藤茶中二氫楊梅素對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)及活性的影響

樊慶濤，孫湘沛，劉 梁，趙 玲，劉華英，陳 新*

（1.武漢輕工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.湖北來(lái)鳳騰升香料化工公司，湖北 恩施 445700）

藤茶（Ampelopsis grossedentata），又稱(chēng)茅巖青霜茶、青霜古藤茶、土家莓茶、龍須茶等，中國(guó)最早的《詩(shī)經(jīng)總集》稱(chēng)為古茶勾藤，是指由藤本植物制作出來(lái)的茶。二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）作為藤茶中主要的黃酮類(lèi)化合物，占藤茶總黃酮的70%以上，近年來(lái)其生理活性受到廣泛關(guān)注[1-4]。既往研究證實(shí)二氫楊梅素具有抗氧化、調(diào)節(jié)血脂、改善腸道菌群豐度[5-7]等多方面活性。此外，二氫楊梅素還具有解除酒精中毒，預(yù)防酒精肝、脂肪肝等作用[8-10]。

乳酸菌是重要的食品釀造微生物及益生菌來(lái)源[11]，同時(shí)它也是人體中胃和小腸內(nèi)的主要益生菌。在許多酸奶及益生菌制劑中常用到混合乳酸菌作為益生元添加在食品中[12-13]。乳酸菌可以通過(guò)釋放乳酸、乙酸和一些對(duì)有害菌起作用的抗菌素，抑制腸道不良微生物的增殖，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，同時(shí)它還兼具抗癌、增強(qiáng)機(jī)體免疫力與抗衰老等作用[14-15]。

將DMY加入到酸奶等乳酸菌發(fā)酵食品中，開(kāi)發(fā)一種既能調(diào)節(jié)血脂、保肝護(hù)肝又可以解酒醒酒的功能性食品。但目前關(guān)于藤茶中的二氫楊梅素對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)及活性的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以藤茶二氫楊梅素為對(duì)象，選取嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaria）、嗜熱乳酸鏈球菌（Streptococcus thermophilus）三種酸奶中常見(jiàn)的乳酸菌，采用流式細(xì)胞術(shù)等方法研究二氫楊梅素對(duì)其生長(zhǎng)及活性的影響，旨在為藤茶酸奶的研究開(kāi)發(fā)提供技術(shù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus，LA）AS1.2686、德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus bulgaricussubsp.bulgaria，LB）CICC6045、嗜熱乳酸鏈球菌（Streptococcus thermophilus，ST）CICC6038：上海保藏生物技術(shù)中心（Shanghai Conservation Biotechnology Center，SHBCC）。

1.1.2 化學(xué)試劑

二氫楊梅素（純度＞98%）：本實(shí)驗(yàn)室從來(lái)鳳藤茶中提取，經(jīng)紅外光譜及核磁共振譜鑒定；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（分析純）：上海翊圣生物科技有限公司；碘化丙啶（propidium iodide，PI）（分析純）：德國(guó)Biofroxx生物試劑公司；甲醇（色譜純）：美國(guó)TEDIA天地試劑公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.1.3 培養(yǎng)基和緩沖液

MRS培養(yǎng)基[16]：10 g/L 蛋白胨，10 g/L 牛肉膏，5 g/L 酵母提取物，2 g/LK2HPO4，2 g/L檸檬酸二銨，5 g/L乙酸鈉，1 mL/L吐溫80，0.58 g/L MgSO4·7H2O，0.25 g/L MnSO4·4H2O，20 g/L葡萄糖，pH 6.3。121 ℃滅菌20 min。

磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）[17]：9 g/L NaCl，795mg/LNa2HPO4·7H2O，144 mg/LKH2P4溶于1 000 mL超純水中，調(diào)節(jié)pH值至7.4。121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

CJ-1F型超凈工作臺(tái)：蘇州市金燕凈化設(shè)備有限公司；TL-205臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司；CytoFLEXS流式細(xì)胞儀：貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)有限公司；Agilent-1260高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國(guó)安捷倫公司；細(xì)菌濾膜（0.22 μm）：上海興亞凈化材料廠(chǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化及種子液制備

