲息在窖泥中的微生物經(jīng)過長期馴化，形成一個(gè)趨于成熟的微生態(tài)系統(tǒng)，使發(fā)酵過程中的酸、酯等呈香、呈味物質(zhì)的含量和比例趨于協(xié)調(diào)、穩(wěn)定，從而造就了以己酸乙酯為主體香的濃香型白酒的典型風(fēng)格。因此，老熟的窖泥是釀造優(yōu)質(zhì)濃香型白酒的重要條件之一。

目前，為了防止窖泥退化和老化，以及能較快地使新窖泥向老熟窖泥轉(zhuǎn)化過度，很多酒廠在窖泥馴化方面做了很多探討和嘗試，如以糟養(yǎng)窖、以黃水、蒸糧水、曲藥、原酒、營養(yǎng)液等養(yǎng)窖護(hù)窖[1-8]。糟醅是一種雙向載體，以糟養(yǎng)窖需要正常的母糟發(fā)酵，否則極易影響窖泥功能菌正常的生長代謝；優(yōu)質(zhì)原酒養(yǎng)窖能增加酒的香氣，排除一些雜味，但成本偏高，且需對(duì)原酒質(zhì)量級(jí)別進(jìn)行準(zhǔn)確定位；黃水營養(yǎng)豐富，酸度極高，含有豐富的有機(jī)酸，尤其是乳酸和乙酸，長期覆蓋窖池中下部，會(huì)導(dǎo)致窖泥過度酸化，逐漸出現(xiàn)白色顆粒或結(jié)晶，造成濃香型白酒主體香己酸乙酯含量降低。而白色物中主要包含乳酸亞鐵和乳酸鈣，當(dāng)乳酸亞鐵含量達(dá)到0.1%時(shí)，對(duì)己酸的生成具有顯著地阻礙作用[9-10]，并且pH值下降，窖泥出現(xiàn)板結(jié)，泡氣柔熟度降低，最終導(dǎo)致香氣不協(xié)調(diào)，酒質(zhì)下降。為了使窖泥微生物達(dá)到老熟窖泥所需的條件，很多研究也會(huì)添加豐富的營養(yǎng)液培養(yǎng)相關(guān)功能菌，進(jìn)行窖泥馴化。但營養(yǎng)液中添加過多的有機(jī)碳源，容易營養(yǎng)過剩，導(dǎo)致惡臭。

本研究立足生產(chǎn)實(shí)際，利用物理法和化學(xué)法進(jìn)行窖池微生態(tài)調(diào)控，最終達(dá)到馴化窖泥老熟，提高酒質(zhì)的目的。其中，化學(xué)法是通過解析老熟窖泥中原核微生物的群落結(jié)構(gòu)，針對(duì)性地設(shè)計(jì)了一種純無機(jī)鹽培養(yǎng)的功能菌液，具有增己降乳、方便易配制等優(yōu)點(diǎn)。另外，研究利用窖池不同部分生酸情況的差異，嘗試了一種物理置換法，利用窖池生酸的客觀規(guī)律進(jìn)行窖泥馴化，該方法不涉及任何化學(xué)物質(zhì)的添加，不會(huì)產(chǎn)生任何安全問題，以期為窖泥的馴化養(yǎng)護(hù)提供新的思路和手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 窖泥樣品

老熟窖泥（1#、2#、3#）：來源于車間生產(chǎn)窖池。

1.1.2 培養(yǎng)基

專性培養(yǎng)基[11]：乙酸鈉1%、甲酸鈉0.2%、氯化鎂0.02%、磷酸氫二鉀0.05%、氯化銨0.75%，pH自然。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.3 試劑

己酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸乙酯、異戊醇、正丁醇、異丁醇、正丙醇、甲醇（均為色譜純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、己酸、庚酸和乳酸（均為色譜純）：美國Sigma公司；宏基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提試劑盒、細(xì)菌引物（341F：5'-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCCTACGGGNGGCWGCAG-3'；805R：5'-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）、古菌引物（第一輪為1st-340F：5'-CCCTAYGGGGYGCASCAG-3'，1st-1000R：5'-GGCCATGCACYWCYTCTC-3'；第二輪為349F：5'-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTN（barcode）GYGCASCAGKCGMGAAW-3'，806R：5'-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGGACTACVSGGGTATCTAAT-3'）：生工生物工程（上海）股份有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UNIVERSAL320R冷凍離心機(jī)：德國Hettich公司；HWS26型電熱恒溫?cái)?shù)字水浴鍋：上海一恒科技有限公司；T100TMThermal Cyeler 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國BIO-RAD公司；DYCZ-21電泳槽：北京六一生物科技有限公司；GelDoc IT TS2凝膠成像系統(tǒng)：美國UVP公司；7890氣相色譜（gas chromatography，GC）儀（配備火焰離子檢測(cè)器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）檢測(cè)器）：美國安捷倫公司；JS-PD800-C便攜式氣體檢測(cè)儀（適用氣體甲烷）：濟(jì)南軍順電子技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 窖泥菌群宏基因組的提取

