靈芝固態(tài)發(fā)酵三七渣產(chǎn)漆酶的培養(yǎng)基配方優(yōu)化

譚顯東，吉栗漫，陳 楠，盧曉愛，魏 琨，羊依金

（成都信息工程大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，四川 成都 610225）

漆酶（Laccase，EC 1.10.3.2）是一種含銅的多酚類氧化還原蛋白，屬于銅藍(lán)氧化酶，它最早于1883年在日本的漆樹中被發(fā)現(xiàn)并分離出來[1-2]，有關(guān)漆酶的研究已經(jīng)持續(xù)了100多年。漆酶作為一種生物酶，能夠?qū)⒎宇?、胺類、羧酸類等難降解污染物在溫和的條件下降解為對環(huán)境毒性更弱的小分子物質(zhì)，有著巨大的應(yīng)用潛力[3-6]。金地靈芝（川審菌2003008）是四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所用赤芝為出發(fā)菌株，經(jīng)過原生質(zhì)體再生技術(shù)選育的靈芝新品種，具有產(chǎn)量高、原基分化早、菌蓋分化時(shí)間短、成熟周期短、芝形好等特點(diǎn)。在前期研究中發(fā)現(xiàn)金地靈芝產(chǎn)漆酶酶活較高。

目前發(fā)酵產(chǎn)漆酶的方法主要有液態(tài)發(fā)酵與固態(tài)發(fā)酵兩種。固態(tài)發(fā)酵是微生物在沒有或基本沒有游離水的固態(tài)基質(zhì)上，利用自然底物作為碳源和能源，用一種或多種微生物進(jìn)行的生物反應(yīng)過程。與液態(tài)發(fā)酵相比，固態(tài)發(fā)酵具有發(fā)酵原料易獲取、成本較低、發(fā)酵易操作且過程中無廢水、廢氣產(chǎn)生等優(yōu)點(diǎn)[7-8]。三七渣因其含有大量的有機(jī)物、礦質(zhì)元素和一些微量元素[9-10]，適合作為固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)使用。選擇采用金地靈芝固態(tài)發(fā)酵三七渣產(chǎn)漆酶，既能夠?qū)崿F(xiàn)三七渣的資源化利用，提高其附加值，又能夠?yàn)槠崦傅纳a(chǎn)提供一條新的低成本途徑。

因此，本研究以漆酶酶活作為評價(jià)指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化金地靈芝固態(tài)發(fā)酵三七渣生產(chǎn)漆酶的培養(yǎng)基組成條件，以期為工業(yè)化利用三七渣固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)漆酶提供培養(yǎng)基組成的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

三七渣：來自成都市某中成藥廠，中藥渣濕物料經(jīng)曬干、粉碎、過篩后置于干燥器中備用，其主要成分為真蛋白9.97%，粗蛋白12.28%，粗纖維27.45%，還原糖2.19%，總糖48.87%，淀粉30.35%[11]；金地靈芝（川審菌2003008）：四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所微生物室提供。

1.1.2 試劑

MgSO4·7H2O、無水乙醇、NaNO3、KH2PO4、葡萄糖（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠；2,2'-聯(lián)氮-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid ammonium salt，ABTS）（分析純）：上海阿拉丁試劑廠。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：土豆20 g，葡萄糖2.0 g，瓊脂粉2.0 g，蒸餾水100 mL，121 ℃滅菌30 min。

種子液培養(yǎng)基：葡萄糖6%，蛋白胨2%，NaNO31%，MgSO4·7H2O 0.5%，KH2PO41%，自然pH，121 ℃滅菌30 min。

三七渣固體培養(yǎng)基：采用過60目篩的三七渣10.0 g，酵母浸出粉添加量1%，培養(yǎng)基初始水含量60%，磷酸二氫鉀添加量0.15%，硫酸銅添加量0.02%，硫酸鎂添加量0.2%，pH自然，121 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SF-130中藥分析研磨機(jī)：長沙中南制藥機(jī)械廠；LHS-250HC-II恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；JHF1-DK-S28電熱恒溫水浴鍋：華西科創(chuàng)（北京）科技有限公司；UV752紫外可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種擴(kuò)大培養(yǎng)

使用接種環(huán)將試管內(nèi)保存的斜面菌種取適量接入PDA培養(yǎng)基中，于28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)5～6 d。

1.3.2 種子液制備

用打孔器在PDA培養(yǎng)基的邊緣取0.5 cm2的靈芝菌絲塊，接入裝有110 mL種子液培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中并放入6～9顆小玻璃珠，置于恒溫振蕩器中，在150 r/min、28 ℃條件下培養(yǎng)5 d。