將保存于-10～-20 ℃的3種菌種凍干管分別取出，用無(wú)菌吸管吸取適宜的無(wú)菌水，滴入凍干管內(nèi)，充分混勻，使凍干菌體溶解成懸浮狀液體。接種到MRS 培養(yǎng)基中37 ℃靜置培養(yǎng)72 h。將培養(yǎng)液于MRS瓊脂上劃線(xiàn)，挑取單菌落，一份用于MRS斜面劃線(xiàn)，37 ℃培養(yǎng)，有菌落成形后，挑取單菌落轉(zhuǎn)接于裝有100 mL MRS培養(yǎng)基的錐形瓶中，同條件下培養(yǎng)48 h，制成種子液；另一份挑取1～2環(huán)菌落于菌種保藏管內(nèi)，與甘油混合均勻后于-80 ℃冰箱長(zhǎng)期保存[18]。

1.3.2 無(wú)菌二氫楊梅素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取DMY 100 mg，用3 mL DMSO溶解，緩慢加入超純水，待冷卻至室溫時(shí)，于10 mL容量瓶中定容，配制成10 mg/mL的DMY標(biāo)準(zhǔn)溶液。將容量瓶外壁用體積分?jǐn)?shù)75%酒精消毒液擦拭，轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)中，取無(wú)菌注射器吸取溶液，過(guò)0.22 μm細(xì)菌濾膜置于無(wú)菌EP管中備用。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及菌種培養(yǎng)

三種乳酸菌分別單獨(dú)培養(yǎng)，每種培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)設(shè)置1個(gè)空白對(duì)照組（空白對(duì)照組加入同等濃度的DMSO水溶液）及5個(gè)實(shí)驗(yàn)組（D1～D5）見(jiàn)表1，每組3個(gè)平行樣，每組MRS培養(yǎng)基均為50 mL，種子液接種量均為6%。實(shí)驗(yàn)組分別加入100 μL、300 μL、500 μL、1 000 μL、2 000 μL無(wú)菌DMY標(biāo)準(zhǔn)溶液，于37 ℃下厭氧靜置培養(yǎng)48 h。

表1 二氫楊梅素添加量實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案Table 1 Experimental design of dihydromyricetin addition

1.3.4 DMY濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)影響

取培養(yǎng)菌液分別充分搖勻，于超凈工作臺(tái)中取5 mL，在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)量空白對(duì)照組吸光度值（OD600nm值），然后分別測(cè)量各菌液吸光度值（OD600nm值），每個(gè)樣品測(cè)定3次，取平均值。

1.3.5 乳酸菌數(shù)量及活性檢測(cè)

取培養(yǎng)菌液分別充分搖勻，分別以無(wú)菌操作20倍稀釋?zhuān)?00 μL的稀釋菌液，加入10 μL質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的PI染液（PI濃度應(yīng)控制在0.002%的潛在毒性以下），再加入1 mL滅菌PBS緩沖液，后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育15 min后上流式，以30 μL/min的上樣流速分別檢測(cè)乳酸菌顆粒數(shù)及活性[19-23]。

1.3.6 三種菌液中發(fā)酵后DMY測(cè)定

稱(chēng)取DMY標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用無(wú)水乙醇溶解并定容至50 mL容量瓶中，制成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品母液，分別用移液槍吸取1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL標(biāo)準(zhǔn)品母液，用無(wú)水乙醇定容至10 mL容量瓶中，共配成6個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別進(jìn)HPLC儀中檢測(cè)并繪制DMY標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

將空白組和實(shí)驗(yàn)組菌液充分混勻后分別取30 mL，分別加入15 mL無(wú)水乙醇，靜置15 min后，于6 000 r/min、-2 ℃條件下離心15 min，取上清液，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，用HPLC分別進(jìn)行DMY含量測(cè)定。

