白酒糟纖維素降解菌的分離篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化

寧露佳，劉倩楠，景 雯，楊月輪，李彥芹

（河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002）

酒糟是釀酒產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)的主要副產(chǎn)物，含有蛋白質(zhì)、粗纖維、有機(jī)酸、糖類、氨基酸等豐富的營養(yǎng)物質(zhì)[1-2]。2018年中國白酒產(chǎn)量為871萬kL，每生產(chǎn)1 t的白酒約產(chǎn)生3 t的酒糟，目前我國每年產(chǎn)生的白酒糟總量超過2 500萬t[3]。如此龐大的酒糟不能合理利用將會(huì)是資源浪費(fèi)，也會(huì)污染環(huán)境。許多企業(yè)直接將酒糟作為飼料飼喂動(dòng)物，但酒糟有20%左右的纖維素，含量大，易造成動(dòng)物消化吸收利用率低，而且適口性差。如果可以降低酒糟的纖維素含量，彌補(bǔ)酒糟飼料的缺陷，增強(qiáng)口感，在一定程度上提高酒糟的飼喂價(jià)值，對白酒糟發(fā)酵飼料生產(chǎn)技術(shù)的應(yīng)用和推廣具有重要意義，因此充分利用酒糟中的纖維素成為酒糟資源化利用的關(guān)鍵[5]。

纖維素是一種葡萄糖單元聚合物，由β-1,4糖苷鍵連接而成[6]，自然界中纖維素來源豐富且分布廣泛，是巨大的可再生資源[7]。纖維素酶是能夠分解纖維素的一種復(fù)合酶[8]，自然界中產(chǎn)纖維素酶的微生物種類繁多，主要包括真菌、放線菌、細(xì)菌等[9]。景如賢等[10]在落葉土壤中篩選出一株羧甲基纖維素（carboxymethyl cellulose，CMC）酶活為1.456 U/mL的芽孢桿菌；李樂等[11]在腐爛秸稈中篩選出一株CMC酶活為5.41 U/mL的煙曲霉；劉最等[12]在腐木土壤中篩選出CMC酶活為11.057 U/mL的土曲霉原變種。目前為止，降解纖維素的方法有物理、化學(xué)和生物法。物理、化學(xué)方法處理廢物費(fèi)用高、污染環(huán)境，而生物法具有高效、環(huán)保、專一性強(qiáng)等優(yōu)越性[13]，所以如何利用微生物降解纖維素已經(jīng)成為熱點(diǎn)。將高效菌株應(yīng)用到酒糟中，提高酒糟的利用價(jià)值，不僅能減少環(huán)境污染，還能帶來一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本試驗(yàn)從土壤和糧食型酒糟中篩選出纖維素酶活較高的菌株，為后期制備生物飼料提供一定的理論依據(jù)，加強(qiáng)酒糟的資源利用化，促進(jìn)白酒業(yè)的持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

白酒糟：滄州十里香酒廠糧食型白酒酒糟（將酒糟在50 ℃的烘箱烘干，粉碎過10目篩備用）；土壤：河北大學(xué)松樹下的腐殖土。

1.1.2 試劑

酒石酸鉀鈉（分析純）、剛果紅：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；苯酚（分析純）：福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司；3,5-二硝基水楊酸（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：酒糟10 g、蛋白胨1 g、NaCl 5 g、CaCl20.1 g、KH2PO41 g、（NH4）2SO42 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、濾紙條1 cm×5 cm 5條、蒸餾水1 L，pH自然。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L，pH 7.0～7.2。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 L，pH自然。

高氏一號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g、NaCl0.5 g、KNO31 g、K2HPO4·3H2O 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L，pH自然。

孟加拉紅培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、NaCl 10 g、蒸餾水1 L，pH自然。

液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、蒸餾水1 L，pH 7.0～7.2。

纖維素剛果紅培養(yǎng)基：剛果紅0.4 g、CMC-Na 2 g、（NH4）2SO42 g、K2HPO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g、蒸餾水1 L，pH自然。

濾紙條培養(yǎng)基：酵母膏3 g、（NH4）SO42 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KH2PO41 g、蛋白胨5 g、濾紙條1 cm×5 cm、蒸餾水1 L，pH自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：酒糟10 g、蛋白胨5 g、NaCl 5 g、KH2PO41 g、（NH4）SO42 g、MgSO4·7H2O 0.5 g蒸餾水1 L，pH自然。