1.3.3 三七渣固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基配方優(yōu)化

在三七渣固體培養(yǎng)基中接入2 mL的靈芝種子液，于28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)12 d。

單因素試驗(yàn)：分別考察三七渣固體培養(yǎng)基中酵母浸出粉添加量（1%、2%、3%、4%、5%）、培養(yǎng)基初始水含量（50%、55%、60%、70%、75%、80%）、硫酸酮添加量（0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%）、磷酸二氫鈉添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）、硫酸鎂添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）對發(fā)酵培養(yǎng)物中漆酶酶活的影響。

正交試驗(yàn)：在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇對發(fā)酵結(jié)果影響較大的培養(yǎng)基初始水含量、磷酸二氫鈉添加量、硫酸銅添加量進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)[12]，優(yōu)化培養(yǎng)基組成。正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 三七渣固體培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for Panax notoginseng residues solid medium formula optimization

1.3.4 漆酶粗酶液制備

待固態(tài)發(fā)酵結(jié)束后，用手術(shù)剪將發(fā)酵培養(yǎng)物剪碎，向錐形瓶中加入150 mL乙酸-乙酸鈉緩沖提取液（pH4.8），置于40 ℃條件下恒溫水浴1 h，每隔20 min振搖一次，水浴結(jié)束后用8層紗布過濾，將濾液于5 000 r/min條件下離心15 min，取上清液即為漆酶粗酶液，置于4 ℃條件下冷藏備用。

1.3.5 測定方法

漆酶酶活：采用ABTS法[13-14]進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

氮是真菌生長所必需的元素，有機(jī)氮源有助于靈芝的生長[15-16]，酵母浸出粉添加量對漆酶酶活的影響見圖1。

圖1 酵母浸出粉添加量對漆酶酶活的影響Fig.1 Effect of yeast extract powder addition on laccase activity

由圖1可知，漆酶酶活先是隨著酵母浸出粉添加量的增加逐漸增大，當(dāng)酵母浸出粉添加量為3%時(shí)，漆酶酶活達(dá)到最大值2.73 U/g。繼續(xù)增大其添加量反而會導(dǎo)致漆酶酶活減小，可能是因?yàn)榻湍附龇酆窟^高，會使培養(yǎng)基黏性增大，影響通透性；此外，培養(yǎng)基氮含量過高會使培養(yǎng)基碳氮比失調(diào)，導(dǎo)致靈芝代謝異常，生長緩慢[17]。因此選擇酵母浸出粉的最適添加量為3%。

2.1.2 培養(yǎng)基初始水含量對漆酶酶活的影響

真菌從外界獲取營養(yǎng)物質(zhì)的過程中離不開水的參與，許多化學(xué)元素只有溶解在水中，才能被真菌利用。水能夠從多方面對固態(tài)發(fā)酵過程產(chǎn)生影響[18]，培養(yǎng)基的含水量對漆酶酶活的影響較大[19]，培養(yǎng)基不同初始水含量對漆酶酶活的影響見圖2。

由圖2可知，漆酶酶活隨著初始水含量的增加呈先增大后減小的趨勢，當(dāng)初始水含量為55%時(shí)，漆酶酶活達(dá)到最大值5.625 U/g。研究中發(fā)現(xiàn)，水含量達(dá)到一定值后，固態(tài)培養(yǎng)基質(zhì)在錐形瓶內(nèi)呈現(xiàn)糊狀且分散極為不均，這將影響培養(yǎng)基的通透性，不利于體系熱傳遞以及CO2、O2的交換，不利于靈芝呼吸代謝[20]。因此，選擇培養(yǎng)基的最適初始含水量為55%。