HPLC條件[24-25]：Agilent C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.03%磷酸，梯度洗脫（0 min，甲醇-0.03%磷酸比例為12∶88；25 min，甲醇-0.03%磷酸比例為65∶35；35～40 min，甲醇-0.03%磷酸比例為12∶88）；檢測(cè)波長(zhǎng)290 nm；流速0.7 mL/min；柱溫35 ℃，進(jìn)樣量5 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同DMY濃度對(duì)三種乳酸菌生長(zhǎng)的影響

不同DMY濃度對(duì)菌株LA、LB、ST生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖1，結(jié)果顯著性分析結(jié)果見(jiàn)表2。由圖1可知，10 mg/mL DMY添加量在1 000 μL以下時(shí)，對(duì)菌株LA和ST的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，而對(duì)于菌株LB 而言，DMY的添加量在500 μL以下時(shí)其促進(jìn)生長(zhǎng)作用不明顯。而當(dāng)DMY添加量＞1 000 μL時(shí)，三種菌生長(zhǎng)均受到抑制。由表2可知，在菌株LA中除D5組與空白組無(wú)顯著性差異外，其余各組均具有顯著性差異（P＜0.05）；在菌株LB中各組均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；在菌株ST中各組均與空白組具有顯著性差異（P＜0.05）。

圖1 不同二氫楊梅素濃度對(duì)三種乳酸菌生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effects of different dihydromyricetin concentration on the growth of three lactic acid bacteria

表2 不同二氫楊梅素濃度的三種乳酸菌OD600nm值顯著性差異分析Table 2 Significant difference analysis of OD600nm value of three kinds of lactic acid bacteria with different dihydromyricetin concentrations

2.2 不同DMY濃度對(duì)三種乳酸菌活性的影響

在流式檢測(cè)中，根據(jù)各細(xì)菌群光散射信號(hào)和PI熒光信號(hào)對(duì)細(xì)胞群落進(jìn)行劃分，選取目標(biāo)群落，數(shù)據(jù)顯著性分析結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，LA實(shí)驗(yàn)組中空白組與D4組無(wú)顯著性差異（P＞0.05），其余各組均存在顯著性差異（P＜0.05）。LB實(shí)驗(yàn)組中D1組與D2組無(wú)顯著性差異（P＞0.05），其余各組均存在顯著性差異（P＜0.05）。ST實(shí)驗(yàn)組中空白組與D1組無(wú)顯著性差異（P＞0.05），其余各組均存在顯著性差異（P＜0.05）。

表3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組死菌占比顯著性差異分析Table 3 Analysis of the significant difference of the proportion of dead bacteria in different experimental groups detected by flow cytometry

通過(guò)對(duì)不同DMY添加量的菌株LA實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行流式分析見(jiàn)圖2。由圖2可知，其中LA-D1組至LA-D3組高熒光強(qiáng)度顆粒從5.55%逐漸減少到3.30%，在LA-D4組至LA-D5組中又逐漸升高至16.03%。通過(guò)與空白組對(duì)照，在D1～D3組實(shí)驗(yàn)中，菌株LA中被熒光標(biāo)記的死菌數(shù)量隨著DMY濃度的增高而降低，在D4～D5組實(shí)驗(yàn)中，菌株LA死菌數(shù)量隨著DMY濃度增高而增高。

圖2 嗜酸乳桿菌在不同二氫楊梅素濃度下的流式熒光直方圖Fig.2 Flow cytometric fluorescence histograms of Lactobacillus acidophilus at different dihydromyricetin concentrations

通過(guò)對(duì)不同DMY添加量的菌株LB實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行流式分析見(jiàn)圖3。由圖3可知，其中LB-D1至LB-D3組高熒光顆粒從54.18%逐漸減少到42.52%，LB-D4至LB-D5中又逐漸升高至75.76%。通過(guò)與空白組對(duì)照，在D1～D3組實(shí)驗(yàn)中，菌株LB中被熒光標(biāo)記的死菌數(shù)量隨著DMY濃度增高而降低，在D4～D5組實(shí)驗(yàn)中，菌株LB活菌數(shù)量隨著DMY濃度增高而增高。與菌株LA相比，菌株LB對(duì)DMY的添加所表現(xiàn)出來(lái)的抑制作用更為敏感。