所有培養(yǎng)基均在121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；SPX型生化培養(yǎng)箱：寧波江南儀器廠；ZWY-2102搖床：上海智城分析儀器制造有限公司；BJ-2CD超凈工作臺(tái)：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；722E型可見光分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；Gel DocTMXR+紫外凝膠成像系統(tǒng)：美國SIM International Group Co.，Ltd。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 富集與分離

稱取10 g的土樣倒入裝有90 mL無菌水的500 mL錐形瓶中，30 ℃下振蕩30 min，吸取5 mL上清液，加入到富集培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩培養(yǎng)，直到濾紙全部分解，轉(zhuǎn)接新的富集培養(yǎng)基中，重復(fù)3～4次。

吸取1 mL的富集液，用無菌水進(jìn)行梯度稀釋，取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5梯度的稀釋液，分別涂布到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基上，分離出細(xì)菌、放線菌和霉菌，經(jīng)過劃線分離純化得到單菌落，挑取單菌落斜面4 ℃保存。

1.3.2 纖維素降解菌的初篩

（1）剛果紅染色試驗(yàn)

分別挑取各菌株點(diǎn)接到剛果紅培養(yǎng)基上，在30 ℃條件下培養(yǎng)3 d，每組做3個(gè)平行，觀察剛果紅培養(yǎng)基上是否有透明圈，測量透明圈直徑（D）和菌落直徑（d）的大小，根據(jù)直徑比（D/d），初步篩選出纖維素酶活較高的菌株。

（2）濾紙崩解試驗(yàn)

將各菌株接種到濾紙條培養(yǎng)基中，在30 ℃、200 r/min搖床上振蕩培養(yǎng)觀察，根據(jù)濾紙條的腐爛程度和速度，選取纖維素酶活較高的菌株進(jìn)行復(fù)篩。

1.3.3 纖維素降解菌的復(fù)篩

種子液制備：將選出的酶活較高的細(xì)菌接到LB培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)12～24 h至對數(shù)期（OD600nm值=0.4～0.5）備用；霉菌接種到PDA培養(yǎng)基上，30 ℃下倒置培養(yǎng)，待長滿孢子后，用無菌水沖洗孢子，制成孢子數(shù)為1×107個(gè)/mL的孢子懸浮液備用。

粗酶液的制備：種子液按6%（V/V）的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)4 d，將發(fā)酵液4 000 r/min離心10 min，取上清液獲得粗酶液。

酶活的測定：纖維素酶活和濾紙酶活測定采用中華人民共和國輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB 2583—2003《纖維素酶制劑》[14]。

1.3.4 菌株的鑒定

形態(tài)觀察：觀察單菌落在PDA平板上的形態(tài)、形狀、顏色、邊緣等；參考《真菌鑒定手冊》[15]在顯微鏡下觀察菌絲的形態(tài)。

分子生物學(xué)鑒定：提取目的菌株脫氧核糖核酸（de oxyribonucleic acid，DNA）進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，然后將產(chǎn)物送至生物公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果在美國國家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）上進(jìn)行BLAST序列比對，確定目的菌株的進(jìn)化關(guān)系[16]。

1.3.5 發(fā)酵條件優(yōu)化

考察發(fā)酵溫度（10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃）、發(fā)酵時(shí)間（1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d）、初始pH值（2、3、4、5、6、7）、碳源（酒糟、CMC-Na、濾紙、稻殼、葡萄糖、玉米粉）、氮源（蛋白胨、豆餅、麩皮、酵母膏、硝酸鉀、硫酸銨、氯化銨、尿素、牛肉膏）這5個(gè)單因素對菌株產(chǎn)酶的影響。

1.3.6 纖維素酶的最佳反應(yīng)溫度

將菌株在最佳發(fā)酵溫度下培養(yǎng)4 d，離心后所得的粗酶液分別在10 ℃、15 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃的溫度下水浴反應(yīng)30 min，通過比較酶活的高低，確定菌株纖維素酶的最佳反應(yīng)溫度。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株初篩結(jié)果

經(jīng)過剛果紅染色和濾紙崩解試驗(yàn)后，共篩選出8株纖維素酶活較高的菌株，分別命名為M1、M2、M3、M4、M5、X1、X2、F1，其D/d值與紙條崩解情況見表1。由表1可知，水解圈和菌落直徑比值從小到大依次為菌株M2、X2、X1、M3、M5、M1、F1、M4，透明圈最大的為菌株M2，D/d值為7.5。菌株X1崩解最好，菌株X2在培養(yǎng)15 d內(nèi)沒有崩解，其余菌株都有部分崩解。崩解速度越快，說明菌株纖維素酶活越高，表明除菌株X2外，其余菌株均有較高的纖維素酶活。

