凱里紅酸湯對大鼠腸道脂肪酸吸收和緊密連接蛋白的調(diào)控

曲子晗，王楠蘭，楊紅梅，周倩倩，王惠群，3*

（1.貴州醫(yī)科大學 營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學教研室，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學 環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550004；3.貴州省食品營養(yǎng)與健康工程研究中心，貴州 貴陽 550025）

凱里紅酸湯是源自于貴州黔東南地區(qū)的一種風味食物，經(jīng)自然發(fā)酵而成。研究發(fā)現(xiàn)[1-2]，凱里紅酸湯富含乙酸、乳酸等有機酸和檸檬烯、檸檬醛和亞油酸乙酯等揮發(fā)性成分，還富含辣椒堿、番茄紅素等植物活性成分。有研究認為其富含的有機酸可以用作腸道粘膜上皮的能量底物，對于維持腸道上皮細胞的緊密連接（tight junction，TJ）結構和腸道上皮粘膜的完整性有重要的作用[3-5]。緊密連接是腸上皮細胞間的主要連接方式[6]，其功能的實現(xiàn)受緊密連接相關蛋白Occludin、Zonulaoccludens-1（ZO-1）表達的調(diào)控，高脂血癥發(fā)生和進展過程中患者小腸緊密連接結構破壞[7]，粘膜通透率增大，造成腸粘膜損害，因此值得通過檢測小腸黏膜緊密連接相關蛋白來探討凱里紅酸湯干預對高脂血癥與小腸粘膜上皮緊密連接之間的關系。食物中長鏈脂肪酸（long-chain fatty acid，LCFA）攝入增多是導致血脂代謝異常的一項重要因素，機體攝入的脂肪主要通過小腸以脂肪酸的形式完成吸收，其中LCFA經(jīng)過多種膜轉運蛋白及胞質轉運蛋白共同協(xié)作進入小腸細胞[8-9]，研究顯示，小腸上皮細胞膜蛋白脂肪酸轉位酶（fatty acid translocase，F(xiàn)AT/CD36）和脂肪酸轉運蛋白4（fatty acid transport protein 4，F(xiàn)ATP4）與LCFA吸收密切相關[10-11]，并且在前期實驗中發(fā)現(xiàn)凱里紅酸湯可以抑制血脂和體質量的升高[1]。因此，富含乙酸等有機酸的凱里紅酸湯可能對高脂血癥產(chǎn)生影響，同時恢復被破壞的高脂血癥大鼠小腸緊密連接結構。本實驗通過檢測腸粘膜緊密連接相關蛋白Occludin、ZO-1和調(diào)控長鏈脂肪酸吸收蛋白FATP4和FAT/CD36，研究凱里紅酸湯與脂質代謝之間的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 動物

30只無特定病原體（specificpathogenfree，SPF）級Sprague Dawley（SD）雄性大鼠：由貴州醫(yī)科大學實驗中心提供，8周齡，體質量（180±20）g，許可證號scxk（黔）-2018-0001，飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學動物實驗中心。

1.1.2 試劑與飼料

玉夢牌凱里紅酸湯：貴州明仁食品廠；TB GreenTM Premix EXTaqTM II：寶生物工程大連有限公司；FAT/CD36、FATP4、Occludin、Zo-1引物：貴陽金工科技有限公司；Trizol：美國invitrogen公司；10×聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）buffer、RNasin：美國Promega公司；SYBR Green PCR Master Mix：日本Toyobo公司；二喹啉甲酸（butyleyanoacrylate，BCA）蛋白定量試劑盒：北京索萊寶生物科技有限公司；FAT/CD36、Occludin、ZO-1抗體：美國Affinity Biosciences；FATP4抗體：英國Abcam公司。

基礎飼料（粗蛋白22%，粗脂肪4%，粗纖維5%，粗灰分8%，粗水分10%，無氮浸出物52%，鈣1.24%，磷0.92%，賴氨酸1.34%，蛋氨酸＋胱氨酸0.72%）：貴州醫(yī)科大學動物實驗中心。高脂飼料配方按照1996年衛(wèi)監(jiān)委發(fā)布的《保健品功能學評價程序和檢驗方法》中的比例：78.8%基礎飼料，添加1%的膽固醇、10%的蛋黃粉、10%的豬油以及0.2%的膽鹽。

1.2 儀器與設備

TDL-5000bR臺式高速離心機：上海安亭儀器廠；MyCyclerTMThermal Cycler實時熒光定量聚合酶鏈式反應儀（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）：美國Bio-rad公司；TMReal-Time System（CFX96）、ChemiDocTM Imaging System、Thermal Cycler（100TM）：美國Bio-Rad公司；ABI 9700型GeneAmp PCR儀：美國Thermo Scientific公司；VORTEX-5旋渦振蕩器：中國QILIBEIER公司；Lx-20全自動生化分析儀：美國Beckman Coulter公司。