采用差速離心法收集微生物細(xì)胞沉淀[12]，采取反復(fù)凍融與試劑盒相結(jié)合的方法，收集DNA，置于-20 ℃保存；利用Qubit2.0 DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)基因組DNA精確定量，以確定PCR反應(yīng)加入的DNA量。

1.3.2 PCR擴(kuò)增及Miseq高通量測(cè)序

PCR擴(kuò)增及Miseq高通量測(cè)序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。利用Qubit2.0 DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)回收的DNA精確定量，按照1∶1的比例等量混合后測(cè)序。等量混合時(shí)，每個(gè)樣品的DNA量取10 ng，最終上機(jī)測(cè)序的摩爾質(zhì)量為20 pmol。對(duì)測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控過濾，最終獲得可供分析的優(yōu)質(zhì)序列。利用Usearch（Version 5.2.236）按照97%的相似度聚類生成操作分類單元（operational taxonomic，OTU），與核糖體數(shù)據(jù)庫項(xiàng)目（ribosomal database project，RDP）比對(duì)得到物種分類信息，并計(jì)算每個(gè)樣品的香濃（Shannon）、超1（Chao 1）指數(shù)等。利用R（Version 3.2）制作群落結(jié)構(gòu)組分圖[13-14]。

1.3.3 專性培養(yǎng)液的制備

在專性培養(yǎng)基中接入2#老熟窖泥，接種量為10%，35 ℃靜置培養(yǎng)，當(dāng)甲烷生成量＞40%時(shí)停止培養(yǎng)，檢測(cè)發(fā)酵前后有機(jī)酸的含量。

1.3.4 化學(xué)法窖泥馴化

將窖泥鏟出魚鱗狀，均勻噴灑專性培養(yǎng)液，每口窖池的噴灑量為20 L，噴灑位置為窖池底部和窖壁下層。試驗(yàn)選取了3口窖池，編號(hào)為A、B、C，進(jìn)行4輪發(fā)酵跟蹤。

1.3.5 物理法窖泥馴化

老熟窖泥的感官評(píng)價(jià)為顏色烏黑、有泡氣、手感細(xì)軟，有窖泥香；退化窖泥的感官評(píng)價(jià)為顏色偏黃、手感偏硬，缺少窖泥香[15]。通過柔熟程度、顏色等[15]選取具有趨老熟窖泥特征的中層窖壁泥與退化的窖底泥進(jìn)行置換。試驗(yàn)選取了3口窖池，編號(hào)為a、b、c，進(jìn)行4輪發(fā)酵跟蹤。

1.3.6 有機(jī)酸含量的檢測(cè)

采用衍生化法結(jié)合氣相色譜分析發(fā)酵液中有機(jī)酸的含量[16]。

1.3.7 醇和酯含量的檢測(cè)

選取窖泥馴化相對(duì)應(yīng)的糟醅層蒸餾取樣，采用氣相色譜法分析酒樣中的主要醇和酯成分[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 老熟窖泥原核微生物結(jié)構(gòu)解析

2.1.1 老熟窖泥原核微生物測(cè)序結(jié)果及多樣性分析

對(duì)各窖泥樣本測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控過濾后，對(duì)其古菌及細(xì)菌進(jìn)行多樣性分析，結(jié)果見表1～表2。

表1 老熟窖泥中古菌α-多樣性分析結(jié)果Table 1 Result of α-diversity analysis of archaea in aged pit mud

表2 老熟窖泥中細(xì)菌α-多樣性分析結(jié)果Table 2 Result of α-diversity analysis of bacteria in aged pit mud