表1 剛果紅染色結(jié)果及15 d內(nèi)濾紙條崩解情況Table 1 Congo red staining results and disintegration of filter strips within 15 d

2.2 復(fù)篩結(jié)果

復(fù)篩酶活測定結(jié)果見表2。由表2可知，菌株M5的酶活最高，這與剛果紅透明圈和濾紙條崩解結(jié)果不一致，這可能與細(xì)菌和真菌產(chǎn)生的纖維素酶的機(jī)理有關(guān)。細(xì)菌產(chǎn)纖維素酶較少，主要產(chǎn)葡聚糖內(nèi)切酶，大多數(shù)酶對結(jié)晶纖維素?zé)o降解活性；而真菌產(chǎn)酶性能較高，且多為胞外酶[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，透明圈直徑的大小與CMC酶活力沒有明顯的相關(guān)性[18]。綜上所述，確定菌株M5纖維素降解能力最強(qiáng)。

表2 纖維素降解菌株復(fù)篩結(jié)果Table 2 Re-screening results of cellulose-degrading strains

2.3 菌株M5的鑒定

2.3.1 菌株M5的形態(tài)觀察

菌株M5在PDA平板上培養(yǎng)3 d后的菌落形態(tài)見圖1。由圖1可知，菌落起初是白色菌絲，比較疏松，培養(yǎng)2 d后，可鋪滿90 mm的平板，在平板中間開始產(chǎn)生綠色的孢子，并逐漸鋪滿整個(gè)平板。菌株M5的顯微觀察結(jié)果顯示，菌株M5分生孢子無色，球形至卵形；不孕菌絲稀少；分生孢子梗呈二叉或三叉狀分支，有隔膜，垂直生長，主分支呈樹狀，頂枝尖端細(xì)，微彎曲，尖端生分生孢子團(tuán)；初步鑒定為木霉屬（Trichoderma）。

圖1 菌株M5在PDA平板上的菌落形態(tài)（A）及顯微形態(tài)（B）觀察結(jié)果Fig.1 Colony morphology on PDA plate (A) and microscopic observation (B) results of strain M5

2.3.2 菌株M5的分子生物學(xué)鑒定

構(gòu)建菌株M5的系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖2。由圖2再結(jié)合菌株的形態(tài)特征，鑒定菌株M5為木霉屬的棘孢木霉（Trichoderma asperellum）。

圖2 基于ITS基因序列菌株M5的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain M5 based on ITS gene sequences

2.4 菌株M5產(chǎn)酶發(fā)酵條件優(yōu)化

2.4.1 發(fā)酵溫度對菌株M5產(chǎn)酶的影響

發(fā)酵溫度對菌株M5產(chǎn)酶影響見圖3。由圖3可知，隨著溫度的升高，CMC酶活和濾紙酶活逐漸增加，在20 ℃時(shí)達(dá)到最大值，酶活分別為11.50 U/mL和4.61 U/mL，之后隨著溫度的升高，酶活都降低，CMC酶活與濾紙酶活的變化趨勢保持一致。菌株M5在20 ℃條件下有較高的酶活，說明是一株耐低溫菌株。

圖3 發(fā)酵溫度對菌株M5產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on enzyme production of strain M5

2.4.2 發(fā)酵時(shí)間對菌株M5產(chǎn)酶的影響

發(fā)酵時(shí)間對菌株M5產(chǎn)酶的影響見圖4。由圖4可知，在1～5 d內(nèi)，菌株M5的酶活逐步上升，在第5天時(shí)，酶活達(dá)到最高，此時(shí)CMC酶活和濾紙酶活分別為9.35 U/mL和3.92 U/mL，在5 d以后，酶活逐漸下降。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對菌株M5產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of fermentation time on enzyme production of strain M5

2.4.3 初始pH對菌株M5產(chǎn)酶的影響

初始pH對菌株M5產(chǎn)酶的影響見圖5。由圖5可知，CMC酶活隨著初始pH的增加表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，在初始pH3時(shí)達(dá)到最高，酶活為7.94 U/mL；濾紙酶活隨著初始pH的增加表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，在初始pH4時(shí)達(dá)到最高，酶活為3.24 U/mL。而初始pH為3時(shí)，濾紙酶活為3.03 U/mL，酶活僅相差0.21 U/mL，確定最佳初始pH為3。