1.3 方法

1.3.1 高脂血癥大鼠模型建立

體質量為（180±20）g的8周齡SD雄性大鼠30只，隨機分為模型組20 只與陰性組10只，在適應性喂養(yǎng)7 d后，按照《保健品功能學評價程序和檢驗方法》模型組以高脂膳食喂飼SD大鼠90 d復制高脂血癥大鼠模型，陰性組飼喂普通飼料，待大鼠出現(xiàn)總甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）中兩項指標為陽性，即模型組與陰性組相比有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）即判定建模成功。

1.3.2 大鼠分組與干預

高脂血癥大鼠造模判定成功后，將大鼠采用隨機數(shù)字法分為對照組、實驗組，每組10只SD大鼠。經(jīng)過前期前往黔東南凱里進行的基線調(diào)查，了解人的酸湯的攝入量，根據(jù)《實驗動物學》的換算關系確定了本實驗的酸湯灌胃劑量，其中實驗組以4 g/（kg·d）酸湯灌胃，飼喂高脂飼料；對照組以等容蒸餾水灌胃，飼喂高脂飼料。陰性組普通飼料自然喂養(yǎng)，同時等容蒸餾水灌胃，持續(xù)干預11周。由于玉夢牌酸湯在出廠前經(jīng)過熬煮，所以根據(jù)玉夢牌酸湯的使用說明將酸湯稀釋成濃度為40%的灌胃液，按照體質量灌胃。

1.3.3 一般形態(tài)學觀察

干預過程中，每日觀察大鼠的一般形態(tài)學特征，包括活動度、四肢狀態(tài)、精神狀態(tài)和食欲、毛發(fā)情況以及死亡情況。每周稱量大鼠體質量。

1.3.4 標本采集

給與大鼠高脂飼料造模90 d時，自大鼠尾尖采血，以檢測血脂水平。血液樣本采集方法：干預11周時，所有大鼠禁食12 h，稱取體質量；腹腔注射戊巴比妥鈉30 mg/kg，斷尾采集血液1.5 mL，4 000 r/min離心15 min制備血清用于血脂分析。開腹取出回腸組織，-80 ℃凍存，用于脂肪酸吸收和緊密連接相關蛋白的測定。

1.3.5 大鼠TG、TC、LDL-C、HDL-C的測定

與貴州醫(yī)科大學大學城醫(yī)院檢驗室生化科合作，采用全自動生化分析儀Lx-20測定血清TC、TG、LDL-C和HDL-C。

1.3.6 WesternBlot檢測小腸粘膜上皮組織β-actin、FAT/CD36、FATP4、ZO-1和Occludin蛋白相對表達水平

將回腸組織從-80 ℃冰箱取出，取50～100 mg組織加入研磨管，加入液氮后研磨，之后加入1 mL 1∶100的裂解液和苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）混合液。每個樣品進行10 s的超聲破碎。4 ℃、12 000 r/min離心15 min。使用BCA蛋白試濃度測定試劑盒進行蛋白定量，加上樣緩沖液煮沸使蛋白質變性。將產(chǎn)物進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodiumdodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）電泳，濕轉法將蛋白轉印至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF），一抗（1∶300）、二抗（1∶1 000）進行雜交。電化學發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）試劑盒來檢測蛋白，操作步驟按照試劑盒說明進行。凝膠成像分析系統(tǒng)進行圖像采集。通過ImageJ系統(tǒng)測得樣品目標蛋白的灰度值G，蛋白表達量計算公式為：

蛋白表達量=ΔG干預組/ΔG陰性組

其中ΔG=G目標蛋白/G內(nèi)參蛋白，本實驗所選用的內(nèi)參蛋白是甘油醛-3-磷酸脫氫酶；將陰性組結果作為1，ΔG干預組/ΔG陰性組表示干預組相對陰性組的表達量倍數(shù)。

1.3.7 PCR檢測小腸粘膜上皮組織中β-actin、FAT/CD36、FATP4、ZO-1和Occludin mRNA表達水平

將回腸組織從-80 ℃冰箱取出，稱取50～100 mg組織，在勻漿器中加入0.6 mL Trizol，對組織進行勻漿處理，加入Trizol0.4mL，在冰盒靜置15min。4℃、12000r/min離心5min。吸取上清液，每1 mL加入0.2 mL氯仿，混勻后冰盒靜置5 min，低溫離心，4 ℃、12 000 r/min 5 min低溫離心后管內(nèi)液體分為3層：底層沉淀（粉色）、中間層、上層為透明層，吸取150 μL上層透明層的上清液液于EP管中，加入150 μL異丙醇，渦旋器混勻，-20 ℃保存30 min后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min。棄掉上清液，保留底部沉淀。4 ℃、7 500 r/min離心10 min，棄掉上清液。30 min自然晾干，加入RNase-free溶解底部沉淀的核糖核酸（ribonucleic，RNA），無肉眼可見的沉淀，加入10～20 μL RNase-free，酶標儀測定提取的RNA的濃度和純度。