由表1～表2可知，各窖泥樣本的Coverage均＞94%，說明本次試驗(yàn)取樣合理，結(jié)果能代表樣本的真實(shí)情況。Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)是常用的描述群落物種多樣性的指數(shù)，其中，Shannon指數(shù)值越大，說明群落多樣性越高；Chao 1指數(shù)值越大，說明物種豐富度越高[18]。各窖泥樣本以細(xì)菌微生物為主，其群落多樣性及物種豐富度都高于古菌菌群。

2.1.2 老熟窖泥原核微生物菌群結(jié)構(gòu)分析

窖泥樣本中原核微生物群落結(jié)構(gòu)差異見圖1。

圖1 基于屬水平古菌（a）及細(xì)菌（b）菌群結(jié)構(gòu)解析Fig.1 Communities structure analysis of archaea (a) and bacteria (b)based on genera level

由圖1a可知，3個(gè)窖泥樣品的古菌群落主要有3類，分別為甲烷囊菌屬（Methanoculleus）、熱裸單胞菌屬（Thermo-gymnomonas），甲烷桿菌屬（Methanobacterium）。其中，甲烷囊菌屬為樣本中數(shù)量最多的古菌，在3個(gè)窖泥樣本中占比依次為83.63%、88.05%和75.12%。

由圖1b可知，3個(gè)窖泥樣品的細(xì)菌群落中，梭菌屬（Clostridium）是窖泥中的主要優(yōu)勢(shì)菌，占比分別為36.93%、86.35%和29.31%。其次，窖泥樣本中還分布紫單胞菌屬（Petrimonas）、互營單胞菌屬（Syntrophomonas）及馬西莉亞菌屬（Massilia）等?；I單胞菌屬（Syntrophomonas）和梭菌屬（Clostridium）是主要的產(chǎn)氫產(chǎn)酸細(xì)菌種屬，常與產(chǎn)甲烷菌共生，它們?cè)趨捬跸^程中會(huì)產(chǎn)生乙酸和氫氣，有的還產(chǎn)生丙酸、丁酸或己酸等有機(jī)酸類，對(duì)濃香型白酒復(fù)合香氣的形成起著重要作用[19-21]。

原核微生物群落結(jié)構(gòu)解析結(jié)果顯示，梭菌屬和甲烷囊菌屬是老熟窖泥中的重要菌群。梭菌屬中的產(chǎn)己酸菌與產(chǎn)甲烷菌通過“種間氫轉(zhuǎn)移”互利共生，在共培養(yǎng)時(shí)能提高梭菌產(chǎn)己酸能力，對(duì)濃香型白酒的主體香生成具有重要作用[22]。而甲烷菌的甲烷生物合成途徑主要是以乙酸為底物產(chǎn)生甲烷，占自然界甲烷量的67%，以H2/CO2轉(zhuǎn)化形成甲烷不足自然界甲烷量的33%[23]。針對(duì)老熟窖泥原核微生物的主要構(gòu)成，試驗(yàn)設(shè)計(jì)了一種以乙酸鈉為主要碳源的無機(jī)鹽專性培養(yǎng)基，既可為己酸菌發(fā)酵提供無機(jī)鹽，又可作為乙型甲烷菌的營養(yǎng)物質(zhì)[24]。試驗(yàn)通過甲烷氣體生成量判定發(fā)酵狀態(tài)，將甲烷產(chǎn)量＞40%的發(fā)酵液用于窖泥馴化。

2.2 專性培養(yǎng)液有機(jī)酸分析

專性培養(yǎng)基接種2#老熟窖泥進(jìn)行發(fā)酵，對(duì)發(fā)酵前后的有機(jī)酸含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表3。

由表3可知，利用專性培養(yǎng)基接種老熟窖泥培養(yǎng)后，專性培養(yǎng)液中己酸含量（205.20 mg/100 mL）增加，乳酸含量（69.73 mg/100 mL）減少。結(jié)果表明，經(jīng)專性培養(yǎng)基馴化后的窖泥菌群具有增己降乳功能，與試驗(yàn)預(yù)期相符，符合窖泥馴化的趨勢(shì)[25]。其中乙酸增多，可能與培養(yǎng)基的成分有關(guān)，具體影響需要結(jié)合酒質(zhì)的結(jié)果分析。

表3 發(fā)酵前后專性培養(yǎng)液中有機(jī)酸含量的檢測(cè)結(jié)果Table 3 Determination results of organic acid content in obligate culture solution before and after fermentation