圖3 德氏乳桿菌保加利亞亞種在不同二氫楊梅素濃度下的流式熒光直方圖Fig.3 Flow cytometric fluorescence histograms of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaria at different dihydromyricetin concentrations

通過(guò)對(duì)不同DMY添加量的菌株ST實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行流式分析見(jiàn)圖4。由圖4可知，其中ST-D1至ST-D3組高熒光顆粒從5.34%逐漸減少到2.83%，ST-D4至ST-D5中又逐漸升高至6.41%。通過(guò)與空白組對(duì)照，在D1～D3組實(shí)驗(yàn)中，菌株ST被熒光標(biāo)記的死菌數(shù)量隨著DMY濃度增高而降低，在D4～D5組實(shí)驗(yàn)中，ST死菌數(shù)量隨著DMY濃度增高而升高。

圖4 嗜熱鏈球菌在不同二氫楊梅素濃度下的流式熒光直方圖Fig.4 Flow cytometric fluorescence histograms of Streptococcus thermophilus at different dihydromyricetin concentrations

通過(guò)分析流式實(shí)驗(yàn)結(jié)果，三種乳酸菌在DMY添加質(zhì)量濃度為在100～1 000 mg/L時(shí)，均表現(xiàn)出了菌液中死菌數(shù)量顯著減少的趨勢(shì)，而當(dāng)DMY質(zhì)量濃度＞1 000 mg/L時(shí)菌液中死菌數(shù)量顯著增加。

2.3 三種乳酸菌發(fā)酵后發(fā)酵液DMY含量測(cè)定

以DMY標(biāo)準(zhǔn)溶液（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制DMY標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，DMY標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程為y=34 036x+20.292，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 7，表明二者線(xiàn)性關(guān)系良好。

三種不同的乳酸菌菌液DMY含量HPLC分析結(jié)果見(jiàn)圖5～圖7。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程計(jì)算DMY含量結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，3菌株菌液中DMY含量未發(fā)生明顯變化，說(shuō)明乳酸菌并未或極少代謝DMY。

圖5 嗜酸乳桿菌發(fā)酵液二氫楊梅素含量測(cè)定高效液相色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of dihydromyricetin contents of Lactobacillus acidophilus fermentation broth by HPLC

圖6 德氏乳桿菌保加利亞亞種菌發(fā)酵液二氫楊梅素含量測(cè)定高效液相色譜圖Fig.6 HPLC chromatogram of dihydromyricetin contents of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus fermentation broth

圖7 嗜熱鏈球菌發(fā)酵液二氫楊梅素含量測(cè)定高效液相色譜圖Fig.7 HPLC chromatogram of dihydromyricetin contents of Streptococcus thermophilus fermentation broth

表4 發(fā)酵前后菌液中二氫楊梅素含量Table 4 Content of dihydromyricetin in the solution before and after fermentation

3 結(jié)論

不同DMY添加量對(duì)三種乳酸菌的生長(zhǎng)和活性均有影響，表現(xiàn)出雙向調(diào)節(jié)的作用。其中DMY添加量在100～1000mg/L時(shí)，LA、ST的生長(zhǎng)和活性促進(jìn)作用呈顯著增長(zhǎng)趨勢(shì)，LB的生長(zhǎng)促進(jìn)作用不顯著，活性促進(jìn)作用顯著。當(dāng)DMY添加量在1 000～2 000 μg/mL時(shí)，三種菌的生長(zhǎng)和活性均被顯著抑制。DMY往往表現(xiàn)為低滲透性和低生物利用度，所以在菌液發(fā)酵前后含量并無(wú)明顯變化。由于DMY擁有較強(qiáng)的抑制有害菌能力，故可以在低濃度時(shí)影響菌液環(huán)境從而增強(qiáng)乳酸菌生長(zhǎng)和活性。所以，在應(yīng)用上述三種乳酸菌發(fā)酵時(shí)可適量添加DMY使其促進(jìn)發(fā)酵，并為發(fā)酵產(chǎn)物添加新的活性成分。