按qPCR試劑盒操作說明書配制反應體系，在qPCR儀以3步法進行PCR，40循環(huán)后采集熒光信號，實驗重復3次。PCR引物由貴陽金工有限公司合成，見表1，采用熒光定量PCR法進行相對定量分析。

表1 PCR引物序列Table 1 Sequence of PCR primers

通過Real-time System測得樣品的Ct值，mRNA相對表達量計算公式如下：

mRNA相對表達量=2-ΔΔCt

其中ΔΔCt=ΔCt干預組-ΔCt陰性組；ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因；將陰性組結果作為1，2-ΔΔCt表示干預組相對陰性組的表達量倍數(shù)。

1.3.8 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用SPSS for Windows 22.0軟件進行錄入、整理和統(tǒng)計分析；計量資料均使用（xˉ±S）來表示，滿足方差齊性和正態(tài)性分布檢驗，多組間計量資料的分析采用單因素方差分析，體質量的分析使用重復測量的單因素方差分析，組間比較采用最小顯著性差異（least significant difference，LSD）法進行檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果與分析

2.1 一般形態(tài)學觀察

實驗期間未出現(xiàn)異常表現(xiàn)和死亡現(xiàn)象，大鼠的精神狀態(tài)穩(wěn)定，攝食和飲水均正常。對照組大鼠行動緩慢，活動量減少，反應遲緩，出現(xiàn)腹部肥胖狀態(tài)，毛發(fā)較陰性組的大鼠稀疏、無光澤，實驗組大鼠較對照組大鼠行動敏捷，反應迅速，無腹部肥胖的狀態(tài)，毛發(fā)恢復光澤，接近陰性組大鼠。

由圖1可知，在干預開始的第0周時，對照組、實驗組間大鼠的體質量之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），陰性組體質量低于對照組（P＜0.05）。酸湯干預2周后，相較于對照組，實驗組體質量出現(xiàn)降低趨勢，但是差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。酸湯干預8周后，實驗組體質量低于對照組（P＜0.05）。在第10周，實驗組相比對照組體質量進一步降低（P＜0.05）。

圖1 凱里紅酸湯對各組大鼠體質量影響Fig.1 Effect of Kaili red sour soup on rats body mass in each group

2.2 凱里紅酸湯對大鼠血脂水平的影響

由表2可知，相較于對照組，實驗組的大鼠TG、TC、LDL-C均顯著降低（P＜0.05），而HDL-C差異不顯著（P＞0.05）。陰性組大鼠的TG、TC、LDL-C也均顯著低于對照組（P＜0.05）。

表2 酸湯干預后的血脂變化Table 2 Changes in blood lipid after acid decoction interventionmmol/L

2.3 小腸上皮ZO-1、Occludin、FATP4、FAT/CD36 mRNA水平

如圖2所示，與陰性組相比較，對照組的FAT/CD36的表達顯著升高（P＜0.05），F(xiàn)ATP4的表達有升高趨勢，但是差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；ZO-1和Occludin mRNA表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與陰性組相比較，實驗組的FATP4和FAT/CD36的表達顯著低于陰性組（P＜0.05）；緊密連接相關基因ZO-1、Occludin也顯著低于陰性組（P＜0.05），但是相較于高脂血癥大鼠已經(jīng)接近正常大鼠水平。相較于對照組，實驗組的FATP4和FAT/CD36 mRNA表達顯著降低（P＜0.05）；ZO-1表達升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖2 凱里紅酸湯對小腸粘膜上皮FAT/CD36、FATP4、Occludin和ZO-1的mRNA表達的影響Fig.2 Effect of Kaili red sour soup on mRNA expression of FAT/CD36,FATP4,Occludin and ZO-1 in small intestinal mucosas epithelium

2.4 小腸上皮ZO-1、Occludin、FATP4、FAT/CD36蛋白表達水平

如圖3所示，與陰性組相比較，對照組腸道上皮FATP4和FAT/CD36蛋白表達顯著升高（P＜0.05），ZO-1和Occludin的蛋白表達顯著降低（P＜0.05）。與對照組相比較，實驗組的腸道上皮中FATP4和FAT/CD36蛋白表達顯著降低（P＜0.05），ZO-1和FAT/CD36蛋白表達顯著升高（P＜0.05）。