2.3 化學(xué)法對(duì)窖泥馴化過程中酒質(zhì)的影響

試驗(yàn)選取了3口窖池，將培養(yǎng)好的專性發(fā)酵液均勻地噴灑在窖壁下層及底部，待每輪發(fā)酵結(jié)束后取下層糟醅進(jìn)行蒸餾取樣，測(cè)定酒樣中主要醇和酯的含量，結(jié)果見表4。

由表4可知，每輪發(fā)酵結(jié)束后，由于生產(chǎn)過程涉及的工藝環(huán)節(jié)較多，主要指標(biāo)變化不一，如乙酸乙酯的含量先降后升。但是，隨著馴化的推進(jìn)，從整體趨勢(shì)來看，在第3輪發(fā)酵跟蹤結(jié)束后，綜合酒樣中的己酸乙酯含量由292.13mg/100mL升高至422.65 mg/100 mL，乳酸乙酯含量由221.39 mg/100 mL降至138.91 mg/100 mL，酯的變化趨勢(shì)與專性培養(yǎng)液增己降乳的趨勢(shì)較為一致。

表4 化學(xué)法馴化酒樣中醇和酯含量分析結(jié)果Table 4 Analysis results of alcohols and esters contents in liquor samples domesticated by chemical method

2.3 物理法對(duì)窖泥馴化過程中酒質(zhì)的影響

窖池下底部受黃水影響較大，易發(fā)生酸化及退化現(xiàn)象，而相對(duì)應(yīng)的中層窖壁泥受黃水酸化影響較小，易于自我修復(fù)。通過對(duì)車間某些窖池的觀察發(fā)現(xiàn)，中部窖壁泥趨老熟特征較窖底泥明顯。試驗(yàn)通過柔熟程度、顏色等選取了具有趨老熟窖泥特征的中層窖壁泥與退化的窖底泥進(jìn)行置換，以期使退化的窖底泥進(jìn)行自我修復(fù)，控制窖底過度生酸。窖底糟醅蒸餾后，對(duì)酒樣中主要的醇和酯含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表5。

表5 物理法馴化酒樣中醇和酯含量的分析結(jié)果Table 5 Analysis results of alcohols and esters contents in liquor samples domesticated by physical method

由表5可知，己酸乙酯及乳酸乙酯含量在前兩輪分別出現(xiàn)了一定程度的下降及上升，這可能與退化窖泥的自我修復(fù)有關(guān)。從第3輪的酒樣指標(biāo)來看，己酸乙酯含量增加，而乳酸乙酯含量下降，己酸乙酯與乳酸乙酯的比例更加協(xié)調(diào)，雜醇油中正丙醇含量減少，綜合酒樣酒質(zhì)得到提高。試驗(yàn)結(jié)果顯示，通過合理利用各種質(zhì)量的窖泥特性，采用簡單的物理置換可以達(dá)到提升酒質(zhì)的效果，為窖泥馴化提供了新的思路。

3 結(jié)論

窖泥在濃香型白酒釀造過程中的作用十分關(guān)鍵，為更好地為窖泥馴化提供技術(shù)支撐，本研究立足生產(chǎn)實(shí)際，一方面采用分子免培養(yǎng)技術(shù)解析窖泥原核微生物多樣性，采用化學(xué)法快速重塑老熟窖泥微生態(tài)；一方面總結(jié)窖池生酸規(guī)律，采用物理置換法馴化窖泥。試驗(yàn)結(jié)果表明，兩種方法都能達(dá)到馴化窖泥的目的。其中，化學(xué)法增己降乳的效果更加明顯，酒樣中己酸乙酯含量提高44.67%，乳酸乙酯含量下降37.25%；而物理置換法馴化過程較為緩慢。由于物理置換不涉及任何外源物質(zhì)添加等生產(chǎn)安全問題，可進(jìn)一步完善置換窖泥相應(yīng)參數(shù)指標(biāo)，更好地指導(dǎo)窖泥養(yǎng)護(hù)和生產(chǎn)。

在實(shí)際生產(chǎn)過程中，靠歲月不斷積累起來的窖泥微生態(tài)系統(tǒng)仍然很難復(fù)制，并且每個(gè)酒廠的窖泥狀態(tài)不可能完全一樣。因此，窖泥的養(yǎng)護(hù)需要根據(jù)自身窖池的具體情況來制定相應(yīng)的養(yǎng)窖方式，這需要將研究不斷與生產(chǎn)實(shí)踐相結(jié)合，了解每輪窖池的發(fā)酵生酸情況及窖泥的感官變化等，從而制定更加科學(xué)的養(yǎng)窖策略。