圖5 初始pH值對菌株M5產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of initial pH value on enzyme production of strain M5

2.4.4 碳源對菌株M5產(chǎn)酶的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，探究10 g/L碳源對菌株M5產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖6。由圖6可知，當(dāng)碳源為酒糟時(shí)，CMC和濾紙酶活均最高，分別為7.33 U/mL和2.62 U/mL，當(dāng)碳源為CMC、濾紙、稻殼、葡萄糖、玉米粉時(shí)，酶活依次降低。所以選擇酒糟作為碳源。

圖6 碳源對菌株M5產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effects of carbon sources on enzyme production of strain M5

2.4.5 氮源對菌株M5產(chǎn)酶的影響

以酒糟為碳源，探究5 g/L氮源對菌株M5產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖7。由圖7可知，氮源為牛肉膏時(shí)酶活最高，CMC酶活為9.17 U/mL，濾紙酶活為3.50 U/mL。所以選擇牛肉膏為氮源。

圖7 氮源對菌株M5產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of nitrogen sources on enzyme production of strain M5

2.5 菌株M5產(chǎn)纖維素酶的最佳反應(yīng)溫度

反應(yīng)溫度對菌株M5產(chǎn)纖維素酶酶活性的影響見圖8。由圖8可知，隨著反應(yīng)溫度的升高，CMC酶活和濾紙酶活出現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在55 ℃時(shí)酶活最高，分別為13.07 U/mL和5.35 U/mL，說明該纖維素酶最佳反應(yīng)溫度為55 ℃。

圖8 溫度對菌株M5產(chǎn)酶穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of temperature on enzyme production of strain M5

3 討論

釀酒主要是把糧食中的淀粉經(jīng)酵母等微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化為醇、脂、酸、酮等物質(zhì)的過程，而其中的粗纖維、脂肪、蛋白質(zhì)等物質(zhì)會(huì)被保留下來[19-20]，所以酒糟的營養(yǎng)成分是十分豐富的，具有廣闊的開發(fā)利用價(jià)值。隨著釀酒產(chǎn)業(yè)的工業(yè)化發(fā)展，酒糟的產(chǎn)量也隨之增加，酒糟作為副產(chǎn)品如果能夠充分的利用，一定會(huì)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益[21]。目前對酒糟的處理主要是用作動(dòng)物飼料，但纖維素含量高，添加量低，如果控制不好量，容易致死[22]。因此，如何提高酒糟的綜合營養(yǎng)價(jià)值，開發(fā)出高效、安全、可利用性高的酒糟是解決問題的關(guān)鍵。

其次，篩選出高效的纖維素降解菌也是制約酒糟資源再利用的關(guān)鍵。前人對纖維素降解菌的研究已有很多的報(bào)道，研究較多的是真菌和部分細(xì)菌[23-24]。陳英連等[25]利用紫外和甲基磺酸乙酯對綠色木霉進(jìn)行交替誘變，成功篩選到了一株產(chǎn)酶活性較高的菌株，經(jīng)培養(yǎng)基條件優(yōu)化后其纖維素酶活和濾紙酶活分別達(dá)到22.5 U/mL和2.52 U/mL；吳靜[26]從腐質(zhì)果屑中篩選出一株青霉屬的菌株，經(jīng)條件優(yōu)化后其濾紙和CMC酶活分別為（3.15±0.12）U/mL和（2.23±0.07）U/mL。本研究從松針腐質(zhì)土中分離篩選到的菌株M5，耐酸耐低溫，在發(fā)酵溫度20 ℃、初始pH 3時(shí)酶活較高，纖維素酶活為9.17 U/mL，能很好的彌補(bǔ)棘孢木霉纖維素降解菌的研究空缺，在白酒糟纖維素降解中擁有廣闊的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)從松針腐殖土壤中分離篩選出一株CMC-Na酶活和濾紙酶活均較高的菌株，經(jīng)形態(tài)觀察及分子生物學(xué)鑒定為棘孢木霉（Trichoderma asperellum），該菌株在發(fā)酵溫度20 ℃、初始pH值為3、酒糟為碳源、牛肉膏為氮源、發(fā)酵5 d的條件下，菌株M5的CMC酶活和濾紙酶活分別為9.17 U/mL和3.50 U/mL；菌株M5所產(chǎn)纖維素酶的最適反應(yīng)溫度為55 ℃。本研究為酒糟的利用提供了重要的理論依據(jù)，緩解飼料短缺問題，同時(shí)減少環(huán)境污染。