圖3 凱里紅酸湯對小腸粘膜上皮FAT/CD36、FATP4、Occludin和ZO-1的蛋白表達的影響Fig.3 Effect of Kaili red sour soup on FAT/CD36,FATP4,Occludin and ZO-1 protein expression in small intestinal mucosas epithelium

2.5 討論

高脂血癥是動脈粥樣硬化等心腦血管疾病和II型糖尿病的危險因素，影響人類的身體健康，進而引發(fā)腦血栓、冠心病等疾病。飲食因素導致的能量過剩對高脂血癥的發(fā)生和發(fā)展有著重要的影響。經(jīng)過90 d的高脂血癥大鼠建模后，本研究發(fā)現(xiàn)喂養(yǎng)高脂飼料的大鼠體質量明顯高于陰性組，又符合能量過剩引起高脂血癥的觀點，與高脂飼料會導致高脂血癥的觀點一致，酸湯干預后大鼠體質量增長受到抑制。

膳食中最主要的脂類是甘油三酯，進入小腸后被膽鹽乳化成微粒，然后在腸內(nèi)的脂肪酶的作用下轉化成為脂肪酸。其中長鏈脂肪酸（LCFA）需要在小腸上皮粘膜細胞的相關脂肪酸轉運蛋白的協(xié)助下才能進入小腸細胞[12]。既往的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AT/CD36和FATP4對LCFA的轉運起重要的作用[13]。LCFA經(jīng)過FATP4和FAT/CD36的協(xié)同作用后，進入細胞膜內(nèi)側，與FABPs結合。在本實驗中，大鼠經(jīng)過高脂飼料喂養(yǎng)后，F(xiàn)AT/CD36和FATP4的mRNA和蛋白表達升高，說明高脂飼料喂養(yǎng)能夠使大鼠小腸上皮的FAT/CD36代償性的表達升高，腸道中的SCFA吸收上升，并導致血脂代謝異常，最終引起高脂血癥。酸湯干預后大鼠的小腸上皮的中FAT/CD36和FATP4 mRNA和蛋白表達下降，提示了酸湯可能通過抑制小腸上皮的FAT/CD36 和FATP4來影響血脂代謝和能量代謝，抑制高脂血癥的發(fā)生和發(fā)展。

小腸上皮細胞的連接方式主要是緊密連接[8]。緊密連接的結構主要是相鄰的小腸上皮細胞細胞膜之間形成索條狀結構，通過緊密連接相關的蛋白使索條密切并列在一起，形成了密切的細胞間隙，是小腸上皮粘膜上皮的結構功能的基礎，阻止大分子物質的通過[14]。Occludin和ZO-1是重要的緊密連接相關基因，緊密連接結構的破壞伴隨著小腸粘膜上皮的通透性升高和小腸粘膜上皮的炎癥反應，BRUN P等[15]研究發(fā)現(xiàn)小腸粘膜緊密連接結構與脂質代謝異常之間的聯(lián)系，腸道革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素會進入血液循環(huán)，與內(nèi)毒素結合蛋白（LPS binding protein，LBP）結合侵襲肝臟，可以影響血脂代謝[16-19]。本實驗結果顯示，經(jīng)過高脂飼料喂養(yǎng)后，Occludin和ZO-1蛋白和mRNA表達下調(diào)，這一結果提示喂養(yǎng)高脂飼料導致高脂血癥的大鼠的緊密連接結構破壞，可能伴隨著炎癥反應和水腫等，與其他研究者的研究結果相符，可能會導致腸道微生態(tài)的破壞[20-21]，影響能量代謝。凱里紅酸湯干預后，大鼠的ZO-1 mRNA、蛋白表達Occludin的蛋白表達明顯升高，說明酸湯干預能夠上調(diào)ZO-1和Occludin的表達，恢復高脂血癥大鼠遭到破壞的小腸上皮緊密連接結構[22-23]。酸湯干預后大鼠的ZO-1和Occludin mRNA表達量低于正常大鼠，說明11周的酸湯干預只是一定程度恢復了被破壞的腸道上皮緊密連接結構，并未恢復到破壞前的水平[24-25]。

3 結論

通過灌胃攝入的方式觀察貴州凱里紅酸湯對高脂血癥大鼠模型的小腸上皮脂肪酸吸收蛋白和緊密連接蛋白的調(diào)控作用。攝入凱里紅酸湯期間測量大鼠的體質量和血脂，攝入11周后測定大鼠小腸上皮的脂肪酸轉位酶CD36（FAT/CD36）、脂肪酸轉運蛋白（FATP4）、緊密連接相關蛋白Occludin和緊密連接跨膜蛋白（ZO-1）的表達。結果表明，凱里紅酸湯可以降低高脂血癥大鼠的體質量，恢復被破壞的腸道黏膜上皮的緊密連接結構，抑制腸道粘膜上皮的LCFA轉運蛋白的表達，具有減肥的功效。