圖2 初始水含量對漆酶酶活的影響Fig.2 Effect of initial water content on laccase activity

2.1.3 硫酸銅添加量對漆酶酶活的影響

YOU L F等[22]的研究表明，銅離子可以誘導(dǎo)漆酶基因的表達(dá)。硫酸銅添加量對漆酶酶活的影響見圖3。

對于黑索金為-76.6 kJ·mol-1[12]，其滿足其中，表示炸藥消耗的氧氣量，c表示炸藥自身含有的氧氣量。爆炸反應(yīng)化學(xué)方程式為

圖3 硫酸銅添加量對漆酶酶活的影響Fig.3 Effect of copper sulfate addition on laccase activity

由圖3可知，漆酶酶活隨硫酸銅含量的增加呈先增大后減小的趨勢。當(dāng)硫酸銅添加量為0.03%時(shí)漆酶酶活達(dá)到最大值3.19 U/g，在硫酸銅添加量為0.03%～0.04%時(shí)漆酶活性降低較多，該結(jié)果說明低濃度銅離子對靈芝產(chǎn)漆酶具有促進(jìn)作用，而高濃度銅離子則表現(xiàn)為抑制作用。POSTEMSKY P D等[23]添加100 mg/kg Cu（II）作為底物補(bǔ)充物使蘑菇殘基中的漆酶活性從150 U/kg提高至267 U/kg底物。一般認(rèn)為，Cu2+的促進(jìn)作用可能與漆酶的結(jié)構(gòu)有一定關(guān)系[24]。因此，選擇硫酸銅的最適添加量為0.03%。

2.1.4 磷酸二氫鉀添加量對漆酶酶活的影響

磷與真菌的生長活動密不可分，遺傳物質(zhì)、細(xì)胞膜的合成以及能量的轉(zhuǎn)化傳遞過程都離不開磷。翟雙星等[25]發(fā)現(xiàn)K+是靈芝菌絲體正常生長的必要條件。磷酸二氫鉀添加量對漆酶酶活的影響見圖4。

由圖4可知，漆酶酶活隨磷酸二氫鉀添加量的增加而增加，在磷酸二氫鉀含量為0.15%時(shí)漆酶酶活達(dá)到最大值3.81 U/g。繼續(xù)增大磷酸二氫鉀添加量漆酶酶活反而降低。磷酸二氫鉀一方面可以給靈芝同時(shí)提供磷、鉀兩種不同的營養(yǎng)元素，另一方面會影響靈芝生長環(huán)境的pH值，從而影響靈芝的生長代謝。因此，選擇磷酸二氫鉀的最適添加量為0.15%。

圖4 磷酸二氫鉀添加量對漆酶酶活的影響Fig.4 Effect of potassium hydrogen phosphate addition on laccase activity

2.1.5 硫酸鎂添加量對漆酶酶活的影響

由圖5可知，漆酶活性呈先增加后降低的趨勢，硫酸鎂添加量在0.05%～0.20%時(shí)，活性較穩(wěn)定升高，硫酸鎂含量為0.20%時(shí)漆酶酶活達(dá)到最大值2.53 U/g。硫酸鎂添加量超過0.20%后，漆酶活性急劇降低。整體而言，鎂離子對漆酶活性的有輕微的促進(jìn)作用，但效果不如銅離子明顯，這與朱顯峰等[24]的研究結(jié)果一致。漆酶活性的整體趨勢也與硫酸銅大體相似，同樣在Mg2+濃度過高時(shí)可能呈現(xiàn)金屬離子對菌體的毒害作用而使漆酶活性降低。因此選擇硫酸鎂的最適添加量為0.20%。

圖5 硫酸鎂添加量對漆酶酶活的影響Fig.5 Effect of magnesium sulfate addition on laccase activity

2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以初始水含量、磷酸二氫鉀以及硫酸銅為影響因素，以漆酶酶活力為評價(jià)指標(biāo)，采用L9（33）正交設(shè)計(jì)，正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析分別見表2和表3。

表2 三七渣固體培養(yǎng)基配方優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for Panax notoginseng residues solid medium formula optimization

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment results

由表2可知，最優(yōu)培養(yǎng)基配方組合為A2B3C1，即磷酸二氫鉀添加量0.15%，初始水含量60%，硫酸銅添加量0.02%。在此優(yōu)化條件下，漆酶酶活可達(dá)8.69 U/g。由表3可知，磷酸二氫鉀添加量對漆酶活性影響顯著（P＜0.05），培養(yǎng)基初始水含量及硫酸銅添加量對漆酶活性影響極顯著（P＜0.01）。

3 結(jié)論

靈芝固態(tài)發(fā)酵三七渣產(chǎn)漆酶為三七渣的資源化利用提供了一條新的途徑。本次研究可以為工業(yè)化利用三七渣固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)漆酶提供培養(yǎng)基組成的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。本次研究結(jié)果表明，優(yōu)化后的三七渣培養(yǎng)基組成為：采用過60目篩的三七渣10 g，酵母浸出粉添加量3%，磷酸二氫鉀添加量0.15%，硫酸銅添加量0.02%，硫酸鎂添加量0.2%，培養(yǎng)基初始水含量60%，pH自然。在此優(yōu)化條件下，靈芝固態(tài)發(fā)酵三七渣產(chǎn)生的漆酶活性可達(dá)8.69 U/g。